γ-谷氨酰转肽酶酶学性质及其催化应用的研究

γ-谷氨酰转肽酶酶学性质及其催化应用的研究 γ-谷氨酰转肽酶酶学性质及其催化应用的研究 广东药学院 硕士学位论文 γ-谷氨酰转肽酶酶学性质及其催化应用研究 姓名蒋敏丽 申请学位级别硕士 专业病原生物学 指导教师胡立勇 2011-05 广东药学院硕士研究生学位论文 -谷氨酰转肽酶酶学性质及其催化应用研究 中文摘要 -谷氨酰转肽酶在生物体内广泛存在是谷胱甘肽代谢的关键酶之一随着生物 技术发展的快速发展利用-谷氨酰转肽酶制备系列-谷氨酰基类化合物的研究已成 为生物催化领域的热点目前本实验室筛选到一株-谷氨酰转肽酶高产菌株并已 探索了以菌体作为酶源催化合成茶氨酸的生产工艺在此基础上我们作了进一步的 研究 目的 以Bacillus licheniformis C12 菌株为-谷氨酰转肽酶制备的菌种来源通过对其产 酶发酵条件优化提取工艺酶学性质及固定化该酶催化底物生产茶氨酸进行系统研 究为固定化该酶工业化生产茶氨酸打下基础 方法 1 产酶发酵的诱导条件研究采用底物诱导作用通过不同底物 甘氨酸谷氨 酸谷氨酰胺对菌体产酶发酵进行诱导提高菌体的产酶量 2 酶的提取及酶学性质研究采用溶菌酶法反复冻融法超声波法破碎细胞壁 高速冷冻离心后获得-谷氨酰转肽酶粗酶液经硫酸铵分级沉淀及透析脱盐初步纯化 后得到酶的提取物采用-谷氨酰转肽酶常规测定方法检测其酶学性质 3 固定化酶制备及催化条件研究采用海藻酸钠包埋戊二醛交联法制备固定化 酶通过正交试验对固定化酶条件进行优化通过采取调整底物浓度反应温度 pH 以及添加酶促进剂提高固定化酶催化生产茶氨酸量并采用正交试验得到最 佳的固定化酶催化生产茶氨酸的工艺条件 结果 1 产酶发酵的诱导条件研究产酶发酵24h 后添加谷氨酰胺至浓度5mmolL诱 导2h 后其酶活力最高为70Uml是对照组的226 倍 2 酶提取及酶学性质研究菌体细胞破碎的较佳方法为溶菌酶破碎法其操作条 件选择为每克湿菌体加入25mg 溶菌酶35?酶解20min 冷冻离心得粗酶液再经 I 广东药学院硕士研究生学位论文 过 80-90饱和度的硫酸铵分级沉淀及透析脱盐初步纯化后得到酶的提取物该酶 的最适pH 为80最适温度为45?-谷氨酰转肽酶的转肽反应Km 为073mmolL 该酶在25-35?的温度范围有较好的稳定性在50?的温度下保存20min 酶活力基本 丧失该酶在碱性环境中比较稳定酸性环境中很容易失活在Ba2 Mg2 Ca2等 金属离子浓度为5mmolL 的情况下对该酶的活力均有促进作用 3 固定化酶制备及催化条件研究? 固定化酶制备方法采用海藻酸钠包埋戊 二醛交联法取一定量的酶提取物添加含量30的海藻酸钠包埋再添加025戊 二醛进行交联交联时间25h制备得到的固定化酶酶活回收率为708 固定化酶 的最适pH 为90与游离酶相比向酸性方向偏移10 个单位固定化酶的最适温度为 37?比游离酶最适温度降低了8 ?-谷氨酰转肽酶经固定化后热稳定性酸碱 稳定性和贮存稳定性都得到了提高?固定化酶催化条件研究了Mg2及16-二磷酸 果糖FDP 发酵液在转化体系中促进合成茶氨酸的作用通过正交试验确定 Mg2 及 16-二磷酸果糖FDP 发酵液在转化体系中促进合成茶氨酸的较佳条件为 20ml FDP 发酵液30ml 转化液以及Mg2浓度为30mmolL在此条件下固定化酶转化合成 茶氨酸量为95gL 相比对照组61 gL 提高了557固定化酶生产茶氨酸的操作稳 定性比较差反应九批次后茶氨酸产量只有首批次的311 结论 本研究优化了产酶发酵条件初步建立了来源于Bacillus licheniformis C12 菌株的 -谷氨酰转肽酶的提取纯化方法及了解了该酶的部分酶学性质采用海藻酸钠包埋戊 二醛交联法制备固定化-谷氨酰转肽酶可用于生产茶氨酸固定化酶酶活力与操 作稳定性还有待进一步提高 关键词-谷氨酰转肽酶酶学性质固定化酶茶氨酸 II 广东药学院硕士研究生学位论文 参考文献 [1] Meister AltonSuresh S TateOwen W G eriffitr- lutamyltranspeptidase[J]Methods in Enzymology198177237-253 [2] Moshe Y et al-Glutamyl Transpeptidase from Kidney Bean Fruit Purification and Mechanism of Action[J]Biochemica et Biophysical Acta19671 132 15-26 [3] Leibach FHBinkley F-Glutamyl Transferase of Swine Kidney[J]Archives of 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Gamma-glutamyltranspeptidase its preparation and its use[P] EP4990444 1991 [30] Kenji T Toshihiro Y Jixi Zhuet al Synthesis of - glutamyltaurine by 50 广东药学院硕士研究生学位论文 –glutamyl-transpeptidase of Penicillium roqueforti [J]Acom198953 12 3239-3244 [31] Hideyuki SNobukazu MHidehiko K Enzymatic production of -L- glutamyltaurine through the transpeptidation reaction of -glutamyltranspeptidase from Escherichia coli K- 12[J] Enzyme and Microbial Technology2002 30 883-888 [32] 王玉芬李春雨秦志祥等茶氨酸对脑缺血再灌注损伤保护作用的实验研 