猪下丘脑——垂体——甲状腺轴五个关键基因研究

猪下丘脑——垂体——甲状腺轴五个关键基因研究 猪下丘脑——垂体——甲状腺轴五个关键基因研究 ....:里曼塾基垒望 : 丕坠丛绝也 :.. .. , , ,.. / 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。掘我所知,除了文中特别加以标和敛谢的地方外,论文中不包含其 他人已经发或撰写过的研究成果,也不包含为获得逝姿盘堂或其他教育机 构的学位或证而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 , 月/印 靴敝储獬一钔肌训年 学位论文版权使用授权书 有关保留、使用学位论文的规定, 本学位论文作者完全了解逝至三盘堂 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查 阅和 借阅。本人授权逝鎏盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数掘库 进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后适用本授权书 学位论文作者签名: 导师签名: 带 签字同期:力/年 月同 签字同期:加年多月/同 学位论文作者毕业后去向: 工作单位: 电话: 通讯地址: 邮编:本学位论文由国家自然科学基金项目. 和浙江省重大科技攻关项目. .资助 . .?目录 目录. 摘要??一?. 缩略词语表. 第一章文献综述. 下丘脑?垂体一甲状腺轴基因研究进展??. .下丘脑垂体甲状腺轴总论. ..下丘脑垂体系统..下丘脑垂体甲状腺轴如珂轴. ..其他激素与玎玎轴关系.促甲状腺激素释放激素基因研究进展??.. ..引言? .. 基因结构与表达调控?. 。. 前体蛋白加工与翻译后调控? ..妤日基因多态性与功能关联. .促甲状腺激素释放激素受体基因研究进展 ..引言?. .. 基因结构与表达调控.. . 蛋白结构与翻译后调控??.. .. 胞内信号通路 .. 基因多态性与功能关联.促甲状腺激素研究进展..引言.. ..糖蛋白激素共同伍亚基基因结构与表达调控 ..促甲状腺激素特异亚基基因结构与表达调控?. .. 蛋白结构 .. 基因多态性与功能关联??.. .. 基因多态性与功能关联??..促甲状腺激素受体基因研究进展.. ..引言.. .. 基因结构与表达调控. .. 蛋白结构与翻译后调控.. 胞内信号通路 .. 基因多态性与功能关联??. 单核苷酸多态性分型技术 .引言. .酶切法??~ .引物延伸法. ..等位基因特异延伸.. ..微测序单核苷酸引物延伸.等位基因特异性杂交??. . 分型技术应用前景?。 标签选择.标签选择的意义和生物学依据. .标签选择算法? 本研究目的和意义. 第二章基因定位、克隆与表达谱 轴五个关键基因的染色体定位与分布 . //、、、基因电子定位与分布. ..材料与方法.. .. 定位结果与分析. .. 定位结果与分析. .. 定位结果与分析 .. 定位结果与分析 . 基因定位与分布.. .. 定位原理. ..材料与方法一 ..结果与分析.. .讨论?. //基因克隆?.. .引言?..材料与方法. ..实验材料、仪器设备和试剂??.. ..总提取与纯化 .. 引物? .. 扩增和产物纯化测序??“ .. / 】刚编码区全长扩增??. ..猪基因’端结构分析??.. .结果与分析? .. 实验结果? ..猪 编码区扩增结果.. ..编码序列生物信息学分析? ..猪基因’端结构?.. .讨论?. 组织表达谱分析? .材料与方法. ..实验材料、仪器设备和试剂??.. ..总提取与纯化 .. 第一链合成?. ..荧光定量引物设计 ..荧光定量?. .结果与分析. ..内参基因扩增 .. 基因组织表达谱 .. 基因组织表达谱.. 基因组织表达谱??.. .. 基因组织表达谱??. .. 基因组织表达谱??.. .讨论?. 第三章轴基因遗传多态性发现与分析? 轴基因遗传多态性发现与功能预测. .材料与方法. ..实验材料、仪器设备和试剂??.. ..