海豚链球菌灭活疫苗对罗非鱼免疫效果的研究

海豚链球菌灭活疫苗对罗非鱼免疫效果的研究 海豚链球菌灭活疫苗对罗非鱼免疫效果的 研究 第32卷 Vo1.32 第5期 NO.5 西南师范大学(自然科学版) JournalofSouthwestChinaNormalUniversity(NaturalScience) 2007年1O月 Oct.2007 文章编号:1000—5471(2007)05,0065—06 海豚链球菌灭活疫苗对罗非鱼免疫效果的研究 张生,曾忠良,王凡,李安兴 1.西南大学药学院,重庆400716;2.中山大学生命科学学院,广州510275 摘要:用野外分离的海豚链球菌(Streptococcusiniae)海水菌株HD-1和淡水菌株TBY一1制备成含1x10c{u/mL 的灭活疫苗,以0.1mL/尾的剂量对尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)进行腹腔注射,免疫2次,测定免疫后1 周,3周和5周免疫鱼血清中抗海豚链球菌的抗体滴度和相应菌株攻毒后的相对保护率,以评价海豚链球菌灭活 疫苗对罗非鱼的免疫保护性.结果显示免疫鱼血清中抗体凝集效价在免疫后第3周和第5周呈显着性升高,且两 种疫苗免疫血清存在明显的交叉凝集反应,说明HD-1和TBY-1抗原具有交叉免疫原性.在免疫后第4周,利用 8倍半数致死量浓度(LDco)的海豚链球菌强毒菌株进行攻毒试验,结果显示:HD-1和TBY一1免疫组的死亡率分 别为5和0,相对保护率分别为93.8和100;未经免疫的阴性对照组的死亡率分别 为77.5和62.5. 关键词:海豚链球菌;灭活疫苗;罗非鱼;保护率 中图分类号:S965.125文献标识码:A 海豚链球菌(S,re户,o?ccsiniae)属于链球菌科的链球菌属,呈圆形或卵圆形,成对或成不同长度的链 状,无鞭毛,不运动,有荚膜,不形成芽孢,革兰氏染色阳性,兼性厌氧.S.iniae最初由Pier(1976)从亚马 逊淡水海豚皮下脓肿中分离并命名j.1997年,Weinstein等证明S.iniae是一种条件性人畜共患病病原 菌,它不仅能感染几乎所有的海,淡水鱼类,如罗非鱼,鲈,鲷,石斑,三纹鱼,虹鳟等,还可感染人类,引 起局部蜂窝组织炎,心内膜炎. S.iniae在感染易感鱼品种如罗非鱼,尖吻鲈,条纹杂交鲈之后,一周内可引起5O以上的鱼死 亡刈,有的甚至高达95.该病也可以导致罗非鱼慢性持续性死亡,最终造成重大的经济损失.据 Shoemaker估计,全球每年因该病造成养殖鱼类的经济损失超过1.5亿美元.该病在各主要鱼类养殖国 家均有发生,但温带和热带,亚热带地区尤其严重. 对鱼类链球菌病防治,目前主要依赖抗生素药物,但抗药性和药物残留问题极大限制了抗生素的应 用.由此,研制鱼类链球菌疫苗,以预防该病的发生和流行则很有必要.目前,国外对该菌的疫苗研究已 经积累了丰富的经验,Eldar等从1995年起就开始研究利用S.iniae全菌及其提取的蛋白制备成灭活疫苗, 并且成功应用于红鳟鱼的链球菌病防治..;Klesius等2000年将S.iniae的单一苗和复合苗通过腹腔和肌 肉注射到罗非鱼中,使鱼体死亡率较对照组显着降低.然而,迄今为止,还未见到我国的关于鱼类链球 菌疫苗的研究报道. 近年来,我们分别从海,淡水经济鱼类中分离鉴定出3O余株S.iniae菌株,初步确定海豚链球菌是华 收稿日期:2007—05—10 基金项目:广东省科技攻关资助项目(20042060179,2OO5B2O3O1O27);广州市科技攻关资助项目(2OO2Z3一E0271);惠州市科技资助项 目(2006P58). 作者简介:张生(1978一),男,山东聊城人,硕士研究生,主要从事水生经济动物病原免疫学研究. 