抗李斯特细菌植物乳杆菌的抑菌活性物质特性

抗李斯特细菌植物乳杆菌的抑菌活性物质特性 抗李斯特细菌植物乳杆菌的抑菌活性物质 特性 72 .蒙130食品研究与开发第卷第11期民叩叼l.J不蹑科学研究 抗李斯特细菌植物乳杆菌的抑菌活性物质特陛 刘伊,戚薇,巩培,张和平 (1.工业微生物教育部重点实验室,天津科技大学生物工程学院,天津300457;2内蒙古农业大学"乳品生物技术与 工程"教育部重点实验室,内蒙古呼和浩特010018) 摘要:对植物乳酸杆(Lactobacillusplantarum)~生的抑茵物质进行研究.选用琼脂扩散法从5株植物乳酸杆菌中 筛选出1株抑茵活性较高的植物乳酸杆菌菌株ILl.对抑茵物质的理化性质分析结果明:其抑茵活性对温度的变化 不敏感,经过蛋白酶的处理后抑茵活性有所降低.在pH为4.0-5.0时,抑菌活性基本不变,当pH低于4.0或大于5.0时, 抑茵活性均有降低.植物乳杆菌IJfLl产生的抑菌物质对革兰氏阳性和阴性细菌都有抑制作用. 关键词:琼脂扩散法;植物乳酸杆茵;抑茵活性物质 ANTIBACTERIALSUBSTANCEPRODUCEDBYANTI-Lls|IERlALCZLLUSJ7,77H R(,ANDrI1s CHARACTERISITICS ping2 LIUYi,QIWei,GONGPei,ZHANGHe— (1.KeyLaboratoryofIndustrialMicrobiology,MinistryofEducation,CollegeofBiotechnol ogy,TianjinUniversityof Science&Technology,Tianjin300457,China;2.KeyLaboratoryofDairyBiotechnolo gyandEngineering,Ministryof Education,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Hohhot010018,InnerMongolia,China ) Abstract:TheantibacerialsubstancefromLactobacillusplantarumwerestudied.Agardiffusionmethodwas usedtoselecthighyieldingLactobacillusplantarumstrainwhichproductsantibacterialsubstance.Onehigh yieldingLactobacillusplantarumstrainLP一 1wasidentifiedbyagerdiffudionmethodfromfiveLactobaciUus plantarumstrains.Byanalyzingthephysicalandchemicalchatacteristicsofantibacerialsubstances,the followingconclusionscouldbemade.TheantibacerialcharacteristicofI一 1wasresistanttotemperatureand decreasedtoproteolyticenzymes.LoweractivitycouldbedetectedatlowerpHvalues(pH<4.0)orhigherpH values(pH>5.0).WhenpHreached4.0-5.0,itsinhibitoryactivitykeptinvariant.Theantibacerialsubstance producedbyLactobacillusplantarumshoweditsinhibitonagainstGram-positiveandnegativebacterias. Keywords:agardiffusionmethod;Lactobacillusplantarum;antibacerialsubstance 当今,由李斯特细菌引起的食物中毒事件已经越 来越引起人们的关注,食品安全成为日益重要的公共 卫生问,由微生物污染引起的食源性疾病越来越受 到关注.单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)是人畜 共病李斯特菌病的病原菌,由食品传播的李斯特菌病 在人群和动物中爆发流行,该菌被列为食品中四大病 原菌之一.单增李斯特菌感染家畜后可引起脑膜炎, 脑炎以及自发性流产等,可暴发流行,临床病死率高 达20%,70%【. 乳酸菌作为天然防腐剂已被广泛应用于食品的 作者简介:刘伊(198l一),女(汉),硕士研究生,研究方向:功能性生 物及益生素. 发酵与防腐中.