基因组提取? ..再测序引物设计??. ..再测序与产物纯化测序??...分析寻找基因多态座位?.. ..多态座位功能预测分析软件与网站??。 .结果与分析. .. 基因遗传多态性座位? .. 基因遗传多态性座位 .. 基因遗传多态性座位.. .. 基因遗传多态性座位. .. 基因遗传多态性座位. .讨论?.’ 轴基因多态性座位分型方法的建立? .材料与方法. ..实验材料、仪器设备与试剂 .. 分型一 ..四引物分型? .结果与分析. .. 基因多态性座位分型电泳图? .. 基因多态性座位分型电泳图 .. 基因多态性座位分型电泳图.. .. 基因多态性座位分型电泳图.. .. 基因多态性座位分型电泳图. .讨论?. 金华猪与皮特兰猪群中轴基因频率分布?.. .材料与方法. ..实验材料、仪器设备和试剂 ..基因组提取? .. 轴基因多态性座位分型 ..统计分析?一 .结果与分析. .. 基因频率分布与单倍型分析?.. .. 基因频率分布与单倍型分析? . 基因频率分布与单倍型分析?. .. 基因频率分布与单倍型分析? .. 基因频率分布与单倍型分析? .讨论?. 第四章轴基因多态性座位与经济性状的关联分析?一材料与方法. .实验动物?.. .主要经济性状测定. ..生长性状?.. ..胴体性状..肉质性状?.. 基因组提取? . 轴基因分型.统计分析?.. ..表型性状描述性统计分析.. ..单基因模型关联分析??.. ..多基因模型关联分析 结果与分析??。. .表型性状描述性统计分析结果?.. ..金皮资源家系生长性状统计结果??:?. ..金皮资源家系胴体性状统计结果? ..金皮资源家系肉质性状统计结果? . 基因多态性对猪主要经济性状的遗传效应.. .. 基因多态性与猪生长性状关联分析结果.. 基因多态性与猪胴体性状关联分析结果.. 基因多态性与猪肉质性状关联分析结果. 基因多态对猪主要经济性状的遗传效应. .. 基因多态性与猪生长性状关联分析结果~ .. 基因多态性与猪胴体性状关联分析结果一 .. 基因多态性与猪肉质性状关联分析结果.. . 基因多态性对猪主要经济性状的遗传效应 .. 基因多态与猪生长性状关联分析结果.. 基因多态与猪胴体性状关联分析结果.. 基因多态与猪肉质性状关联分析结果. 基因多态性对猪主要经济性状的遗传效应??.. .. 基因多态与猪生长性状关联分析结果.. 基因多态与猪胴体性状关联分析结果.. 基因多态与猪肉质性状关联分析结果. 基因多态性对猪主要经济性状的遗传效应??。 .. 基因多态与猪生长性状关联分析结果??.. 基因多态性与猪胴体性状关联分析结果? .. 基因多态性与猪肉质性状关联分析结果? .多基因模型分析结果..对生长性状的多基因模型分析结果..对胴体性状的 多基因模型分析结果..对肉质性状的多基因模型分析结果讨论?.. 基因多态性遗传效应 . 基因多态性遗传效应??. . 基因多态性遗传效应 . 基因多态性遗传效应??.. . 基因多态性遗传效应??.. 第五章唧轴基因多态性在其他品种群体中的分析材料与方法??.. .实验材料? ..实验动物? ..性状?. .基因组提取.. .功可轴座位分型?.. .统计分析? ..群体遗传学分析?. ..关联分析?. 结果与分析??.. .群体遗传学分析? ..基因与基因型频率 ..哈代.温伯格平衡检验.. 轴基因遗传多样性?. ..种群间遗传距离? .关联分析? ..玎玎轴基因多态性在约克夏中的关联分析??. ..印可轴基因多态性在杜洛克中的关联分析??. ..坷叮轴基因多态性在长白猪中的关联分析??.四论第六章结论参考文献 附录??.. 攻读博士学位期间以第一作者发表录用的学术论文? 致谢 摘要 候选基因鉴定法是分析数量性状基因的重要方法。本论文以在机体物质与 能量代谢、个体生长发育调控中发挥重要作用的下丘脑.垂体.甲状腺轴五个 关 键调控基因:促甲状腺激素释放激素前体基因、促甲状腺激素释放激素受 体基因、组成促甲状腺激素的糖蛋白激素共同亚基基因和促甲状腺 激素亚基基因,以及促甲状腺激素受体基因为研究对象,应用生 物信息学、辐射杂交细胞系定位技术、、实时荧光定量、 、四引物.