究[J]中华 神经医学杂志20065 6 562-565 [33] Yasuyuki STomomi SSadao H Modulation of Cancer Chemotherapy by Green Tea[J]Clin Cancer Res1998 4 153- 156 [34] 胡安拉李李胡传来等茶氨酸体外对人胃癌细胞MGC803 增殖的作用及与阿霉素 的联合作用[J]营养学报201032 1 60-63 [35] 虞希冲吴波拉朱桐君等茶氨酸对小鼠戊巴比妥钠镇静催眠的双向作用[J]茶叶科 学200929 4 257-262 [36] 李敏 沈新南 姚国英 茶氨酸延缓运动性疲劳及其作用机制研究[J] 营养学 报200527 4 326-329 [37] 林雪玲 程朝辉 黄才欢等 茶氨酸对小鼠学习记忆能力的影响[J] 食品科 学200425 5 171- 173 [38] 李天舒茶氨酸可抑制烟瘾[N]健康报2010-5-20 002 [39] Hideyuki SShunsuke INobukazu Met al Enzyma tic production of 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通变形杆菌以及动物肾脏中提取纯化出了 -谷氨酰胺转肽酶如 Talaly 等最先从 Proteus vulgaris 中提取到-谷氨酰转肽酶并研究了其对谷胱甘肽的水解和转肽作用 [2-4] 人们还从腰果洋葱猪肾脏以及老鼠肾脏等动植物体内提取了该酶 -谷氨酰转肽酶在真核生物及原核生物体内分布不同具有一定的特异性在真 核生物中主要是以膜结合的酶形态存在如在人体或其他一些高等哺乳动物体内 它主要是结合在肾胰肝脾和小肠等组织的微绒毛膜上尤其是肾中含量最多 在原核生物中-谷氨酰转肽酶在不同菌属的细胞中分布的位置有所不同如在E coli K- 12 中主要存在于周质空间属于浆周酶而在Bsubtilis NX-2 中则可以分泌 [5-7] 到细胞外 -谷氨酰转肽酶分子结构特征 人们对-谷氨酰转肽酶的分子结构进行了研究通过对大量不同酶源的纯酶的分 析证实了它是异二聚体酶一般由大小两个亚基组成并且两个亚基结合时的转肽 [8] 活力远远高于单独亚基的活力 在不同生物体中它的分子量不同其小亚基相对分 子质量约在 21-25kDa 其大亚基相对分子质量约在46-65 kDa 范围内如洋葱的 - 谷氨酰转肽酶分子的大亚基相对分子质量为36-39 kDa[4] 香菇Bsubtilis NX-2 中的 分别约为60kDa43 kDa[69] -谷氨酰转肽酶的催化特性 不同来源的 -谷氨酰转肽酶具有相似的催化特性和专一性在酶学研究中 [1] Alton Meiste 等人 对-谷氨酰转肽酶的催化特性进行了总结指出-谷氨酰转肽酶只 对含-谷氨酰的化合物 如谷胱甘肽及其巯基衍生物L--谷氨酰-对硝基苯胺等 有 光学和立体专一性催化作用其在生物体内对氨基酸转运过程起重要的作用-谷氨 酰转肽酶可以催化以下三类反应当-谷氨酰转肽酶催化反应的受体是氨基酸 或二 肽时形成-谷氨酰氨基酸反应式?当-谷氨酰供体同时又是受体时就发 1 广东药学院硕士研究生学位论文 生自身转肽反应反应式?当亲核试剂是水时最终的结果为水解反应反应式 ? ?转肽反应Glutathione ，a min o acid êg ,glua min o acid ，Cys ,Gly ?自转肽反应Glutathione êg ,glu ,glutathione ，Cys,Gly ?水解反应Glutathione ，H 2 O êgluta min e ，Cys,Gly -谷氨酰转肽酶的催化作用受 pH 影响很大通常在 pH6-8 时是水解反应而 pH8-9 时为转肽反应其中来源于细菌的-谷氨酰转肽酶的转肽反应 pH 范围比较宽 [10] 在 pH60- 105 微生物酶催化转肽反应在酶催化合成-谷氨酰基化合物时有明显 的优点可以在pH 90 以上保持酶活性有效抑制水解反应 不同来源的-谷氨酰转肽酶对温度的耐受性不同在原核生物中-谷氨酰转肽酶 [611] 对较高温度没有耐受性 如Bsubtilis NX-2 的-谷氨酰转肽酶当温度达到60? 时经过短时间的保存酶活力基本丧失在真核生物中家蚕的-谷氨酰转肽酶分别 在50?和60?下水浴保存2h 后测其酶活性仍有原来的91和18除了温度影响 -谷氨酰转肽酶的活性外一些金属离子对它的活性也有影响如 Ca2和 Mg2对 - [12] 谷氨酰转肽酶的活力有促进作用这可能与该酶的活性中心的结构有关 -谷氨酰转肽酶应用 1-谷氨酰转肽酶在临床诊断方面的应用 -谷氨酰转肽酶是谷胱甘肽 GSH 代谢的关键酶之一并参与了氨基酸的跨膜转 运可特异性催化-谷氨酰基的转移反应人们对-谷氨酰转肽酶的早期研究局限于 [13] 该酶在GSH代谢中所起的作用 随着研究的深入人们对-谷氨酰转肽酶的催化功 能和分子结构有了更多的了解并发现其在临床上可作为肝胆疾病的生物标志被广 [14-15] 泛应用于肝病及其他脏器疾病的诊断和预后检测 高巧燕等对70例慢性乙型肝炎 CHB 和早期肝硬化 LC 患者血清-谷胺酰转肽酶 水平变化的特点进行了观察指出血清-谷胺酰转肽酶是判断肝脏炎症程度的一个非 [16] 常有价值的指标其活动度给临床判断CHB的炎症程度提供了重要的依据 孙浩仙 等通过选择112例长期饮酒者对其血清-谷氨酰转肽酶进行分析表明过量饮酒者引起 肝脏病变极其显著该酶的测定可作为酒精性肝损害的首选指标之一并且饮酒种类 [17] 和饮酒量与人血清-谷氨酰转肽酶活性成正比关系 近来研究表明血清-谷胺酰 转肽酶在其正常范围内是独立的心血管疾病的风险因子还能预示心脏疾病高血压 [18-20] 以及中风等疾病的发生和发展 2 广东药学院硕士研究生学位论文 2 -谷氨酰胺转肽酶在催化合成氨基酸衍生物方面的应用 近年来由于生物技术发展突飞猛进生物催化与生物转化技术在工业生产中逐 渐兴起利用-谷氨酰转肽酶制备系列-谷氨酰基类化合物的研究已成为生物催化领 