通讯作者:曾忠良 66西南师范大学(自然科学版)第32卷 南地区罗非鱼,尖吻鲈,花鲈,鲳骖和石斑鱼等经济鱼类的主要致病病原(待发表资料).本文利用S.iniae HD一1(海水菌株)和TBY一1(淡水菌株)制备成油乳剂灭活菌体疫苗,免疫罗非鱼,探讨疫苗的免疫 效果. 1材料及试剂 1.1试验动物及分组 试验用鱼为尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus),购自广东省省级罗非鱼良种厂,体重46?0.5g.为 确保实验鱼未感染S.iniae,随机抽取5条鱼的脑组织和肝组织于BHI固体培养基上培养,若培养物无细 菌生长,方可作为试验用鱼. 将上述试验鱼160尾,随机分为4组,每组鱼分养于2个40L玻璃水族箱中,每缸20尾,每日按鱼体 重2,3投喂常规膨化饲料.24h通气,换水量为0.5L/h.试验前驯养14d,若无任何异常情况,方可 进行试验. 1.2水质监测 定期测定水质.溶解氧在6.02?0.56(mg/L),温度为(27?0.5)?,pH值在7.2?0.0,氨氮 (mg/L)保持在0,适合尼罗罗非鱼生长. 1.3试剂 脑心浸出液(BrainHeartInfusion,BHI),革兰氏染色液,均由中国广东环凯微生物科技公司生产;弗 氏完全佐剂(FCA)和弗氏不完全佐剂(FIA),均为Sigma产品;考马斯亮兰G一250为Sigma产品;苏丹? 为沈阳市试剂三厂生产. 2方法 2.1菌种及培养 S.iniaeHD一1(海水菌株)和TBY一1(淡水菌株)分别取自患病海水鱼花尾胡椒鲷和患病的淡水罗 非鱼.由本实验室分离鉴定. 将一70?保存的冻存菌种BHI固体培养基划线28?培养48h,挑单菌落接种于10mL液体BHI液体 培养基中,28?振荡培养48h;再将此培养物全部接种于500mLBHI液体培养基中,28?振荡培养 48h.然后对培养物进行梯度稀释涂板计数. 2.2L.测定 将上述2个菌株按4个浓度梯度,即按2.1已计数的菌体培养物的10倍浓缩浓度,原浓度,10倍稀释 浓度,100倍稀释浓度(分别测定其细菌含量),分别接种10尾尼罗罗非鱼,0.1mL/尾鱼腹腔注射,注射 后连续观察两周,每天观察并记录死亡情况,以测定试验菌株对罗非鱼的半数致死量(LD.). 2.3疫苗制备 将浓度达到10.CFU/mL疫苗用S.iniae加0.4(v/v)的福尔马林28?灭活24h,PBS 洗涤3次后, 浓缩100倍.安全性检测后,低温贮存备用. 将上述制备的S.iniae体按1:1的体积比加入弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂制备成油乳剂灭活菌 苗,一20?贮存备用. 2.4疫苗的质量检测 2.4.1无菌检验 取100L试验疫苗涂布于BHI固体培养基28?培养48h. 2.4.2均匀度检测 取试验疫苗轻轻滴在平静水面上,10min后观察油滴状况;考马斯亮兰G一250和苏丹?检测;取试 第5期张生,等:海豚链球茵灭活疫苗对罗非鱼免疫效果的研究67 验疫苗1mL3000r/min离心15min,观察有无层析现象. 2.5免疫方式及程序 分别将HD一1和TBY一1两种菌株按2.3方法制备的疫苗经腹腔注射(O.1mL/尾鱼)各组试验鱼(每 组2缸共4O尾鱼).同时各设相应对照组(每组2缸共4O尾鱼),经腹腔注射0.1mLPBS液/尾鱼.每组鱼 均进行2次免疫,首次免疫注射弗氏完全佐剂疫苗,2周后注射弗氏不完全佐剂疫苗加强免疫一次. 2.6血清收集及处理 首免后第1周,第3周及第5周各采血1次,每次从每饲养缸中随机选取5尾,尾静脉采血,血样置室 温2h;然后置4?冰箱过夜.8000r/min离心10min后,收集血清,56?