等技术对轴五个关键基因进行染色体定位、 分布分析、克隆、组织表达谱分析、遗传多态寻找以及与猪主要经 济性状的关联分析研究,以期了解轴该五个关键基因的分子生物学特性, 并为猪主要经济性状遗传改良和标记辅助选择提供科学依据。实验主要得出 以 下一些结果: 应用生物信息学和辐射杂交细胞系定位技术,轴五个关键基因 分别被定位于猪、、、和号染色体。根据数据库查询结果,五个 基因全部位于日增重、肌肉品质和脂肪性状相关内,提示猪轴基因 多态与个体生长速度、肉质和脂肪性状差异可能存在重要关联,为相应的 位置功能候选基因。 本论文首次克隆获得猪基因序列,并在分子水平上进 行了深入分析。猪基因与人基因进化上很接近。除基因的 功能性转录本外,本论文实验中还发现了另外两种转录本类型。其中,转录本 为功能转录本的截断型,仅含端结构、跨膜螺旋.及部分胞内环序 列,缺失跨膜域和以及蛋白端结构;而转录本则恰与转录本相反, 剪切 的选择性剪接内含子后,使之缺失了蛋白的端编码序列, 但保留有端编码序列。然而选择性内含子的剪接,破坏了原阅读框,转录本 可能编码一种新的功能蛋白,也可能使用了不同的翻译起始位点。多种转录 本存在的意义有待研究。 采用荧光定量技术,检测了轴五个关键基因在大脑、 下丘脑、垂体、心、肝、脾、肺、肾、甲状腺、胰、胃、小肠、大肠,以及 肌 肉和皮下脂肪共个组织中的表达分布。轴激素及其受体在外周组织,如皮下 脂肪中的共表达,提示相应激素可能通过旁分泌或自分泌方式对局部组 织进行着生长发育调控。 以金华猪和皮特兰资源家系亲本个体为模板,共设计对引物扩增 轴五个关键基因总长, 的序列,进行再测序以寻找核 苷酸多态变异。分析基因测序峰图,共发现个多态座位,其中位于基 因多态座位个,基因多态座位个,基因多态座位个, 基因多态座位个,基因多态座位个。检测到的所有多态座位都提交 到了国际数据库,并获得登录号。根据多态座位彼此间距离 间隔、侧翼序列特点及其潜在功能重要性,选择了其中个座位,采用 和四引物技术设计并优化了分型方法。 对头纯种金华猪和头纯种皮特兰猪进行唧轴个多态座位 的分型,并采用软件进行基因单倍型块分析和标签选择。除 基因在金华猪中分布于两个单倍型块外,其他基因的座位均位于同 一单倍型块中。结合两个品种的单倍型区块和标签集合信息,共选择了 个基因标签,个基因标签,个基因标签, 个基因标签和个基因标签,用于在金华猪与皮特兰资 源家系中进行轴基因多态遗传效应分析。 在金华猪与皮特兰资源家系共头个体中分析了肿轴基因多态 性与猪生长、胴体和肉质共个主要经济性状的关联性,并在在约克夏、杜洛 克、长白猪以及嘉兴黑猪中进行了一定的验证分析。分析结果显示: 与个体生长发育后期,尤其是 在金皮资源家系中 .日龄期间增重有显著关联,其在国内和国外猪种中的基因频率亦存在明 显的对立分布差异,但在生长较慢的金华猪中占优势的插入突变却在资源家 系 中表现为生长优势。本研究认为基因可能在中外猪种生长性状差异形成中 有一定影响,是相关日增重下的位置功能候选基因,但其多态座位效应仍 有待进一步挖掘验证。 基因多态性的种群间分化较大。在金皮资源家系中,其对个体头 重和胴体长有极显著效应,对眼肌的导电率、值、系水力、肌内水份和肌内 脂肪性状有显著影响。基因与多项肉质指标存在显著关联,且在肌肉组 织中有表达,本文认为有必要对基因在猪肌肉组织中的功能进行深入研 究。尽管本文发现基因多态性与猪肌内水份含量存在显著关联,此前 并未见肌内水份定位于基因。可能由于基因内微卫星的存在, 造成较频繁的基因内重组,而使基因效应表现不稳定。所有个 在国 内外猪种中均未表现出明显对立的等位基因频率分布差异。因此本研究认 为, 基因多态性可能在国内外猪种性状差异形成中不具有重要地位。 基因的种群间分化也较大。在金皮资源家系中,基因多态性 对猪日龄期间增重、后腿肌肉重有统计显著效应,对猪胴体重、胴体长 和平均背膘厚有极显著效应。含金华猪单倍型纯合子个体较皮特兰单倍 型纯合子个体增重显著慢,与一般认为的金华猪生长速度慢相一致。并 且含皮特兰单倍型.个体背膘厚显著小于含金华猪单倍型.个体。 