域的热点已经报道利用-谷氨酰基化反应催化合成了谷胱甘肽茶氨酸等多种化 合物[621-22] 目前国内关于-谷氨酰基化反应的研究比较少尚处于起步阶段而日本 在医药食品行业已有应用-谷氨酰转肽酶的获得有动植物提取法和微生物发酵法 两种众所周知动植物体内的-谷氨酰转肽酶含量少提取工艺复杂所以以动植 物组织提取该酶的方法实现工业化的希望很小而微生物发酵法获得该酶就比较简 [23] 单产量也较高是-谷氨酰转肽酶应用于生物催化工业化生产的有利保障 目前 已报道的含有-谷氨酰转肽酶的细菌中枯草芽孢杆菌地衣芽孢杆菌以及基因 工程 菌被研究较多[612 24-26] 3 催化合成药物或药物前体 -D-谷氨酰-L-色氨酸 SCV-07 是一种新型的广谱免疫调节类化合物其作用类似 胸腺素alSCV- 07 在老鼠体内进行的实验已证实了它对抗肺结核病的生物活性现 在已进入II 期临床试验配合标准化学治疗在肺结核病的治疗中疗效显著利用常 规的多肽合成方法合成 SCV-07无论是固相合成或液相合成均需进行氨基酸的保 护及脱保护不仅合成成本高且易生成消旋体汪前等利用自行筛选的-谷氨酰转 肽酶高产菌株Bacillus subtilis NX-2 发酵产酶催化合成SCV-07分析了 该体系中的 [27-28] 主副反应以期进一步改善转肽反应效率为拓展此类反应的应用提供理论依据 7-氨基头孢烷酸7-ACA是生产头孢菌素的重要原料目前都由头孢菌素C 通 [29] 过化学法或生物酶法生产Aretz 等 利用-谷氨酰转肽酶的水解活性水解戊二酰-7- 氨基头孢氨酸制备7-ACA与化学法相比简化了生产过程提高了产品收率 此外Kenji 以及Hideyuki 等人分别利用来自 Penicillium roqueforti基因工程 菌 大肠杆菌 K- 12的-谷氨酰转肽酶以 L-谷氨酰胺为供体L-牛磺酸为受体 合 [30-31] 成了-谷氨酰-牛磺酸 4 改善某些氨基酸的苦味 在所有的氨基酸中某些L-型的芳香氨基酸 碱性氨基及有支链的氨基酸是带 有苦味的氨基酸其中有些苦味氨基酸是人体必需氨基酸当用这些氨基酸口服给药 [21] 时减低其苦味就是一个至关重要的问了直到 2002年Suzuki等 发现苯丙氨酸 3 广东药学院硕士研究生学位论文 芳香氨基酸 经-谷氨酰转肽酶催化L--谷氨酰化形成-谷氨酰-苯丙氨酸后不再有苦 味而变成了类似柠檬的鲜爽酸味这才使得改善氨基酸苦味的研究有了新的突破 5 催化合成谷胱甘肽和茶氨酸 还原型谷胱甘肽GSH是一种非常重要的氨基酸衍生物具有非常广泛的应用 前景早前日本人开发了一种很有应用价值的谷胱甘肽合成方法即利用 L--谷氨 酰转肽酶以 L-谷氨酰胺为供体以人工合成的二肽衍生物 S-苄基-L-半胱氨酰甘氨酸 甲酯为受体先合成谷胱甘肽的衍生物然后再经处理得到谷胱甘肽其L--谷氨酰 转肽酶对二肽衍生物的转化率可达 76 后来Kyowa 等公司在此基础上进行改进 采用固定化细菌 酶 以及在生产过程中添加 ATP 的方法生产谷胱甘肽这种方法使 转化率得到了提高但是在生产过程中添加 ATP 使得成本也相应的增高了目前 我国张鲁嘉等利用Bsubtilis NX-2 来生产该酶催化合成谷胱甘肽其中Bsubtilis NX-2 具有酶分离简单无需额外添加ATP 的优点这在微生物产酶发酵上有了一定的突破 [6] 和进展 茶氨酸是茶叶中含有的一种特殊的氨基酸1950 年日本学者首次从玉露茶中分离 得到其化学名称为N- 乙基--L-谷氨酰胺茶氨酸是一种独特的自由形式的氨基酸 茶氨酸有抑制苦味物质改善产品风味的作用可作为添加剂广泛应用于各种食品中 把它加入到水 咖啡 茶中能增加薄荷味减少辣味使味道更爽口茶氨酸在 [32] 医药方面也具有广泛的应用前景如其对心血管疾病有一定作用 可以增强抗癌药 [33-34] 物的疗效本身也具有抗肿瘤作用 松弛神经紧张焦虑以及镇静催眠等作用 抗疲劳提高免疫力提高记忆力预防病毒作用近年来人们发现茶氨酸还具有抑 [35-38] 制烟瘾的作用 总的来说茶氨酸具有广泛的应用价值和较好的实用前景但L-茶氨酸自然界含 量极少主要是从茶叶中提取成本高昂而其人工合成特别是微生物发酵合成一 直是人们研究的热点能催化底物合成茶氨酸的酶有多种其中人们对-谷氨酰转肽 酶催化合成茶氨酸研究较多2002 年 Suzuki 等首次报道-谷氨酰转肽酶可以将 L - [39] 谷氨酰胺上-谷氨酰基转移到乙胺受体上催化合成 L -茶氨酸 2007 年贾晓鹤等 将克隆的Escherichia coli K- 12 Ecoli K- 12 中的-谷氨酰转肽酶基因转入到原核表达 载体 pET28a 中构建了重组质粒pET28a 将重组质粒转化到 Ecoli BL21 中获得 工程菌利用基因工程菌产酶催化合成L-茶氨酸其生成量达到 269gLL-谷氨酰 4 广东药学院硕士研究生学位论文 胺的转化率为578[24] 近年来本实验室获得一株 -谷氨酰转肽酶高产菌株 Bacillus licheniformis C12 菌株并首次将地衣芽孢杆菌的产酶系统和嗜热脂肪芽孢杆菌ATP 供能系统相偶联建 立了一种种间偶联ATP 再生技术生产茶氨酸采用该技术进行茶氨酸转化生产茶氨 酸产量达到35gL谷氨酰胺转化为茶氨酸的转化率为59为工业化生产茶氨酸 奠 [12] 定了基础 com 酶固定化技术 酶固定化技术的发展 酶的固定化技术是现代生物技术及其工业化环节中的一个核心技术固定化酶的 研究始于20 世纪50 年代迅速发展于20 世纪60 年代后期1969 年日本的千畑一 郎首次在工业生产规模应用固定化氨基酰化酶从 DL-氨基酸连续生产 L-氨基酸实 现了酶应用史上的一大变革此后固定化技术迅速发展促使酶工程作为一个独立 的学科从发酵工程中脱颖而出1971 年在第一届国际酶工程正式定义建议采用固 定化酶immobilized enzyme 的名称我国的固定化酶研究开始于 1970 年首先 是微生物所和上海生化所同时开始了固定化酶的研究此后许多单位相继进行了固 定化酶和固定化细胞的应用研究 固定化酶的优缺点 固定化酶是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内仍能进行其特有的催化反 应并可回收及重复利用的一类技术酶经过固定化后可以基本保持酶的完整的空 间结构和活性中心所以能够在一定的空间范围内进行催化反应但是由于受到载体 的影响酶的结构发生了某些改变从而使酶的催化特性发生某些改变 与游离酶相比固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时又 克服了游离酶的不足?