高效液相色谱仪LC3000培训教程

高效液相色谱仪LC3000教程 LC3000现场培训教程 ——基础部分 一、 培训目的 A、了解LC3000高效液相色谱仪结构和基本操作。 B、掌握CXTH-3000色谱工作站的打开、设备连接、数据采集、数据处理，打印。 C、常见故障排除 二、 培训设备 CXTH LC3000色谱仪 P3000高压输液泵 UV3000紫外检测器 7725i手动进样阀 T2000柱温箱(可选) C18色谱柱 250×4.6 5u (可选) 其它色谱基本条件(流动相准备、电脑和实验台等) 三、 溶剂准备 1、条件:色谱级纯或者优级纯甲醇或者乙腈(ACN)、二次蒸馏水 、流动相的过滤和超声 2 3、样品的前处理和过滤 四、 LC3000色谱仪组成 1、 P3000泵和UV3000检测器 一元(等度)系统 两元(梯度)系统 1 P3000泵界面和基本操作 高压输液泵 泵头 压力传感器+排空 泵壳体结构图 2 泵头以及传动结构图 单向阀 单向阀内部结构 基本操作:泵的基本操作可以通过CXTH-3000工作站(推荐使用)或者泵仪 器面板控制。 工作站的控制在下面色谱工作站基本控制内容中讲到，以下是泵面板的基本控 制按钮: 3 PUMP/STOP 键:按一下该按键可以运行泵，再按一下停止泵运行。 START/HOLD键:按一下该键运行预先设定的程序链(PROGRAM)。再按一 下保持此时的程序运行。 PURGE键:冲洗键。按一次泵按照(SYSTEM SETING)系统设定中设定冲 洗流量运行冲洗。再按一次泵停止冲洗。作用:冲洗泵头气泡和快速更换流动 相。 DEL键:退出键或者删除键。进入子菜单下通过此键退回上一菜单。 ENTER键:进入键或者确认键。按该键进入子菜单。 方向键:光标的上下左右移动。 2、UV3000检测器 UV3000紫外检测器 流通池 基本操作:检测器基本操作可以通过CXTH-3000工作站(推荐使用)或者检 测器仪器面板控制。 波长的设定:按下 λ 按键 进入波长设定界面，通过数字键设定预设波长 TIME CONSTANT(时间常数):在MAIN MENU主菜单下，按ENTER键进 入第一项DETECTOR PARAMETERS，将光标移动到TIME CONTANT下修 改合适的TC值。 RANGE(量程)设定:按下 RANGE 按键，进入量程设定界面，通过数字键 设定波长。 检测器:流通池中有气泡的处理办法，流通池脏处理办法(见常见故 障维护)。 4 3、7725i进样阀 7725i是6通道阀。阀的背面有数字标号: 2号口为流动相进口(泵连接到阀)，3号口为流动相出口(阀连接到色谱柱) 1号口和4号口为定量环接口(默认连接的为20微升，可以更换) 5口和6口为废液口。 进样口为阀前端口(实际上7725i有7口) 以上俗称:2进3出、1、4定量，5、6废液。 基本操作: 进样阀前端有LOAD(装样)和INJECT(进样)两个标示。 当阀的把手在LOAD的状态下时，此时处于装样的状态，当样品注入后将阀扳 到INJECT状态，进样过程完成。 进样注意事项: A、缓慢进样、快速扳阀。阀不要处于中间位置。 B、如果使用缓冲盐、当天使用后要使用含5%有机相的水溶液清洗进样阀。 5 4、色谱柱 色谱柱标示: 如:Kromasil 250×4.6 5u 100A分别代表填料名称 柱长 内径 填料大小 填料比表 面积 色谱柱基本常识: A、 其他条件相同，柱子越长，保留时间越长。 B、 其他条件相同，柱内径越小，柱压越高。 C、 其他条件相同，柱填料颗粒越小，柱压越高。 D、 不同品牌的色谱柱将有不同的特性，如保留时间、柱效等。 E、 同等流速下，不同流动相的柱压将不同。包括流动相组分配比的变化也会导致压力 变化。原因是:流动相组分的比例变化导致流动相粘度的变化，从而导致压力的变 化。 