此外,在杜洛克群体中, 座位与背膘厚也存在显著关联, 在国外猪种中占优势的等位基因有降低背膘厚的效应,验证了在金皮资源家 系中的分析结果。因此本研究认为,基因,尤其是其 具 有作为遗传分子标记应用于猪背膘厚性状改良育种中的价值。 基因多态性座位的等位基因在所有猪种中均以低频出现。金皮 资源家系中,基因多态性对个体生长发育后期日龄至日龄期间 增重以及眼肌值有显著影响。在长白猪群体中的关联分析,进一步确证了 与日增重的关联性。然而,在金皮资源家系中表现出生长优势的等位基 因,在长白猪群体中却表现为生长劣势。 关键词:下丘脑.垂体.甲状腺轴,乃,,,,,单核苷 酸多态性广.’硎, :,, ,,, ,, , ,’ ,. , . : 如 ?’ ,,, 咖 佰 ,,. , ,, ’’, . .鹪., . , 们. . , .. ,,,, , , . ,, ,.. , . , ,? . , , , . , 撑. , , ,?. , 刮 讯.. , .,出 : ,, . .. :/,. . . . , .., , . . .., . . 哆 ? .. , . . . , , . . .一 . 嬲. . : ,,,.?.缩略词语表 促肾上腺皮质激素 ...平均日增重 扩增受阻突变体系 背膘厚 , 糖蛋白激素?亚基环化腺苷酸响应元件 . 促肾上腺皮质激素释放激素卵泡刺激素 .生长激素 生长激素释放激素 . . 促性腺激素释放激素蛋白偶联受体 . 糖蛋白激素受体糖皮质激素响应元件下丘脑一垂体?甲状腺轴 连锁不平衡 促黄体生成素 促分裂素原活化蛋白激酶 .多聚酶链式反应限制性内切酶片段长度多态性催乳素辐射杂交细胞系定位 技术 单核苷酸多态性 生长抑素 黜 猪染色体体 甲状腺激素跨膜螺旋 . 甲状腺激素响应元件 促甲状腺激素释放激素 促甲状腺激素释放激素受体促甲状腺激素 促甲状腺激素亚基 , 促甲状腺激素受体瑚 数量性状座位 浙江大学博士学位论文 第一章文献综述 第一章文献综述 下丘脑一垂体一甲状腺轴基因研究进展 .下丘脑.垂体.甲状腺轴总论 动物机体的绝大多数功能均受神经系统和内分泌系统调控。其中内分泌激 素具有高效生物放大作用,生物体内激素水平发生微小变化,即可能引起生 理 功能的巨大改变。 ..下丘脑.垂体系统 下丘脑或称丘脑下部,属于间脑的一部分,其所占比例虽 小,但结构复杂。一方面其与中枢神经系统其它部位存在着广泛的双向联系, 另一方面它又是连接神经系统与内分泌系统的重要桥梁。下丘脑对内分泌的 调 节,除部分通过自主神经外,主要经调控垂体功能实现迟素敏主编,。 如图.所示,下丘脑通过垂体门脉系统分泌促释放激素或释放抑制激素调控 腺垂体功能,另外下丘脑视上核和室旁核神经元合成的抗利尿激素和催产 素, 沿着轴突直接传送到神经垂体中贮存并释放。 垂体是脊椎动物的主要内分泌腺陈守良编著,,位于下 丘脑的下方,通过漏斗柄与下丘脑漏斗相连。动物垂体一般由前叶、中间叶和 后叶三部分组成。根据功能特征,又将垂体分为腺垂体和神经垂体。其中前叶、 中间叶和结节部构成腺垂体,而后叶、垂体柄和正中隆起组成神经垂体。腺垂 体含大量激素分泌细胞,根据其免疫组化特征,可分为种类型表.。除 生长激素 ,外,其他激素均有其主要作用的靶腺体或靶器 官。因所有垂体激素又受下丘脑促垂体前叶激素释放激素或释放抑制激素调控, 人们常将下丘脑、垂体与靶器官三者之间的联系以“轴加以概括,如: ,轴,下丘脑垂体 下丘脑垂体性腺轴 ,轴和下丘脑垂体甲 肾上腺轴 ,轴。 状腺轴..第一章文献综述 浙江大学博士学位论文 室旁核 圆形 蘑肪组织 肌肉缌织 心脏 肝脏 肾脏 图.下丘脑垂体一甲状腺轴调控网络示意图,参考 ,绘制。 ., ,. ..下丘脑.垂体.甲状腺轴卸轴 , 下丘脑分泌的促甲状腺激素释放激素 与腺垂体促甲状腺激素细胞膜上的受体 ,结合后,激活促甲状腺激素细胞胞内信使通路,促进促甲状第一章文献综述 浙江大学博士学位论文 腺激素,的分泌和合成。垂体释放的经血液循环,结 合至甲状腺滤泡上皮细胞膜上的受体 ,,促进 ,。被释放入血液后, 甲状腺释放和合成甲状腺激素 以游离状态或与血浆蛋白结合的方式被运送至全身各个组织。 表.垂体前叶主要细胞类型 . ‘苏木精伊红染色。