容易将固定化酶和底物产物分开?可以在较长时间内进 行反复分批反应和装柱连续反应?在大多数情况下能够提高酶的稳定性?酶反 应过程能够加以严格控制?产物溶液中没有酶的残留简化了产物的提取纯化工艺 ?比游离酶更适于进行多酶反应?可以增加产物的收率提高产物的质量?酶的 使用效率提高成本降低 与此同时固定化酶也存在一些缺点?固定化时酶活力有损失?只能用于 可溶性底物而且适于小分子底物对于大分子底物不适合?与完整菌体相比不适 5 广东药学院硕士研究生学位论文 [40-42] 宜于多酶反应特别是需要辅助因子的反应?胞内酶必须经过酶的分离过程 固定化酶技术的应用 固定化酶几乎在各领域都有它的特殊用途在食品制药等轻工化工领域的一 些用途不胜枚举它在工业的各个方面都显示出广阔的应用前景如固定化酶在食品 医药方面的工业化应用氨基酰化酶这是世界上第一种工业化生产的固定化酶1969 年日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离得到的氨基酰化酶用 DEAE-葡聚糖凝 胶为载体通过离子键结合法制成固定化酶用来拆分 DL- 乙酰氨基酸连续生产 L-氨 基酸葡萄糖异构酶这是世界上生产规模最大的一种固定化酶将培养好的含葡萄 糖异构酶的放线菌细胞用 60-65?热处理 15min该酶就固定在菌体上制成固定化 [4143] 酶催化葡萄糖异构化生产果糖用于连续生产果葡糖浆 随着固定化技术的发展将会有更多的固定化酶应用于各种领域中充分发挥固 定化酶的优势 12 立题背景及研究目的和意义 茶氨酸是一种安全无毒具有多种生理功能的天然食品添加剂近年来随着 对茶氨酸生理功能和医药价值的研究发现茶氨酸将在医疗保健食品饮料等领 域被广泛应用同时促进了人们对茶氨酸制备方法的研究 目前茶氨酸的主要制备途径有化学合成法植物组织培养法天然茶氨酸的 提取分离法及微生物发酵制备法化学合成法存在有污染有毒性和直接得到的产品 为DL-型消旋体需进行DL-型拆分等缺点而植物组织培养法生产茶氨酸存在生 产条件苛刻周期长产量低等缺点近年来随着生物技术的发展和应用利用微 生物发酵生产茶氨酸弥补了以上方法的不足此方法主要是微生物发酵产酶利用酶 催化底物生产茶氨酸主要用到的酶有谷氨酰胺酶谷氨酰合成酶以及-谷氨酰转肽 酶随着人们对-谷氨酰转肽酶催化机理及分子结构研究的不断深入利用-谷氨酰 转肽酶制备系列-谷氨酰基类化合物的研究已成为生物催化领域的热点 本实验室首次将 Bacillus licheniformis C12 菌株的产酶系统和嗜热脂肪芽孢杆菌 ATP 供能系统相偶联建立了一种种间偶联ATP 再生技术生产茶氨酸采用该技术进行 茶氨酸转化生产茶氨酸产量达到35gL谷氨酰胺转化为茶氨酸的转化率为59 并以卡拉胶作为载体进行了菌体细胞固定化生产茶氨酸 用菌体细胞作为酶源催化底物生产茶氨酸可以得到茶氨酸含量较高的转化液 6 广东药学院硕士研究生学位论文 但因大量的菌体细胞存在于转化液中给茶氨酸的分离提取带来一些困难且该酶属于 可溶性酶在催化底物转化生产茶氨酸过程中溶于转化液中发酵得到的酶不能重复 使用这就增加了生产成本固定化细胞在一定程度上弥补了直接用菌体作为酶源的 一些不足可以多次重复使用但固定化的细胞在使用一定时间后常常会发生自溶 尤其是在细胞可能进行增殖时细胞的漏出就特别明显并常常伴有副反应同样影 响转化液中茶氨酸分离提取 基于以菌体细胞作为酶源以及细胞固定化的优缺点本课题研究了本实验 室的保 藏菌株Bacillus licheniformis C12 所产的-谷氨酰转肽酶的部分酶学性质并以海藻 酸钠为载体将 -谷氨酰转肽酶固定化应用于茶氨酸的生产不仅结合了海藻酸钠 原料无毒廉价易得的优点同时也具备了固定化酶的各种特性使得产物与酶易于 分离回收可以连续生产反复使用可望降低生产成本具有良好的经济效益和应 用价值 13 主要研究内容 针对生物催化法生产茶氨酸的实际意义以及Bacillus licheniformis C12 菌株中含 有大量-GTP 的特点选用Bacillus licheniformis C12 菌株作为制 备-GTP 的菌种来 源主要开展了以下几个方面的工作 1 产酶发酵的诱导考察-GTP 酶活与发酵时间及茶氨酸产量的关系同时进一步 考察底物甘氨酸谷氨酰胺及谷氨酸三种诱导剂及其不同浓度对菌体细胞 -GTP 的诱导作用 2 酶提取及酶学性质研究对几种菌体细胞的破碎方法即超声波法冻融法及溶 菌法进行对比研究优化-GTP 的提取工艺提取到的粗酶液通过高速冷冻离心 硫酸铵分级沉淀及透析脱盐一系列步骤初步纯化制备 -GTP 并对其酶学特性进 行了研究主要包括最适pH最适温度及该酶对温度酸碱的耐受性以及部 分金 属离子对该酶活性影响等 3 固定化酶制备及催化条件研究比较琼脂粉卡拉胶及海藻酸钠作为固定化酶载 体优缺点选择较佳的固定化载体确定固定化酶制备方法及优化固定化酶工艺 条件并研究固定化酶的酶学性质主要包括比较游离酶与固定化酶的最适pH 最适温度及对温度酸碱的耐受性探讨底物浓度金属离子Mn2 Ca2 Mg2 FDP 发酵液对固定化酶催化合成茶氨酸的影响优化固定化酶催化谷氨酰胺及乙 7 广东药学院硕士研究生学位论文 胺盐酸盐合成茶氨酸的工艺条件并探讨其连续化生产茶氨酸的可行性 14 技术路线 产酶发酵 诱导剂甘氨酸谷氨酰胺谷氨酸对产 酶发酵的影响 物理法超声波法反复冻融法 细胞壁的破碎 生物化学法溶菌酶法 