水浴灭活30min.一20?保存 备用. 2.7攻毒试验 二次免疫后两周,将7.9X10.cfu/mLHD一1菌液及5.6X10.cfu/mLTBY,1菌液,分 别向相应的 免疫组和对照组腹腔注射0.1mL/尾;并统计两周内各组试验动物的死亡情况.按下列公式计算相对保护 率(RPS): 相对保护率()一(对照组死亡率一免疫组死亡率)/对照组死亡率X100 2.8标准抗原制备及血清抗体滴度测定 2.8.1标准抗原制备 将2.3的灭活菌液以无菌PBS洗涤2次,收集菌体并加入与灭活前原菌液等体积的无菌PBS重悬,即 为标准抗原.HD一1菌株标准抗原定名为AgHD一1,TBY一1标准抗原定名为AgTBY一1,置一2O?冰 箱备用. 2.8.2抗体凝集效价测定(微量凝集反应) 用96孔V形底血凝板作为载体.每孔加5OLPBS液,然后在血凝板的第1列之第1孔中加入免疫 血清5OL,混匀后吸取5OL加入同行第2孔,依次进行倍比稀释.最后向每个孔中加入2.8.1的相应菌 株抗原5OL.以无菌PBS作阴性对照.将血凝板置于37?恒温培养箱中孵育18h. 结果判定标准:肉眼观测及显微镜下观测,血凝板V形底部出现沉积边缘模糊化则判定为阳性反应, 若底部出现轮廓清晰的圆形沉积物则判定为阴性反应. 3结果 3.1细菌平板计数 对培养物进行梯度稀释涂板计数.HD一1:OD600—0.962,涂板计数为7.0X10.cfu/mL;TBY一1; OD600一O.890,涂板计数为4.7×10.cfu/mL 3.2试验疫苗无菌检验 100L试验疫苗涂布于BHI固体培养基,28?恒温培养48h后未发现细菌生长. 3.3试验疫苗质量检测 试验疫苗轻轻滴在平静水面上,10min后观察油滴状况,没有发现油滴散开;考马斯亮兰G一250和 苏丹?检测为油包水剂型;试验疫苗lmL3000r/min离心15min,未见分层现象. 3.4LD50测定结果 按4个梯度浓度,0.1mL/尾剂量接种4组鱼(每组1O尾鱼),接种1d后实验鱼出现死亡,并延续一 周,各组鱼最后死亡数均出现随接种量增加而增大的趋势,HD,1高剂量(70.0X10.cfu/mL)接种组,其 死亡率达9O,TBY一1高剂量(70.0X10.cfu/mL)接种组达8O;而低剂量接种组的死亡率分别为2O 和3O9/5(表1).利用spssl3.0计算4个浓度梯度细菌组的LDso数值,得到HD一1菌株半数致死量为 9.91X10cfu/mL,TBY一1菌株半数致死量为6.97X10cfu/mL. 68西南师范大学(自然科学版)第32卷 HD一1组 TBY'--1组 70.0×10.cfu?mL_.,10990.0 7.0×10.cfu?mL_.10770.0 0.7×10.cfu?mL一10550.0 0.07×10.cfu?mL一10220.0 47.0×10.cfu?mL一10880.0 4.7×10.cfu?mL一10660.0 0.47×10.cfu?mL一10550.0 0.047×10.cfu?mL一10330.0 3?5疫苗的免疫保护效果5O 表2HD一1及TBY一1疫苗对尼罗罗非鱼的免疫保护率 注:相同字母表示差异不显着(>O.1),不同字母代表差异极显着(<O.01). 3.6血清抗体凝集效价检测 将HD一1标准抗原AgHD一和TBY一1标准抗原AgTBv一分别与HD一1实验组血清(Abwo一),HD一1 对照组血清(AbHD一对照),TBY一1实验组血清(AbTBY一),TBY一1对照组血清(AbTBY一对照),PBS对照 血清进行微量凝集反应,以检测血清的抗体凝集滴度.结果显示免疫组血清随着免疫时间的增长,抗体凝 集效价滴度也随之增高,最高效价可达l64;对照组在攻毒前的血清效价滴度为0,攻毒后l周血清呈现 轻度的凝集效价(<2).AgTBv一对Abwo一的最高交叉凝集效价为1:32,表明两株细菌存在明显的交叉免 疫原性(表3). 