参考迟素敏主编,和沈霞芬主编,。‘ . 迟素敏主编,沈 霞芬主编,. 的作用几乎遍布机体所有器官与组织,调节着体内物质与能量代谢,影 响个体生长和发育。能调节脂肪细胞分化,并通过直接作用于脂肪细胞激活 解偶联蛋白,使化学能不能用于生成而以热能释放,或诱导肝脏合成 多种脂肪代谢酶,使胆固醇的合成和分解均加快,但分解大于合成迟素敏主 编,:能提高脂肪、骨骼肌、心肌、肝和肾等组织的耗氧量,使产热增浙江大 学博士学位论文 第一章文献综述 加,但肺不受影响;还可明显加强蛋白质分解、促进糖的吸收利用和糖原合 成。此外,还可使胃肠蠕动加速,胃排空增快,肠吸收减少。先天性甲状腺 不发育的胎儿在出生后表现出骨骼生长停滞。 甲状腺功能的基础水平.因个体而异 .,,研究表 明此“基础水平的个体差异很大程度上受遗传因素控制 .,。 另一方面即使是血液水平微小的改变也可以导致一系列相关表型如体 重、肥胖度、骨骼矿物质密度和心率等的变化 .,; , 。而甲状腺功能及血液水平主要受与的调控。通过抑 制垂体基因和 亚基基因表达及分泌进行负反馈调节 ; ,,但的负反馈调定点受水平控制。 ..其他激素与轴关系 除促进分泌外,还促进垂体和的释放。此外,亦 影响血管加压素和胰岛素等的分泌。 脂肪组织分泌的瘦素通过影响//基因与编码基因的表达, 调节轴功能以实现对机体能量与物质代谢的调控。肾上腺皮质分泌的糖皮 质激素也影响下丘脑与垂体前叶基因的表达。雌激素调控垂体前叶 细胞 表达水平,可增强促甲状腺激素细胞对的反应性。 .促甲状腺激素释放激素基因研究进展 ..引言 年实验室从万只羊的下丘脑中成功分离出,并在次 年确定其是一种三肽, .,, 化学结构为: 且无种属特异性,在所有脊椎动物中完全保守 .,;迟素敏主编, 。 除具有促垂体激素作用外,还具有神经递质/神经调质的作用,广泛分 布于中枢神经和周围神经系统。除下丘脑外,其他脑区如中缝核、嗅球、伏 隔 核、丘脑、中脑的中央灰质,以及脊髓都有广泛的分布,但在大脑皮质和 小脑含量相对较少迟素敏主编,。此外,外周组织中如胃肠道、胰岛 细胞、甲状腺细胞滤泡旁细胞、生殖相关组织如胎盘、子宫、卵巢、睾第一 章文献综述 浙江大学博士学位论文 丸和前列腺等 .,,心肌细胞、肾上腺、视网膜以及脾脏和胸 , 腺等免疫组织也发现的表达 .,; ,。在外周组织的功能目前尚不清楚,可能具 有自分泌或旁分泌调控作用。已有研究表明可以旁分泌的形式调控胰岛 细胞胞内信号通路和胰岛素分泌 .,、促进胃肠道分泌和蠕动 心 ,、调控前列腺生长等。此外能直 接作用于心脏增强心肌收缩 。 半衰期很短,其降解主要涉及四种酶 ,。中 枢神经系统的降解主要依靠?,一种突触后膜结合蛋白,也称为 降解酶 ,皿;而血清和 众多外周组织中的降解则主要通过血清酶。 .. /基因结构与表达调控 人编码基因全长. ,含个外显子和个内含子,长 ,编码含个氨基酸的激素原前体:,,; .,。外显子编码 ’端非翻译区,外显子编码长 个氨基酸的信号肽及前体大部分末端肽,外显子则编码末端肽 的其余部分、个拷贝的和末端肽如图.所示。但大鼠和小鼠 激素原前体仅含个拷贝的,而非哺乳脊椎动物可高达拷贝, 。 翻 隧缀黧缀霾 . 图.人激素原前体基因结构,参考,。黑框.表示前体序列; :信号肽序列;两个倒三角表示内含子的位置。 , 基,.出. ;: ; . 第一章文献综述 浙江大学博士学位论文 尽管的间隔区序列也合成有活性的非多肽,但这些区域 显著高于编码区,但 种间序列保守性较低,其进化速率 又仅为无功能中性突变的.%,。这些区域的选择压可能仅在 于维持.的构象,以利于剪切产生活性多肽,且其编码的非多肽功 能似乎存在种属特异性。此外,的’非翻译区序列变异也很大。然而真 兽亚纲动物中,转录起始位点上游约 的核心启动子和转录调控序列被观 察到高度保守,其中较保守的元件有盒、甲状腺激素结合元件、环 化腺苷酸响应元件和转录因子结合元件,。 的表达,而其他脑区 能够抑制下丘脑细胞中 。糖皮质激素对.基因 表达似乎不受调控 表达也有影响,但其效应取决于作用的细胞类型。此外,由脂肪组织分泌的瘦 素对/生物合成和释放也有影响,可能直接作用于 下丘脑神经元,也可能通过抑制神经肽或促进的释放以增加 分泌 ,。 .. 前体蛋白加工与翻译后调控 //基因首先被翻译为激素原前体,翻译后加工主要有激素原转换 .,和参与 ,。 酶 中,每一拷贝的序列右侧均有一甘氨酸,用以形成 末端的酰胺基.,此外两侧还有一对碱性残基赖氨酸或精氨酸以提供 多肽剪切加工的识别位点。 除加工生成经典的外,还可衍生出大量其他多肽 ,,如 .:可增强垂体前叶的释放和 亚基基因启动子活性,以及诱导增强胃酸分泌;.?抑制 肾上腺皮质醇 .,和分泌:./和 势参与哺乳和释放;.参与痛觉感 知等。各种衍生肽的表达水平可以根据不同生理状态独立调节。、 .. 基因多态性与功能关联 ., 目前仅见报道人类高血压疾病与基因多态变异存在关联 。第一章文献综述 浙江大学博士学位论文 .促甲状腺激素释放激素受体//基因研究进展 ..引言 执行其所有生物功能均须通过与其靶细胞表面的受体 结合,以激活胞内第二信使通路,调控靶基因表达而实现。属于蛋白 偶联受体超家族 . 视紫素/.肾上腺素受 体家族 成员 ,。 年,从小鼠垂体瘤细胞文库克隆获得受体基因 .,。随后,其垂直同源基因在其他物种中也得到克隆,包括: 大鼠 .,; .,、牛 .,、鸡 .,、羊 .,、非洲爪蟾 .,、白鲤.,以及人类】 .,; ., 等。年,在大 鼠中发现了第二种受体亚型 .,,随即在小鼠 .,、白鲤 .,和非洲爪蟾 .,中也 有报道。两种受体亚型蛋白序列同源性约为%。关于两者在组织分布、 ., 结合力,基础信号和激活信号等结构和功能差异已有详细综述 。年,在非洲爪蟾中又发现第三种受体亚型田 ., ,目前仅另见报道于鱼鲻 .,。 如图.所示,已报到的三种受体亚型在进化中分化时间较早。其中 .与两栖纲动物皮肤颜色随环境变化有关 .,,相较于其他 两种受体亚型,爪蟾需要更高浓度的才能激活 ., .,。此外, ,有研究认为可能并非的天然受体 至今未见报道人有第二种受体亚型,且人类基因组信息显示仅存在一种 .,,与小鼠.同源,本文研究的即 受体即 此亚型。在进化中表现出高度保守性,人蛋白与小鼠和大鼠 同源性达%,与羊同源性更是高达%以上。 垂体是作用的主要靶内分泌腺体,主要分布于垂体促甲状腺激 素细胞和促乳素细胞细胞膜表面 .,。此外,咖己也分布于中 枢神经系统和其他外周组织,用不同方法获得的表达测定结果~般是一致的, 但也有例外。比如,在免疫组化实验中,.存在于海马结构的锥体层,然 而原位杂交显示无表达。这可能是因为存在于某一脑区神经末端的源自第一 章文献综述 浙江大学博士学位论文 .,。 另一脑区的神经元胞体,这些受体只能被免疫组化方法检 免疫组化分析显示还存在于睾丸、胃、小肠、结肠、肾上腺髓质.,和胰腺 ,。 通过方法在牛肺、肝、脾、肾 中未检测到表达 .,。在爪蟾肺、心脏、背部皮肤、膀胱、 ., 睾丸、胃和小肠中检测到表达,肝脏中未检测到表达 。在鳐脾脏、胃肠道和皮肤中检测到表达,同样未在肝脏 .,。此外,在免疫系统的胸腺和自然杀 中检测到表达 伤细胞 中亦发现 的表达 .,。 方法比对序列。 图. 蛋白分子进化树。使用软件 . 删 ? : .. 基因结构与表达调控 虽然蛋白序列高度保守,但其基因结构在不同物种中差异较大。如 大鼠全部编码序列位于同一外显子,而小鼠蛋白编码区则分布于两个外 显子上,内含子靠近蛋白末端。人蛋白编码区也由两个外显子组成, 但其内含子位于第与第跨膜螺旋之间的第三胞内环上 ,。 人基因全长 .,,含个外显子和个内含子, 如图.所示。外显子编码 ’端非翻译区,外显子编码蛋白 胞外域和跨膜螺旋 ,.,外显子则编码 和以及蛋白胞内结构序列。第一章文献综述 浙江大学博士学位论文 图.人类基因结构示意图。上方方框内显示外显子和内含子剪切点边缘序 列。内含子 .,。 在啮齿类动物进化中消失 . . . ., .基因启动子具有细胞类型表达特异性 ., ., 。等发现基因存在至少两个不同的转录起点,且决定 细胞类型表达特异性的顺式调控元件位于外显子或内含子上。垂体特异转 录因子.被证明与内含子的顺式调控元件结合,参与调控的细胞特 异表达 .,。 