γ-GTP的提取 冷冻高速离心硫酸铵盐析 及初步纯化 反应最适温度最适pH该 酶学性质检测 酶对温度pH的稳定性以及 转肽反应的米氏常数 制备固定化酶的载体选择海藻酸钠 卡拉胶以及琼脂 固定化酶产茶氨 酸 检测固定化酶的部分酶学性质 提高 茶氨酸产量调整底物浓度反应温 度pH以及添加酶促进剂 检测茶氨酸的产 量 8 广东药学院硕士研究生学位论文 第二章 产酶发酵的诱导条件研究 影响菌体生长和酶生物合成的因素很多本实验室根据Bacillus licheniformis C12 菌株的生长特性已对其所处环境条件包括培养基pH发酵时间接种量装液 量等因素进行了考察并初步制定了产酶工艺条件 为了进一步优化该产酶工艺条件提高原有的产酶发酵水平本章主要探索了底 物甘氨酸谷氨酸及谷氨酰胺三种不同诱导剂及其不同浓度对菌体产酶的影响期望 进一步提高菌体酶活力以优化该产酶发酵工艺条件并为今后的酶提取及固 定化酶 生产茶氨酸奠定基础 21 实验材料与方法 com 实验材料 菌种 地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis C12 由本实验室筛选获得 培养基 斜面培养基磷酸氢二钾 05g柠檬酸铁铵05g硫酸镁05g甘油20gL-谷 氨酸4gL-茶氨酸4g琼脂12g蒸馏水配至1000m1pH74 0068Pa 灭菌20min 种子培养基胰蛋白胨 10g酵母浸出物5g氯化钠10g蒸馏水配至1000m1 pH70 0068Pa 灭菌20min 基础发酵培养基胰蛋白胨5g酵母浸出汁5g葡萄糖l0g硫酸铵1g磷酸二 氢钾3g磷酸氢二钠171g氯化钠05g蒸馏水配至1000m1 pH72 0068Pa 灭 菌20min 主要仪器 立式压力蒸汽灭菌锅YXQ-LS-75SH 上海博迅实业有限公司 752 紫外可见分光光度计 上海著华科技仪器有限公司 净化工作台SW-CJ-IF 苏州净化设备有限公司 低速大容量离心机DL-5 上海安亭科学仪器厂 水浴恒温振荡器THZ-82 江苏金坛市宏华仪器厂 电热恒温培养箱 广州医疗设备厂 冰箱BCD-257SL 海尔公司 9 广东药学院硕士研究生学位论文 精密pH 计 PHS-3C 上海精密科学仪器有限公司 全温振荡器QW-A 江苏金坛市宏华仪器厂 主要试剂 谷氨酸 北京普博欣生物科技有限责任公司 谷氨酰胺 北京普博欣生物科技有限责任公司 甘氨酸 北京普博欣生物科技有限责任公司 -谷氨酰对硝基苯胺 sigma 公司 双甘肽 sigma 公司 主要试剂配制 -谷氨酰基转肽酶 -GTP 酶活力测定所需试剂 ?0lmolL Tris-HCl 缓冲液的配制准确称取12llg Tris 溶于800m1 水加入42m1 浓盐酸调pH 至80然后加水定容至1000m1 ?01molL 双甘肽配制准确称取132g 双甘肽溶于80m1 水用2molLNaOH 将pH 调至80最后用水定容至100m1将此溶液分装20m1瓶储存于-20?能 保存3 个月 ?5mmol L L--谷氨酰对硝基苯胺的配制80mg L--谷氨酰对硝基苯胺加入到 20m1 lmolL HCl 中25 ?搅动一直至成分溶解为止然后加入30m1 水073g Tris 用2molL HCl 将pH 调至80最后将溶液定容至60m1 分装l0ml瓶置于-20?冰 箱每次使用前55?水浴使其溶解 com 实验方法 -GTP 酶活力测定[1] 原理-GTP 催化底物-谷氨酰基对硝基苯胺的-谷氨酰基转移至双甘肽生成对 硝基苯胺对硝基苯胺在410nm 处有特殊吸收据此特性测定反应生成的对硝基苯胺 浓度来衡量-GTP 的活力 具体方法 从已培养好的地衣芽孢杆菌斜面接一环于种子培养基 300mI 的三角瓶装液量 为1030?240rpm 摇床培养从培养好的种子培养物中按 10的接种量接种 于发酵培养基中300m1 的三角瓶装液量为1030?240rpm 摇床培养取培 养好的发酵培养物5000rpm 离心 10min用灭菌水洗涤菌体再次 5000rpm 离心 10 广东药学院硕士研究生学位论文 10min收集菌体用灭菌水将菌体稀释一定倍数 ?取2m1 工作液 0 lmolL Tris-HCl 12m1 01 molL 双甘肽04m15mmolL L-- 谷氨酰基对硝基苯胺04m1和菌液10ml加入离心管中混匀37?反应30min II取2m1 工作液和不产-GTP 的其它细菌的菌液 菌体处理方法同上l0ml37? 反应30min于410nm 波长处调零 ?将反应好的待测液于410nm 波长处测定其吸光值37?该条件下每分钟产生1 微摩尔的对硝基苯胺所需的酶量定义为一个酶活单位由公式 ?A min ×Vt ×1000 ×10 g ,GTP U L 可计算出-GTP 活性大小 e ×Vs ×d ?Amin每分钟吸光度变化率 Vt 反应总体积ml Vs 样品体积 ml 1000由Uml 转变为UL 的变化因数 10 稀释倍数 e对硝基苯胺在410nm 波长处微摩尔吸光系数 d 比色杯光径cm 种子培养 用接种环取一环活化的斜面菌体于种子培养基中300ml 的摇瓶装液量 10 于30?240rpm 振荡培养16h 后结束并接入发酵瓶中 不同诱导剂对发酵液中细胞-GTP 诱导作用 菌体斜面培养基种子培养基以及发酵培养基的基本成分不变在300ml 的三角 瓶中装液量为10按10的接种量进行接种于30?240rpm培养 甘氨酸对-GTP 的诱导研究分别在产酶发酵22h24h26h28h30h 后加入 10molL 045ml 甘氨酸诱导2h结束发酵并检测酶活性 不同浓度的甘氨酸对-GTP 的诱导作用在产酶发酵24h 时在30ml 发酵液中 分别添加10molL 甘氨酸015ml045ml060ml075ml090ml105ml 诱导2h 后检测酶活性 不同浓度的谷氨酸对-GTP 的诱导作用在产酶发酵24h 时在30ml 发酵液中 分别添加10molL 谷氨酸015ml045ml060ml075ml090ml 诱导2h 后检测酶 活性 11 广东药学院硕士研究生学位论文 不同浓度的谷氨酰胺对-GTP 的诱导作用在产酶发酵24h 时在30ml 发酵液中 分别添加10molL 谷氨酰胺003ml015ml030ml045ml06ml075ml090ml 诱导2h 后检测酶活性 22 实验结果与分析 com 甘氨酸对-GTP 的诱导研究 图2- 1 中显示分别选择在产酶发酵22h24h26h28h30h 后添加诱导剂甘 氨酸诱导2h对-GTP 酶活力有不同的影响其中产酶发酵24h 时添加甘氨酸诱导 效果较好酶活力为52Uml相对对照组 对照组酶活力34Uml 提高了558 因此选择在产酶发酵24h 后添加诱导剂诱导2h用于以后的诱导试验 7 1l 6 - m ? 