第5期张生,等:海豚链球菌灭活疫苗对罗非鱼免疫效果的研究69 注:每个血清样品凝集试验重复3次. 4讨论 关于鱼类链球菌疫苗的研究和开发,国外Phillip等利用异源S.iniae菌株(包括海水菌株与淡水菌 株)按一定比例混合制备成多价疫苗对罗非鱼进行免疫,并利用其制备疫苗的菌株进行攻毒,获得63.1 (淡水菌株攻毒)和87.3(海水菌株攻毒)的相对保护率.我们的试验结果显示:海水菌株HD一1疫苗免 疫后的罗非鱼可获得93.8的相对保护率;淡水菌株TBY一1免疫后的平均相对保护率是100,效果优 于PhillipH.Klesiusu等制备的疫苗效果. 接种疫苗后第一周,罗非鱼血清中的抗体滴度通常较低(凝集滴度?2),再次免疫后抗体效价出现较 大幅度的提高(凝集滴度达1:16),说明鱼类链球菌疫苗对罗非鱼之加强免疫的重要性和必要性.血清凝 集滴度越高的实验组,免疫保护力越强.这一结果与PhillipH.Klesius的结果一致. BarnesAC等纠对分离自杂交鲈(Moronechrysops×Moronesaxatilis)的2株S.iniae菌和分离自罗 非鱼的1株S.iniae菌进行血清型鉴定,观察到不同S.iniae菌株之间存在抗原抗体交叉反应现象,证明不 同来源S.iniae株菌之间的血清型没有太大差异.我们的结果显示S.iniae海水菌株HD一1与S.iniae淡 水菌株TBY一1之间同样存在抗原抗体交叉凝集反应,且随着接种时间的延长,交叉凝集反应效价随之增 高(二免后第1周最低抗原抗体交叉凝集反应效价达到1:16).据此,我们认为HD一1和TBY一1两株菌 属同一血清型,两者之间具有交叉保护性.这一结果对今后开发海豚链球菌疫苗菌株的选择上具有重要 意义. 本实验采取腹腔注射的免疫方式,获得了良好的免疫效果.然而,因为腹腔注射方法的操作繁琐,工 作量大,且易造成鱼体的应激反应等缺点,因此,有必要探索其它更方便的免疫接种方法.NakanishiT_13_ 等利用经皮针刺联合浸泡免疫方法对S.iniae疫苗的免疫方式进行了探究,使用此种方法免疫的红鳟鱼死 亡率为4O,而未免疫或只用浸泡免疫的红鳟鱼死亡率都达到8O.至于链球菌疫苗对罗非鱼的其它免疫 方式,则需要做进一步的工作. 参考文献: E1]PierGB,MadinSH.Streptococcusiniaespnov,abeta—haemolyticStreptococcusisolatedfromanAmazonfreshwater dolphin,IniageoffrensisEJ].InternationalJournalofSystematicBacteriology,1976,26;545 —553. E23WeinsteinMR,LittM,KerteszDA,eta1.InvasiveinfectionsduetOafishpathogenStrept ococcusiniae[J].NEnglJ Med.,1997,337(9):589—594. [33KusudaR.BacterialfishdiseasesinmarieultureinJapanwithspecialemphasisonstreptoeoeeosis[j].Isr.J.Aquaeult. 1992,44:140. 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Keywords:Streptococcusiniae;inactivatedvaccine.;tilapia,immuneprotection 责任编辑夏娟