已知在垂体前叶和细胞中 水平受甲状腺激素、雌激素、 糖皮质激素和表皮生长因子的调控 .,,分析启动 子序列显示可能存在相应的顺式调控元件如、糖皮质激素响应元件、 结合元件、转录激活蛋白 .,.结合元件、.,、? 等。已通过实验验证的顺式调控元件有 .,。等认为/基因的第一个内含子 .,和 是基因表达的重要调控区域 .,。 小鼠和大鼠末端有不同的剪接型,但这些异构体在功能或是组织表达水 平等方面的差异,目前尚无定论,而人类基因末端不存在其他剪接供 体或受体位点。但在人垂体瘤细胞中有报道剪接变异体存在 ., 。鸡/被发现存在第三胞内环末端截断型异构体,但这些异构体似乎 并无功毙 .,。 .. 蛋白结构与翻译后调控 蛋白含七次跨膜螺旋如图.所示,跨膜螺旋束中含结合 袋。在进入结合袋前,还与胞外环残基存在互作 ,。浙江大学博士学位论文 第一章文献综述 图. 重要功能碱基示意图参照大鼠, .,。:胞外 环;:胞内环。位于胞外的%和残基由一个二硫键连接;受体末端第 个氨基酸残基上游的数个残基片断、、弋不和等基序对的 内化相当重要,其中和的影响尤为突出。 . .,.: ;: .托 ; , , , 肿 ”. 末端第和第个氨基酸以及位于胞外环的第个碱基构成三个潜 在连接糖基化位点基序为../睨,其中至少有一个在体内被糖基 化 ,。胞内环及末端含有丝氨酸和苏氨酸残 基,可作为第二信使依赖或受体特异蛋白激酶的磷酸化调控位点。持续刺激 可 致受体反应减弱,末端对于这种由配体介导的脱敏作用是 必须的。 位于跨膜螺旋、和的三个氨基酸残基,和舡刑在 家族中高度保守,这几个碱基的互作对蛋白偶联有重要作用。 家族的一个标志性特征是在胞内环中含精氨酸残基,该残基的突变可致 蛋白无法偶联。大部分家族受体的精氨酸残基两侧为天冬氨酸和酪氨第一章 文献综述 浙江大学博士学位论文 .,。在家族中高度 酸残基,形成所谓的‘基序” 保守的色氨酸是由和中的芳香族残基组成的疏水簇的一 部分,使这两个跨膜螺旋彼此靠近。结合后的其和 的胞内部分平均距离增加。释放近顶端的色氨酸施加的约束导致的构象 变化通过螺旋转换到胞内环,胞内环与和/的偶联相关。除去胞 内环的主要部分不影响其与配体的亲和力,但严重削弱磷酸肌醇产物的偶联 和受体的内化作用,位于胞内环的和对磷酸 肌醇产物的偶联尤其重要。 内化作用指配体与细胞膜表面受体结合形成复合物后,进而发生膜内陷, 凹入细胞内形成内体的过程。?瓜受体/配体复合物可能像其他成员一 样,通过披网格蛋白小泡从细胞膜表面转移到细胞内。一部分受体/配体复合 物 被定位到溶酶体内,而其他则循环再生至细胞表面。返回到细胞表面时, 可能仍结合在上,也可能在胞内分离下来并在溶酶体中降解。内化作用 可能与受体的磷酸化、与蛋白偶联情况、胞外域和跨膜螺旋结构、受体构象 等有关。 .. 胞内信号通路 胞内信号转导主要由“蛋白偶联介导。与结合后激 ,促进磷脂酰肌醇二磷酸 活磷酸肌醇特异的磷脂酶 ,.,水解形成三磷酸肌醇 ,一,和甘油二酯一,。这些第 二信使促进胞内钙离子增加并激活蛋白激酶如图.所示。活化后同 , 时也激活钙/钙调蛋白依赖蛋白激酶/. , /和促分裂素原活化蛋白激酶. 。此外发现也与吼,和一个无法激活腺苷酸环化酶的类& 蛋白偶联。 已知有转录因子参与诱导的基因转录。活化诱导的基因表达, 部分通过转录激活蛋白.实现。钙/钙调蛋白依赖蛋白激酶通过。伽响应 元件结合蛋白诱导基因转录。而的活化可激活转录因子类基 因 , .,。不存在时,也有一 定的基础信号活性。 ,蛋白信号调节蛋浙江大学博士学位论文 第一章文献综述 .,,是脑内不依赖于 白对基础信号活性有调节作用 信号转导的重要调控因子。的基础活性均可被竞争物咪达唑仑所抑 制。 图. 结合激活的胞内信号转导途径 .,。 . ., . .. 基因多态性与功能关联 有报道发现人类基因突变 .,导致其无法与结合 激活胞内信号通路,从而造成中枢性甲状腺功能减退综合症 。甲减患儿往往表现出生长发育迟缓,矮胖和行动迟钝等症状。 最近,基因在一项全基因组关联分析中被指出与人类瘦体重个体变异有 显著关联 .,。 .促甲状腺激素研究进展 ..