许多乳酸菌除产生乳酸,乙酸和过氧 化氢外,还可产生一些具有抑菌生物活性的小分子量 代谢产物,如脂肪酸;细菌素,在食品的防腐保鲜方面 起着重要作用.随着人们生活水平的提高,食品防 腐剂的安全卫生条件日益受到人们关注,消费者对添 加化学防腐剂的食品心存顾忌.此外,化学防腐剂潜 在的安全隐患不容忽视,寻找一种新的代用品以减少 化学防腐剂所造成的潜在危害已为各国科研工作者 所瞩目. 对能够产生抑菌物质的植物乳杆菌进行筛选,并 对抑菌物质的抑菌谱,性质等进行初步研究,为一种 新的安全,高效的天然防腐剂的开发奠定基础. 科学研究食品研究与开发2009年11月第30卷第11期 1与方法 1.1材料 供试菌:植物乳杆菌LP一1,LP一2:天津科技大学 微生物教研室提供;植物乳杆菌BX6—1,WZ25—2—2, YN3-1—2—1—2:内蒙古农业大学"乳品技术与工程"教 育部重点实验室提供. 指示菌:英诺克李斯特菌(Listeriainnocua):中国 工业微生物菌种保藏中心;大肠杆菌(Escherichic~ coli),OJ寒沙门氏菌(SahnoneUasp.),金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus帆re):天津科技大学微生物教研室 提供. 培养基:MRS培养基(分固,液两种),脑心浸液培 养基(分固,液两种),LB固体培养基. 1.2仪器与设备 TD5A—WS低速台式离心机:长沙湘仪离心机仪 器有限公司;PHS一3CW微机型酸度计:上海理达仪器 厂;YXQ—LS一505立式压力灭菌锅:上海博讯实业有限 公司. 1.3方法 1.3.1琼脂扩散法 将5株植物乳杆菌,分别为LP一1,LP一2,BX6—1, WZ25—2—2,YN3—1—2—1—2,在MRS斜面上活化2代 后,转接人MRS液体培养基中,37?厌氧培养48h, 3000r/rain离心5min,取发酵上清液,经细菌过滤器 过滤(滤膜孔径为0.22tzm),收集滤液即为发酵上清 液,放冰箱备用. 将英诺克李斯特菌的菌液(菌数为10,cfu/mL) 1mL与15mL脑心浸液固体培养基(45cI=水浴保温) 混匀倒人平板后待凝,倒置于恒温培养箱中(未加入英 诺克李斯特菌液的平皿做空白对照),37?恒温培养 2h.取出平板,用无菌镊子夹取已灭菌的牛津杯 数个,按顺序在平板表面摆放整齐,用无菌吸管吸取 100IxL植物乳酸杆菌的发酵上清液到牛津杯中,放于 恒温培养箱中37?再培养16h,取出观察并测定抑菌 圈直径(mm),并计算抑菌物质效价. 抑菌物质效价(Ru/mL):(—Y)xlO00/V式(1.1) 式中:为抑菌圈直径,mm;Y为牛津杯直径, mm;V为样品加人量,L. 1_3-2乳酸的影响 (pH= 用乳酸调无菌水pH与待测发酵液pH相同 4.5),按1_3.1方法分别测定乳酸水与植物乳杆菌发酵 液的抑菌活性. 1.3.3pH稳定性 用1mol/L的HC1,NaOH分别将发酵上清液pH 73 调为3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,进行抑菌试验;以未调 pH的发酵上清液(pH=4.5)为对照,观察pH对乳酸菌 发酵液的抑菌效果. 1.3.4蛋白酶敏感性试验 用NaOH溶液(1mol/L)调节10mL乳酸菌发酵 液的pH为7.0,再分别加入1mL用磷酸缓冲液 (0.1mol/L,pH7.4)稀释过的蛋白酶K(10g/L),中性蛋 白酶和胰蛋白酶(1g/L),37?保温处理2h后,沸水浴 处理5min使酶灭活,用HC1溶液(1mol/L)将pH调回 至4.5,进行抑菌试验;同时用未被酶处理的植物乳酸 杆菌发酵上清液做对照. 1.3.5热稳定性 将乳酸菌发酵液分别用70,100,12Ioc处理30min 以及4?冰箱中放置一周后,进行抑菌试验;以室温下 (23?)未进行热处理的植物乳酸杆菌发酵液为对照, 检测抑菌物质的抑菌活性. 1.3.6抑菌物质的抑菌谱 分别将4株供试菌按照1.3.1试验方法制成检测 平板,大肠杆菌,伤寒沙门氏菌,金黄色葡萄球菌选用 LB固体培养基制成检测平板,英诺克李斯菌选用脑心 浸液固体培养基制成检测平板,向牛津杯内加入100L 植物乳酸杆菌发酵上清液,于各供试菌最适生长条件 下培养不同时间,测量检测平板上抑菌圈的直径,计算 抑菌物质效价. 2结果与讨论 2.1抑菌物质活性的检测方法 试验结果表明,5株植物乳酸杆菌中只有1株产 生的抑菌活性最强,并且抑菌圈效果最明显,对英诺克 李斯特菌的抗菌效果最显着,为LP一1.其结果如表1 所示. 表1植物乳酸杆菌菌株的抑菌活性 Table1AntibacterialactivityofLactobacillusplantarumstr~ns 2.2乳酸的影响 试验发现乳酸调的无菌水溶液无抑菌效果,而植 物乳杆菌发酵液在此条件下有透明抑菌圈,有抑菌能 力,从而排除单是乳酸产生抑菌效果的可能性,I~P-VL 酸不是抑菌作用产生的原因.