兔巴氏杆菌-波氏杆菌二联蜂胶疫苗的研制及安全、效力试验
兔巴氏杆菌-波氏杆菌二联蜂胶疫苗的研制及安全、效力试验 文章标题:兔巴氏杆菌-波氏杆菌二联蜂胶疫苗的研制及安全、效力试验
兔巴氏杆菌-波氏杆菌二联蜂胶疫苗的
研制及安全、效力试验
兔多杀性巴氏杆菌病(Pm)和兔支气管败血波氏杆菌病(Bb)是家兔的两种主要细菌性传染病,它们传播迅速,一旦在兔场暴发流行,很难根除,经济损失惨重。进行疫苗接种是预防这两种疾
病的最有效的措施。免疫原性好的菌(毒)种和良好的免疫佐剂是保证疫苗免疫效力的必要条件。因此,在Pm和Bb基础菌种研究的基础上,对蜂胶的提取工艺进行了研究,选取了蜂胶乙醇提取液的水溶物作为佐剂,研制疫苗,并进行了疫苗的安全及效力试验。现将该研究结果报告如下。
1材料与方法
1.1仪器及材料
1.1.1菌种兔多杀性巴氏杆菌Pm90株(对家兔的致死剂量为8-10个活菌,对小鼠的致死剂量为100个活菌);兔支气管败血波氏杆菌Bb82株(对小鼠的致死剂量为1×107个活菌,对家兔的致病剂量为1×108个活菌)。
1.1.2试验动物不同日龄的健康大耳白兔
1.1.3培养基含3小牛血清的马丁琼脂平板(SMS)、马丁肉汤(MB)、硫乙醇酸盐培养基(T.G)、酪胨琼脂(G.A)、葡萄糖蛋白胨汤(G.P)等。
1.1.4细胞瓶
1.1.5蜂胶
1.1.6仪器GQ(F)—75管式分离机、索氏回流装置、温控式旋转蒸发器
1.2试验方法
1.2.1Pm90菌液的制备及检验
1.2.1.1一级种子的繁殖与鉴定用灭菌生理盐水适当稀释Pm90株第9代冻干菌种,接种于0.1绵羊血红素的马丁琼脂平板(BMS)上,37?培养18h,然后选取5-10个典型菌落,分别接种于10绵羊鲜血琼脂斜面若干,同上培养后,作为一级种子。在4?保存,可使用7日。继代次数不超过3代。
1.2.1.2二级种子的繁殖及鉴定将Pm90株一级种子接种于适量马丁肉汤中,置37?振荡培养18h,取样用SMS培养基作纯粹检验;置4?保存,可使用3日。
1.2.1.3制苗用菌液的培养将Pm90株二级种子接种于SMS培养基,37?培养18h,无菌水洗下菌苔,取样做纯粹检验,同时用平板菌落计数法计算菌液浓度,将菌液浓度调整为200×108个/ml。
1.2.1.4菌液的灭活加入0.4的甲醛溶液于菌液中,容器密封后,37?灭活48h,其间振摇6-8次,然后进行灭活检验。本研究灭活检验及无菌检验用的培养基为:SMS、T.G、G.A和G.P。置37?条件下培养48h,无细菌生长说明已完全灭活。
1.2.1.5菌液的离心、冻融灭活检验合格的菌液用管式分离机离心除去甲醛,无菌刮下菌苔,用等量的灭菌生理盐水配成原浓度的菌液。小量分装后反复冻融3次,再次进行无菌检验。
1.2.2Bb82菌液的制备与检验将Bb82株第7代冻干菌种接种于BMS培养基上,37?条件下培养24h,然后选5-10个典型菌落,分别接种于10绵羊鲜血琼脂斜面若干,同上培养后,作为一级种子。置4?保存,可使用7日。继代不超过3代。二级种子的繁殖以及制苗用菌液的培养、灭活、离心及冻融参照1.2.1
1.2.3蜂胶佐剂的制备经过工艺优化选择,我们采用了醇提水溶法来制备蜂胶佐剂。蜂胶原
胶在-20?冰柜中冷冻过夜使变脆,取出后研磨粉碎,放入深色瓶中,按1:4的比例加入80的乙醇,充分搅拌,置70?索氏回流2h,然后于旋转蒸发器中50?浓缩成浸膏状。通过试验,选择合适的助溶剂,将蜂胶浸膏溶于pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS),然后配制成40mg/ml的溶液4?避光保存备用。
1.2.4配苗将上述Pm90菌液与Bb82菌液等量混匀后作为水相,蜂胶乙醇提取液作为佐剂相,水相与佐剂相等量混匀后加入终浓度为0.01的硫柳汞,置胶体磨中以8000r/min搅拌5min,然后12000r/min搅拌5min。无菌检验合格的,即可分装至疫苗瓶中,加塞、封蜡置4?保存备用。实验室共生产兔巴氏杆菌-波氏杆菌二联蜂胶疫苗6批,批号分别为:010510、010521、010615、010628、010709和010720。
1.2.5成品检验6个批次的兔巴氏杆菌-波氏杆菌二联蜂胶灭活疫苗均进行了物理性状、无菌检验以及安全检验。其中安全检验分3组进行,每组均使用了不同日龄(30、90、180天)的健康大耳白兔各20只。接种后观察3周,
家兔的临床反应、体温以及是否有组织病变。3个组的试验设计如下:一次单剂量接种组的疫苗接种量为2ml/只;单剂量重复接种组为2次接种,中间间隔1周,剂量为2ml/只;一次大剂量接种组的疫苗免疫量为6ml/只,采用皮下多点注射的方式进行。
1.2.6兔巴氏杆菌—波氏杆菌二联灭活苗的效力试验兔巴氏杆菌部分取4批二
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