引言第一章文献综述 浙江大学博士学位论文 年,首先发现垂体前叶能分泌一种甲状腺刺激因子:将牛 垂体提取物注射到多种真螈中,均能清楚观察到甲状腺组织学反应 ,。上世纪年代这种甲状腺刺激因子被纯化出来, 其组成亚基的氨基酸序列也于年代初被确定。 分子量为. ,属于糖蛋白激素家族成员。该家族成员还包括 卵泡刺激素. ,,黄体生成素 ,以及人绒毛膜促性腺激素 .。 它们均为异二聚体糖蛋白,由共同的‘亚基和激素特异的亚基组成 ,。倪亚基与亚基被认为由共同的祖先基因进化而来 ,此外【亚基与亚基的共表达对产生完整的激素蛋白非常重要,如细胞 内自由存在的 亚基会被快速降解,只有%能分泌到细胞外。甲状腺功 能改变时,的波动较甲状腺激素更迅速且显著,是反映轴功能的敏感 指标刘玉冰,。 上世纪年代克隆到编码伐亚基的 , 基因 ,和编码亚基的, 基因 .,; .,;.,核酸序列,这在研究中具有里程碑的意义。 基因主要在垂体促甲状腺素细胞和促性腺激素细胞,以及马和灵长类 胎盘中表达。此外,基因还见报道表达于美国红鱼性腺,而在脑、腮、肝、 脾中未检测到表达 .,。 一般认为,基因仅特异表达于垂体细胞,未见 存在于鸭的睾丸、脑、肝和甲 状腺组织 .,; .,,亦未 见 于美国红鱼的脑、腮、肝、脾和性腺组织 .,。但 有报道基因在石斑鱼性腺、肝和肾脏中表达 ., .,; ,并在石斑鱼的性反转中扮演重要角色。可能在鱼生殖中具有重要旁 分泌调控功能,但目前尚无这方面的研究 .,。此外,有报 道基因在人皮肤上皮细胞中条件性表达 .,。 ..糖蛋白激素共同亚基基因结构与表达调控浙江大学博士学位论文 第一章文献综述 实验室已对猪基因的 .,和基因组序列 .,进行了克隆,并对其’上游序列的转录调控功能进行了深入研究 .,; .,; ., 猪基因由个外显子和个内含子构成,全长,如图.所示。 第一和第二内含子分别含有微卫星序列多态,内含子微卫星常作为增强子介 导 组织特异的选择性剪接或调节基因转录,但目前尚无关于基因内含子多态 功能的报道。?%艇譬邕艇 。 约. 约.图.猪基因结构与启动子区调控元件,参考 .,; .,;.,。:垂体糖蛋白 激素基础元件::促性腺激素特异元件:: 转录因子结合元件;:垂体特异性转录因子祖先蛋白结合序列;:转录 因子.结合元件。 . .,; .,; .,.::: ;:;: ;: . 通过信号通路作用于家族转录因子与启动子区相应 元件的结合,从而实现对基因的表达调控 .,。此外,瘦 素和神经肽均能在垂体水平增加和基因的表达.,;糖皮质激素也能够诱导基 因表达 .,。 .促甲状腺激素特异亚基基因结构与表达调控 人基因由个外显子和个内含子构成塔 .,,长 .,如图.所示,基因已知仅有单一转录起始位点。硬骨鱼中报道 存在多种 剪接体 .,,主要为区变异。 基因的表达直接受到、的正向调控,以及甲状腺激素和神经 .,。此外,基 肽? 的逆向调控第一章文献综述 浙江大学博士学位论文因转录调控区还存 在一反应元件 .,; .,、 反应元件 .,和反应元件 .,。 驻 外显子长度 助 印 内含予长度 图. 基因结构示意图引自 。,。 . % .,. .. 蛋白结构 猪基因编码的糖蛋白激素共同亚基前体第至位氨基酸残基为 信号肽序列,在蛋白成熟过程中被切除。基因编码的 亚基蛋白前 体端个氨基酸也为信号肽序列,在蛋白成熟过程中切除,此外亚基前 体端个疏水残基亦在成熟过程中切除 .,。 . 成熟蛋白结构如图.所示,亚基以‘”保险带结构 非共价缠绕在亚基长环.上,起连接和固定作用。成熟含三条天冬酰 胺连接.的糖链,占其总重量的%%。其中两条糖链位于亚 基?和,第三条糖链位于亚基.。这些连接的寡糖均为 复杂型结构,并在其末端残基上表现出明显的激素和种属特异性。糖链对亚 基 ., 的组装及其稳定性、激素的生物活性和代谢率均有重要影响 :比如连接于伍亚基.的寡糖链可稳定伍亚基内折叠片的疏水包 装,从而影响和环与胞外区的互作;连接于亚基.的 寡糖链对的清除速率起决定性作用。 此外,亚基第至氨基酸序列区域与信号转导作用密切相关。亚基 组成胱氨酸节基序 的三个二硫键:.、和 ? ,完整的胱氨酸节结构与激素的胞内稳定性和亚基的异二 聚化有关;而亚基的另两个二硫键:和则参与 ‘”结构的形成 .,。