基本安装注意事项: A、 避免死体积、漏液或损坏柱子 使用正确的接头 尽可能缩短连接管路长度、降低柱外效应 管路切口必须平整 在接上色谱柱前先将管路中的气泡赶净 B、 色谱柱安装的方向性 接头不可拧太紧 打开输液泵、检查柱是否漏 按照色谱柱上箭头指示的方向为流动相经过的方向 五、LC3000系统基本操作 1、 打开计算机。 2、 打开LC3000各部分(P3000泵、UV3000检测器等)电源。 3、 待检测器和泵自检完成后，双击打开CXTH-3000(中文版)工作站软件图标。 4、 将入液管放入到过滤超声好的流动相中。 5、 拧开排空阀，将泵冲洗流量设定5ml/min。点击泵面板上PURGE键。此时泵开始 运行冲洗功能。直到管线内(由溶剂瓶到泵入口)无气泡为止。再按PURGE键或 者PUMP/STOP键停止冲洗。 6、 关闭排空阀，设置工作站上控制面板中时间程序。 7、 点击工作站上采集基线图标，观察基线稳定情况。 8、 点击停止采集，进样扳阀，触发工作站采集谱图。 9、 保存谱图到指定位置。 6 10、 谱图处理和谱图校正。 11、 打印报告。 12、 实验结束前，用纯甲醇或者其他纯有机相清洗系统。 13、 关闭工作站和仪器电源。 六、 色谱工作站基本操作步骤(工作站打开、工作站和色谱仪的连接和控制) 1、 仪器的控制和方法的建立 当设备打开后，双击图标打开CXTH-3000色谱工作站。我们 能看到谱图采集窗口和仪器控制面板，仪器控制面板主要包括四个界面:仪器配置;基 本控制;时间程序;波长扫描。 当您把这四个界面弄清楚以后就能够非常方便的通过它来对您的仪器进行远程控制和 方法的建立,实现您实验室的自动化操作。 A、 仪器配置:对所使用的仪器与计算机进行通讯连接。 在控制面板点击，进入仪器配置界面 在此界面中选择我们所使用的检测器、泵的型号以及该仪器与计算机连接的串口编号。 ，选择我们所使用的仪器型号。 点击型号选择框中右断的下拉选择按钮 点击通讯端口选择框中右断的下拉选择按钮，选择仪器在计算机上的连接串口编号。 B、 基本控制:对所使用的仪器进行一些基本的操作，当然也是检验我们前面进行 的仪器配置是否正确的必须手段。 在控制面板点击按钮，进入仪器配置界面 7 在此界面中我们可以分别对检测器以及高压输液泵进行基本的控制 检测器的控制: 波长:输入我们检测所需要的波长，例如254nm。点击，就可以发送命令到检测 器终端了。此时检测器应该处于第五个菜单下，如此则说明检测器的通讯是畅通 的，前面进行的检测器配置是正确的。 时间常数:点击时间常数选择框右端的，选择所使用的时间常数，一般情况下使用 默认的2S。 量程切换:点击量程切换选择框右端的，选择所使用的量程，一般情况下使用默认 的2AU/2000mV 开灯/关灯:，，是一个切换按钮，控制检测器的灯的开/关。 调零:点击此按纽可以进行检测器的吸收值归零。 泵的控制:分别对泵A、泵B、泵C、泵D进行基本控制 流速(ml/min):直接输入所使用的流速，然后按下右边的，则泵应该进入 运行状态，如此则说明前面进行的泵的配置是正确的。 按下，则泵停止运行。 右边的，用于泵在运行状态在线修改流速。 最小压力(MPa):设定最小压力保护，直接输入即可。 最大压力(MPa):设定最大压力保护，直接输入即可。 压力曲线:可以选择是否在工作界面显示泵的压力曲线。 C、 时间程序:在仪器的基本配置完成以后，您的仪器就可以进入工作状态了，这 个时候您需要对仪器将要完成的动作进行一个设定。 概括起来就是:在什么时间以什么流速，泵分别以什么比例，检测器以什么波长来运行。 8 如上图所示，一个时间程序包括时间、流速、A(B/C/D)泵的比例、波长、是否归零、量程。那么我们按照我们的方法设计进行编辑就可以了。 当我们使用时间程序表中的描述来运行系统，我们需要选择左边的。如果使用基本控制中的参数，则不需要选定此选项。 工作站运行时间是从我们打开工作站的时候开始的，所以我们在设定时时间不宜过短，应大于我们的做样时间。