5 U 4 对照组 力 3 甘氨酸诱 导2h 活 2 酶 1 0 24 26 28 30 32 产酶发酵时间h 图2- 1 甘氨酸诱导时间对-GTP 酶活力影响 com 不同浓度的甘氨酸对-GTP 的诱导作用 图2-2 中显示甘氨酸终浓度在5 mmolL15 mmolL20 mmolL25 mmolL 30 mmolL35 mmolL时对-GTP 酶活力都有一定的诱导作用相比其它处理浓度 甘氨酸终浓度为 20mmolL 时酶活力最大为 58Uml相对对照组 对照组酶 活力 32Uml 提高了813优于其它处理浓度表明甘氨酸终浓度为20mmolL 时对 -GTP 酶活力影响较大 P 0001 12 广东药学院硕士研究生学位论文 70 60 l m 50 U y t i 40 v i t c a 30 e m y 20 z n E 10 00 control 50 150 200 250 300 350 Gly conc mmolL 图2-2 甘氨酸浓度对-GTP 酶活力影响 P 001P 0001 vs control com 不同浓度的谷氨酸对-GTP 的诱导作用 图2-3 中显示谷氨酸终浓度在5 mmolL15 mmolL20 mmolL25 mmolL 30 mmolL 时对-GTP 酶活力都有一定的诱导作用相比其它处理浓度谷氨酸 终浓 度为20mmolL 时酶活力最大为51Uml相对对照组 对照组酶活力32Uml 提 高了594优于其它处理浓度表明谷氨酸终浓度为20mmolL 时对-GTP 酶活力 影响较大 P 001 60 l 50 m U 40 y t i v i t 30 c a e m 20 y z n E 10 00 control 50 150 200 250 300 Glu conc mmolL 图2-3 谷氨酸浓度对-GTP 酶活力影响 P 005P 001 vs control com 不同浓度的谷氨酰胺对-GTP 的诱导作用 13 广东药学院硕士研究生学位论文 图 2-4 中显示谷氨酰胺终浓度在 10 mmolL50mmolL100 mmolL 150mmolL200 mmolL250mmolL300mmolL 时对-GTP 酶活力都有一定的 诱导作用其中谷氨酰胺终浓度为 50mmolL 时-GTP 酶活力为 70Uml是对 照 组对照组酶活力31Uml的226 倍优于其它处理浓度 8 l m 6 U y t i v i t 4 c a e m y z 2 n E 0 control 10 50 100 150 200 250 300 Gln conc mmolL 图2-4 谷氨酰胺浓度对-GTP 酶活力影响 p 005 P 0001 vs control 23 本章小结 诱导试验结果表明甘氨酸谷氨酸及谷氨酰胺三种诱导剂对产酶发酵生 产-GTP 均有诱导作用其中较好的诱导剂是谷氨酰胺即在产酶发酵24h 后添加谷氨 酰胺至 终浓度5mmolL诱导2h 后检测-GTP 酶活力其酶活力为70Uml是对照组对 照组酶活力为31Uml的226 倍 14 广东药学院硕士研究生学位论文 第三章-谷氨酰转肽酶的提取及其酶学性质的研究 -谷氨酰转肽酶-GTP 广泛存在于动物植物微生物体中是谷胱甘肽 GSH 代谢的关键酶之一并参与了氨基酸的跨膜转运可特异性催化-谷氨酰基的转移反 应尽管酶的功能相似但因来源不同的酶在生物体内分布不同且蛋白质序列 及空间 [644] 构象上有很大不同因此在酶学性质上也表现出一定差异 本章对本实验室的保藏菌株Bacillus licheniformis C12 所产的-GTP 进行提取采 用硫酸铵盐析法对其初步纯化并检测该酶的酶学性质为今后对该酶的固定化生产 茶氨酸的研究奠定基础 31 实验材料与方法 com 实验材料 菌种 地衣芽孢杆菌 Bacillus licheniformis C12 培养基 斜面培养基种子培养基发酵培养基com 主要仪器 高速冷冻离心机KDC-220HR 科大创新股份有限公司中佳分公司 玻璃层析缸P- 1 上海禾汽化工科技有限公司 磁力加热搅拌器HJ-4 金坛市宏华仪器厂 com 主要试剂 溶菌酶 上海源聚生物科技有限公司 牛血清白蛋白 北京普博欣生物科技有限责任公司 考马斯亮蓝G-250 天津市科密欧化学试剂有限公司 磷酸 天津市百世化工有限公司 硫酸铵 天津市福晨化学试剂厂 茶氨酸 sigma 公司 冰醋酸 天津百世化工有限公司 茚三酮 天津市大茂化学试剂厂 15 广东药学院硕士研究生学位论文 正丁醇 上海润捷化学试剂有限公 司代理 com 主要试剂配制 [12] 转化体系 30ml 转化液谷氨酰胺和盐酸乙胺分别为034molL12molL在 180rpm30?