其结果如表2所示. 2.3pH稳定性 该抑菌物质pH为4.0,5.0,抑菌活性较稳定;随 74 ..1 130食品研究与开发第卷第1期民叩珂I.J不蹑科学研究 表2乳酸对LP一1抑菌活性的影响 Tabk2EffectoflacticacidonantibacterialactivityofLP-1 注:"一"为无抑菌性. 着pH降至3.0,没有抑菌活性;当pH升高至5.0,抑菌 活性降低了8%;当pH继续升高至7.0,抑菌活性降低 了20%;当pH升高至8-0,没有抑菌潘I生.其结果如表3 所示. 表3pH对LP一1抑菌活性的影响 Table3EffectofpHOilantibacterialactivity0fLP-1 :竺:兰:::!::Q 抑菌活性,(Ru,mL)一8O8O736363一 Antibacterialactivity/(RU/mL) 注:"一"为无抑菌性. 2.4蛋白酶敏感性试验 与未加酶的植物乳酸杆菌发酵液对照相比,经过 胰蛋白酶和中性蛋白酶处理过的发酵液的抑菌活性几 乎不变,但经过蛋白酶K的处理后的发酵液抑菌活性 有所降低.说明抑菌物质中含有蛋白质类的物质,经过 酶的处理后,蛋白会被降解,但抑菌活性还存在,说明 其中另外还有非蛋白类物质存在.其结果如表4所示. 表4蛋白酶对LP一1抑茵活性的影响 Table4EffectofproteolyticenzymesODantibacterialactivityof LP__l 酶 Enzyme 抑菌活性/(RU/mL) Antibacterialactivity/(RU/mL) 胰蛋白酶Trypsinase 中性蛋白酶Neutralprotease 蛋白酶PmteinaseK 对照Control 75 73 6O 80 2.5热稳定性 与室温(23?)下植物乳酸杆菌发酵液的抑菌活性 相比,70?处理30min后的发酵液的抑菌活性略有降 低,说明发酵液中抑菌物质的潘I生并没有被影响;100oC 和121?处理30rain后,抗菌效果稍有下降;在4?冰 箱内放置一周后,抑菌活性依然存在,长时间的低温保 藏不会破坏抑菌物质的活性.其结果如表5所示. 2.6抑菌物质的抑菌谱 植物乳酸杆菌LP一1产生的抑菌物质对革兰氏阳 性腐败菌和病原菌(如金黄色葡萄球菌,英诺克李斯 特菌)有抑制作用,而且对革兰氏阴性腐败菌和病原 菌(如大肠杆菌,伤寒沙门氏菌)有抑制作用,该抑菌物 表5温度对LP一1抑菌活性的影晌 Table5EffectoftemperatureonantibacterialactivityofLP-l 温度,qC时间/min抑菌活性/(RU/mL) Temperature/~CTimeprocessing/minAntibacterial activity/(RU/mL) 注:"一"为无抑菌性. 质具有广谱的抑菌效果.其结果如表6所示. 表6LP一1的抑菌谱 Table6TheinhibitorvspectrumofLP—l 供试菌株 Teststrain 抑菌活性,(RU^nL) Antibacterialactivity/(RU/mL) 大肠杆菌Escherichia.coli 伤寒沙门氏菌Salmonellasp 金黄色葡萄球菌Staphylococcusfllzreus 英诺克李斯菌Listeriainnocua 82 70 82 80 3结论 通过琼脂扩散法从5株植物乳酸杆菌中筛选出 一 株具有较强抑菌活性的菌株LP一1.离心过滤后的植 物乳酸杆菌发酵液经不同温度,pH和蛋白酶活性的检 测,试验结果表明,该抑菌活性物质pH在4,7范围内 均有抑菌活性,在pH4,5范围内稳定性较好,该物质 对温度不敏感,经过蛋白酶的处理后抑菌活性有所降 低.通过抑菌谱的测定,发现该抑菌活性物质对革兰 氏阳性和阴性细菌都有抑制作用. 参考文献: …1程沽,张晓峰.单增李斯特菌选择性增菌培养和分离方法的比较 研究『J].检验检疫科学,2003,13(6):36—38 [2】周丽萍,巢国祥.生肉制品中沙门菌,单核细胞增生李斯特菌及 金黄色葡萄球菌流行特征研究『J1.中国卫生检验杂志,2007,17 (3):505—507 【3】朱献忠.单核细胞增生性李斯特菌研究进展[J】.中国卫生检验杂 志,2007,17(7):1333—1335 [4】雷虹,李秀凉.副干酪乳杆菌HD1.7产生抗菌的初步研究fJ】.工 业微生物,2007,37(4):16一l9 【5】侯婷,赵征,江浩东.瑞士乳杆菌TUST一005发酵乳抗菌特性研 究【J].食品研究与开发,2006,27(8):31—34 【6]刘冬梅,李理,梁世中.鼠李糖乳杆菌产生抑菌物质的抑菌作用 和特性研究【Jj_中国乳品工业,2006,34(1):13一l6 收稿日期:2009-07—12