当系统运行超出总运行时间时，系统将停泵，检测器氘灯将自动关闭。 当我们需要重新编写一个时间程序的时候，点击，就可以完成表格内容的清空，便于新的时间程序的编写。 在运行工作站以后，停止执行时间程序是不能使泵停止运行的，泵会执行时间程序表中第一行的描述，如果需要停止泵的运行，请点击。 我们编辑完一个时间程序以后，点击，可以查看我们设定的梯度曲线。 9 在有注样泵的时候，可以编辑注样程序，点击，进入注样程序编辑菜单 在此菜单中编辑注样程序:注样时间;注样流速;注样程序执行的时间。编辑完成以后点击 即可。 在进行了时间程序的编辑以后，整个系统的设置与运行作为一个完整方法文件就能够正式的确定下来了，我们需要把这些设定保存起来，便于以后调用。 点击，进入，选择另存设置将我们编辑的整个方法保存起来。 当我们再次打开工作站的时候，可以选择引进设置，同时调用以前的方法文件。 D、 波长扫描:对于UV3000型检测器，可以进行波长扫描操作 在此菜单中，设定扫描的起始波长、结束波长、扫描速度。然后点击。 2、 谱图采集 当我们对仪器配置好后，接下来便可以通过点击工作站上采集基线(浅绿色图标)对仪 器进行平衡操作。 当仪器基线趋于稳定后，通过点击停止采集(红色图标)，停止采集基线。 通过点击采集谱图(深绿色图标) 可以实现谱图的采集功能。 10 注意:通常情况下，用户是通过扳动进样阀触发工作站的自动谱图采集。而不是通过点击采集谱图图标。 3、 谱图保存 当采集时间达到预设时间或者中途点击手动停止图标(红色图标)。工作站将弹出对话框提示谱图是否保存和保存的路径。 4、 谱图观察 在谱图参数中，有谱图显示参数“满屏时间”“满屏量程”分别代表的是谱图观察窗口的横坐标和纵坐标。单位分别是分钟和毫伏。可以通过键，增加或着减少观察窗口的大小，同时也可以通过点击“满屏”让软件自动设置窗口的大小。 在谱图观察窗口中，可以通过按住左键拖动鼠标来观察选中部分的谱图细节。此时局部谱图将放大，双击鼠标左键谱图将还原。 七、 数据采集方法编辑 工作站软件对采集完的谱图会进行默认的谱图处理方案。如果我们需要对谱图重新进行处理，步骤如下: ,、 打开目标谱图 11 ,、 在谱图采集窗口上方，如下图，点击谱图参数，修改谱图基本处理参数。 3、在谱图窗口下，在需要处理的谱图峰位置前右键，选择自动生成“谱图处理”表项。 如下图，在展开的选项中，我们将看到一些谱图的处理方案。此时可以根据不同要求修改。所有谱图处理操作将会自动的存入谱图处理表格中。 4、当谱图处理操作结束后，需要点击工作站上“在处理”(黄色图标)，此时工作站将根据修改后的谱图重新计算峰面积等相关数据并在定量结果中体现。 5、如果需要将此次的谱图处理操作以及后面我们将要讲到的定量组分表在下一次谱图处理时继续使用，可以通过点击“文件”“存为模板”。当下次需要使用时，通过“引进模板”调用。 12 注意:谱图处理更详细的说明请见工作站操作第8页。 八、 数据分析方法编辑(谱图处理和方法校正) ,、 当谱图处理完成后，接下来需要对我们需要的组分进行选定(套峰)、命 名、填写浓度等操作。将鼠标移动到目标峰时间范围内后右键选择如下图所示的套 峰时间，此时的套峰和命名将在定量组份表中体现。 13 ,、 定量方法 A、归一化法操作步骤:采集并处理待测样品的谱图数据，在定量方法表中选择“归一” 选择“操作”菜单中的“定量计算”命令，程序随即将计算结果填入“定量结果表”中。 B、校正归一法操作步骤:和归一化法类似，不同点在于，需要对目标峰设定校正因子后再点击定量计算。 C、单点校正操作步骤:当选取的标准品谱图完成以上谱图校正1中的步骤后。在定量方法中选择 再点击定量计算图标。此时标准品谱图校正因子就计算出来了。然后点击定量组分中按钮后，打开需要处理的样品谱图，点击定量方法选择单点校正 最后通过点击联合计算图标，便可以得到样品谱图的组分浓度。 