下反应48h 1 考马斯亮蓝G-250 染色液配制考马斯亮蓝G-250 溶于50ml 95 乙醇中加 入100ml 85H PO 用双蒸水稀释至1000ml滤纸过滤 3 4 [12] 2 茚三酮显色法检测茶氨酸所需要的试剂 pH80 磷酸盐缓冲液 a115molL 磷酸氢二钠称取2389g 磷酸氢二钠加水溶解后定容至100mL b 115molL 磷酸二氢钾称取0907g 磷酸二氢钾加水溶解后定容至100mL 取a 溶液95 mL 和b 溶液5 mL混匀 2 茚三酮溶液 称取20g 水合茚三酮 纯度不低于99加水50mL 和氯化亚锡008g搅拌均匀放 在暗处静置一昼夜过滤后加水定容至100mL 5茚三酮溶液 称取50g 水合茚三酮 纯度不低于99 加水80m1 和氯化亚锡02g搅拌均匀放 在暗处静置一昼夜过滤后加水定容至100mL 展开剂将正丁醇冰醋酸水按体积4 11 的比例混合展开之前饱和30min 以 上 洗脱剂60乙醇 com com 实验方法 蛋白质含量的测定[45] 采用Bradford 检测法标准蛋白为牛血清白蛋白 茶氨酸含量的测定[46] 茶氨酸的定性测定方法纸层析分离法 茶氨酸的定量测定方法纸层析萃取分光光度法 1 纸层析法由于不同的氨基酸在展开剂 正丁醇冰醋酸水 4 11 中移动 16 广东药学院硕士研究生学位论文 的速度不同最后氨基酸在层析纸上的位移不同展开完毕后用05的茚三酮显色 根据标准品茶氨酸的位置以及点的大小比对样品中茶氨酸的浓度 方法取20 cm×20 cm 层析纸点样4μl点样浓度为10 mgml15 mgml20 mgml 25 mgml30mgml 茶氨酸标准品样品点样线距离层析纸底部20cm样点距离 为25cm点样完毕后用浓氨水熏蒸5min后拿出滤纸用吹风除尽纸上氨气再放入 层析缸中置于 30?烘箱中在恒温条件下展开至距层析纸上端 4cm 处取出后烘 干为了达到较好的分离效果单向层析往往需要二次展谱即第一次层析后取出 滤纸晾干再与第一次操作一样重新展谱一次前后二次溶剂前沿一致取出烘干后 均匀地喷洒05茚三酮显色剂置于60 ?的烘箱中烘30min烘毕取出滤纸用铅 笔依次将色谱斑点圈出 2 纸层析萃取分光光度法 ?点样点样方法同上在第二次展开完毕后取出风干 ?洗脱取出风干后将茶氨酸标准品剪下用 05 茚三酮显色后对照茶氨 酸的Rf 值将其余样点茶氨酸相应的位置剪下至于25m1 容量瓶中用 l0ml 60 的乙醇在35?下洗脱20min ?显色及测定取出冷却后分别加入4m1 蒸馏水05m1 2茚三酮05m1 pH80 磷酸盐缓冲液在100?的水浴锅中反应15min冷却后加水定容至25m1 放置l0min 用lcm 比色杯在570nm 处以不含茶氨酸的溶液为空白测定吸光度将测得的吸 光度与茶氨酸标准曲线对照并查出样品的浓度 菌体细胞破碎方法比较 反复冻融法取培养好的发酵培养物4800rpm 离心10min 用pH80 TE Tris-HCl 缓冲液 pH8001mmolL 洗涤菌体再次 4800rpm 离心 10min弃上清用一定 量的pH80 TE 重悬菌体至于-20?冰箱中冷冻6h-7h再将其取出在室温中解冻反 复操作几次后离心4800rpm30min收集上清液并测定-GTP 酶活力 超声处理法取培养好的发酵培养物4800rpm 离心10min用pH80 TE 洗涤菌 体再次4800rpm 离心10min弃上清用一定量的pH80 TE 重悬菌体在冰浴条件 下用超声细胞粉破碎机破碎细胞 600W20min 离心4800rpm30min 收集上清 液并测定酶活力 [45] 溶菌酶法 取培养好的发酵培养物离心4800rpm10min弃上清液每 17 广东药学院硕士研究生学位论文 克湿菌体加入10ml TE 缓冲液重悬菌体在 25?水浴条件下加入溶菌酶每克 湿菌体 25mg 溶菌酶反应30min 后4800rpm 离心30min收集上清液测定-GTP 酶活 力 革兰染色试剂配制[12] ?结晶紫染液 A结晶紫025g 研磨后加95的乙醇2m1 然后再加入蒸馏水定容至100m1 B碳酸钠125g 溶于蒸馏水100m1 ?革兰碘液氢氧化钠10g 溶于25m1 蒸馏水中加碘20g 和碘化钾40g再加 蒸馏水至100m1边加边搅使之均匀混合保存于棕色瓶中 ?脱色液丙酮30m1 加入95乙醇70m1混匀即可 ?复染液沙黄25-30g 加入95乙醇l0ml溶解后加蒸馏水至100m1 硫酸铵梯度的选定 一定量的硫酸铵在冰水浴中匀速搅拌下缓慢加入到-GTP 的粗酶液 20ml总酶活 585U 中至饱和度为50继续搅拌30min10000rpm 离心 20min沉淀用1ml pH80 TE 复溶并离心6000rpm 10min 去除变性蛋白质检测此上清液中蛋白含量和酶活 力相同方法在上清液中继续添加硫酸铵至饱和度分别为 60708090 100 -GTP 粗酶的酶学性质测定 酶对温度的耐受性以TE pH 80 为缓冲液不同温度下保存20min 测定酶活 力 酶对 pH 的耐受性pH20 采用 Na HP0 柠檬酸缓冲液pH40 pH50 采用 2 4 NaAc-HAc 缓冲液pH70 采用磷酸盐缓冲液pH80 pH90 采用Tris-HCl 缓冲液 pH110 pH130 采用甘氨酸-NaOH 缓冲液在25?下保存30min测定酶活力 酶的最适温度以TE pH 80 为缓冲液分别在不同温度下测定酶活力 酶的最适pH pH20 采用Na HP0 -柠檬酸缓冲液pH40 pH50 采用NaAc-HAc 2 4 缓冲液pH70 采用磷酸盐缓冲液pH80 pH90 采用Tris-HCl 缓冲液pH110 pH130 采用甘氨酸-NaOH 缓冲液采用酶活测试方法检测酶活力 金属离子对酶活力的影响在反应体系中分别加入各种金属离子终浓度均为 5mmolL采用酶活测试方法检测酶活力 米氏常数Km 测定 18 广东药学院硕士研究生学位论文 -GTP 的底物为谷氨酰胺和盐酸乙胺为了简化-GTP Km 的检测将盐酸乙胺 浓度设定为10molL 远远大于谷氨酰胺浓度可视-GTP 为单一底物酶反应体系中 谷氨酰胺浓度分别为05 molL10 molL15 molL20 molL25 molL分别取 上述溶液10ml 以及10ml05Uml 酶液于各试管中在37?