D、多点校正(基于工作曲线)操作步骤: 多点校正类似于单点校正的操作。 首先对多个标准样品谱图分别计算校正因子(和单点校正一样)。计算出校正因子后， 14 点击图标，将标准品谱图文件临时存档。点击后软件弹出 对话框 同样，其他标准谱图重复以上操作。将其他谱图都一一存档。 处理完最后一个标准品谱图后选择在 中点击“计算”按钮，软件弹出。 (以上是以3个组分为例) 然后选择组份序号，点击“显示”按钮，便可以得到相应组份的工作曲线。 得到工作曲线后，标准品谱图的处理工作结束，此时便可以对采集的样品谱图进行校正并计算组份浓度。 15 同样需要对样品谱图进行套峰和组份的命名。完成后，点击定量方法，选择多点校正 最后点击联合计算图标。此时多点校正的过程便完成了。 九、打印报告 在分析报告中，可以填写报告头和报告尾。 点击图标按钮，谱图文件和定量结果以及设定好的报告头和报告尾将出现在打印报告中。 点击选线图标，将弹出如下对话框。 通过修改打印选项参数的修改达到您需要的相关内容和格式。 16 17 HPLC维护知识 问题和解答: 1、 为什么溶剂和样品要过滤, 溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结 果的影响。 色谱柱:由于填料颗粒很细，筛板孔径和色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会 使色谱柱和毛细管容易堵塞。 仪器:溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝 宝石活塞杆和活塞的磨损。 2、 为什么HPLC在使用缓冲盐时要使用柱塞后冲洗, HPLC用缓冲盐时，由于泵头内的缓冲盐溶液存在高压盐析现象，析出的细小盐粒非常 坚硬，它附着在蓝宝石活塞杆上，随着蓝宝石活塞杆的往复运动，容易产生划痕，并磨 损密封垫，造成漏液等故障现象。使用有效的柱塞后冲洗能有效的带走可能存在的缓冲 盐结晶。缓冲盐的浓度在0.1mol或者大于0.1mol时，必须使用柱塞后冲洗。 清洗液配制: 90%水+10%异丙醇，该混合液可以抑制菌类生长和减小水的表面张力，以2到3滴/分 钟的流速虹吸留下即可。 3、 为什么流动相在使用前需要进行脱气处理, 流动相在使用前必须进行脱气处理，以除去其中溶解的气体(如氧气)，以防止在洗脱 过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪 音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱 中固定相发生降解而改变柱的分离性能，若用FID，可能会造成荧光淬灭。 常用的脱气方法比较: 氦气脱气法:利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦气脱气，效果较好，但成本 高。 加热回流法:效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。 抽真空脱气法:易抽走有机相。 超声脱气法:流动相放在超声波容器中，用超声波振荡10到15分钟，此效果最差。 在线真空脱气法:在线脱气，智能控制，无需额外操作，成本低，使用于多元溶剂混合 系统。 4、 手动进样阀需做哪些维护，使用时需要注意什么, 对于手动进样器，当使用缓冲溶液后，或者进浓度差异大的样品时，要用专用工具而不 是用带针头的注射器冲洗进样口，同时扳动进样阀数次，每次数毫升。 18 注意事项: E、 安装时流通阀的5口和6口要与注射器在同一水平线上，以防止虹吸现象的发 生，导致进样量的重复性变异。 F、 进样量的多少要根据定量管(LOOP)体积决定。 当样品量少时:进样体积由注射器的进样体积决定，但最大进样体积要小于1/2 LOOP体积。 