条件下反应10min 后 根据茶氨酸的检测方法以及茶氨酸标准曲线查看转化液中茶氨酸浓度再根据 Lineweawer-Burk 双倒数作图法估算-GTP 转肽反应的Km 值 32 实验结果与分析 com 标准曲线 蛋白质含量标准曲线 采用Bradford 检测法以蛋白含量 μg 为横坐标相应的吸光度A595 为纵坐标 制作标准曲线结果如图3- 1 中显示吸光度在00410410 之间呈良好的线性 关系 2 回归方程为y 003x-00269 R 09958 0500 y 003x - 00269 5 0400 2 9 R 09958 5 A 0300 度 光 0200 吸 0100 0000 00 50 100 150 200 蛋白质含量μg 图3- 1 蛋白质含量标准曲线 茶氨酸浓度标准曲线 从图3-2 可以看出茶氨酸浓度在10300gL 范围内与吸光度A 呈线性关 系线 2 性回归方程为y 00063x 00226 R 09991 当样品中茶氨酸浓度过高 时可以将 其稀释到10300gL 之间使检测结果间保持良好的线性关系有利于结果的比 较 19 广东药学院硕士研究生学位论文 03 y 00063x 00226 02 2 R 09991 0 7 5 02 A 度 光 01 吸 01 00 00 50 comcom0 -1 标准茶氨酸浓度g?L 图3-2 茶氨酸浓度标准曲线 com 不同来源的-GTP 催化生产茶氨酸的比较 在相同的茶氨酸转化体系中分别加入来源于小鼠肾脏以及来源于本实验室保藏 菌株Bacillus licheniformis C12 的-GTP 其总酶活力相同经过48h 催化反应后取 样检测茶氨酸发现此条件下来源于小鼠的-GTP 几乎不合成茶氨酸而来源于该菌 株的-GTP 则可以催化底物合成茶氨酸并可以达到15gL com 对Bacillus licheniformis C12 菌株-GTP 研究 菌体细胞破碎方法比较 反复冻融法一方面使细胞膜的疏水键结构破裂另一方面胞内水结晶使细胞 内外溶液浓度变化引起细胞膨胀而破裂 超声波法在超声波的作用下液体发生空化作用空穴的形成增大和闭合产生 极大的冲击波和剪切力使细胞破碎 溶菌酶法又称胞壁质酶是一种能水解细菌中黏多糖的碱性酶主要通过破坏 细胞壁中的N- 乙酰胞壁酸和N- 乙酰氨基葡糖之间的- 14 糖苷键使细胞壁不溶性黏 多糖分解成可溶性糖肽导致细胞壁破裂内容物逸出而使细胞溶解 20 广东药学院硕士研究生学位论文 图3-3 菌体形态 A 产酶发酵26h 收集到的菌体形态 B 反复冻融5 次后菌体形态 C 超声后菌体形态 D 溶菌酶作用后 菌体形态 表3- 1 不同菌体细胞破碎方法的比较 方法 酶活力 Uml 蛋白含量mg ml 比活力 Umg 反复冻融法 0448 0152 295 超声处理 0272 106 0257 溶菌酶法 0515 132 390 图3-3 所示A 图中产酶发酵收集到的菌体 原始菌为革兰阳性菌且体 积较大 经过反复冻融菌体细胞壁的破损导致通透性增加经革兰染色后为革兰阴性 菌B 图体积小于原始菌C 图D 图中几乎不存在完整的菌体油镜条件下 从表 3- 1 中可以看到溶菌酶法得到的上清液酶活力最大为0515Uml是反复冻 融法处理酶活力的 115 倍是超声处理的 189 倍溶菌酶法得到的粗酶液比活力最 21 广东药学院硕士研究生学位论文 大反复冻融操作简单但费时扩散慢超声处理操作简单但酶易失活且大容量时 声能不易传递不易散热溶菌酶法条件温和反应迅速且得到的粗酶液比活力最大 综合比较后选择溶菌酶法作为菌体细胞破碎方法并对溶菌酶破碎细胞的条件选择 做了进一步研究主要考察了温度和时间对溶菌酶破碎细胞的影响 1 1l 08 - m ? 06 U 04 25? 35? 力 02 45? 活 0 酶 10 20 30 -02 -04 时间min 图3-4 溶菌酶溶菌时间和温度对破碎细胞的影响 从图3-4 中可知溶菌酶在45?作用时随着时间的延长-GTP 酶活力越来越低 溶菌酶作用30min 时酶活力基本消失这可能是因温度过高酶在此温度下不稳定 35?条件下作用20min 后酶活力达到最大09Uml相比10min 提高了约21 而 25?条件下溶菌酶对菌体细胞作用比较缓慢从酶活损失以及试验时间方面考虑 在以后的实验中选择菌体细胞破碎条件为每克湿菌体 25mg 溶菌酶在 35?下酶解 20min 硫酸铵浓度的选择 盐析是指在体系中加入高浓度的中性盐如硫酸铵破坏蛋白质表面的水化层 中和蛋白质的表面电荷从而达到蛋白质粗分的目的不同的蛋白质在不同饱和度的 硫酸铵溶液中形成沉淀因此选择合适的硫酸铵梯度可以有效的将体系中的蛋白作初 步纯化 22 广东药学院硕士研究生学位论文 表3-2 硫酸铵对-GTP 沉降的影响 硫酸铵饱和度 蛋白含量 总酶活 比活力 -2 - 1 mgml Uml ×10 U mg 50 9981 0739 740 60 1436 0194 1351 70 1508 0344 2280 80 1248 1056 8457 90 0639 0586 9165 100 0367 0316 886 表 3-2 中显示硫酸铵饱和度为8090时沉淀蛋白的比活力较大饱和度 低于90时蛋白比活力随着硫酸铵饱和度增加而增加大于90时则相反从析出 蛋白的比活力这个角度出发硫酸铵饱和度为 80-90时粗酶液中析出的蛋白 大部分 为-GTP 因此选择80-90为饱和硫酸铵梯度沉降分离的梯度 酶对温度的耐受性 不同的蛋白质对温度的耐受性不同有些蛋白对温度特别敏感在常温下也无法 保存但多数蛋白可以在常温下长期保存这对工业生产特别有利蛋白质在较高的 温度下空间构象会发生改变以致酶活性发生改变对于酶蛋白来说最直接的变性 后果就是酶活力的丧失-GTP 对温度的耐受性如图3-5 23 广东药学院硕士研究生学位论文 6 5 l m U 4 y t i v i t 3 c a e m 2 y z n E 1 00 con 25 30 35 40 45 50 55 60 Q ? 图3-5 -谷氨酰转肽酶对温度的耐受性 由图3-5 可知-GTP 对40?及以上温度的耐受性较差当温度达到50?时经 过短时间的保存酶活力基本丧失但在 25-35?的温度范围有较好的稳定性特别是 在常温下经过20min 的保藏酶活力基本未变因此该