当样品量较多时:进样体积由定量管的体积决定，为保证样品完全把定量管的流动 相置换干净，需注射大于2.5倍定量环的体积。 G、 要使用专用的液相进样针进样，绝对不能使用气相进样针。 5、 检测器流通池需要怎样维护，故障表现在什么方面, 当检测器采集基线为有规律的三角峰、或者毛刺峰时，很有可能是检测器中流通池存在 气泡。可以通过增加适当的反压排除气泡，或者将流通池拆下用洗耳球将气泡吹出。 当系统在平衡一段时间后，仍然出现基线漂移大的情况下，也有可能是流通脏导致检测 器样品能量值下降(常说的R值)，此时我们需要采用30%的稀硝酸清洗流通池。然后 用含有5%有机相的清水冲洗，知道干净为止(一般通过观察基线稳定为止)。 6、 用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移，有时发生快速变化，原因何在?如何解决? 1、温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定 2、流动相发生变化，解 决办法是防止流动 相发生蒸发、反应等3、柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平 衡 7、 液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么? 1、筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。 2、存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子 8、 除了流速外，还有哪些因素能引起压力改变, 改变流动相组成和温度; 改变柱长、柱内径和填料粒度; 柱突然阻塞压力升高(正常情况下其它条件不变柱压都是逐渐升高的)。 9、 怎样才会使峰位发生重排, 在分析多组分样品时，仅改变流动相的强度(组成百分比)而不改变其组成，一般仅仅改变所有组分的保留时间，不会发生峰位的重排。下列条件改变可能发生峰位重排: 流动相中换了强溶剂; PH 值的改变; 柱填料的改变; 柱温的改变; 流动相的组成改变(如加入离子对试剂三乙基胺等)。 10、 系统会对峰宽产生哪些影响, 过样体积、连接管路、各个接头和检测器体积。 11、 如何评价一个色谱柱的优劣, 评介一根色谱柱的主要指标是:塔板数、峰不对称因子、柱压降和键合相浓度。 12、 如何选择HPLC系统的液路管线, PEEK(聚醚醚酮)管 优势: 1.具有化学溶剂惰性、生物兼容性等特点，可替代不锈钢管用于常规液相分析中和离 子色谱、生物色谱中。 2.和不锈钢不同，PEEK 具有韧性，截取方便，能使用不锈钢和聚合物等接头。 19 3. PEEK 管还可以耐高压(可达4000psi)和耐高温(100?)。 4.PEEK 管有很强的溶剂兼容性，大部分溶剂不会与聚合物发生反应。 缺陷: 二甲基亚砜、二氯甲烷及四氢呋喃能引起PEEK 管轻微溶涨，长时间使用管线变脆破 裂，另外浓硝酸和浓硫酸会导致PEEK 降解。 不锈钢管 优势: 不锈钢管具有广泛的化学稳定性和耐高压(10000psi)的特点，因此是液相系统中使用 最广泛的管线之一。但由于硬度较大，截取不方便，因此非常适合用在液相系统中不需 要经常拆卸的部位。 缺点: 不方便截取，通常需要使用预切割管，以保证切口端平整。另外在离子色谱和生物色谱 中不适合使用不锈钢管。 TEFLON FEP(特氟隆管) TEFLON FEP(氟化乙丙烯)管具有最广的化学稳定性，价格却很低，但不耐高压，所 以更适合普通、低压应用。与PTFE(聚四氟乙烯)相比，Teflon FEP 管具有更低的气 体渗透性和更好的透明性。Teflon FEP 管大多数是透明的，可以观察流体的流动和 管路中的气泡。因此非常适合用在流动相溶剂瓶道液相 泵之间的使用。 缺点:不能耐高压，因此不能用在泵和色谱柱之间的高压流体部分。 20