甘氨脱氧胆酸对肝细胞钙激活性钾通道的影响

甘氨脱氧胆酸对肝细胞钙激活性钾通道的影响 ? ? ? ? ? ?? ?α 颜英俊黄文方康格非李小刚杨明清涂植光唐中陈宏础蒋虹 () () 【摘要】 目的 观察甘氨脱氧胆酸 对大鼠肝细胞钙激活性钾通道 开放概率的影响。 方法 体外培养大 GD C KCa ?细胞贴附 鼠肝细胞, 以 GD C 为处理因素, 应用膜片钳技术通过贴附式和内面向外式膜片测定大鼠 K开放概率。结果 Ca 2+ - 7式膜片下, 浴液中 浓度 10终浓度为 50, 100, 250时, 概率由 0. 038?0. 09 分别增加到 0. 620? , ƒƒC am o lL GD C Λm o lL 2+ - 7- 6- 5(()) 0. 338, 0. 591?0. 163, 0. 895?0. 176 = 4, 均< 0. 01。浴液中不加 改变 浓度 10、10、10ƒ的 开 , , n P GD C C am o lL KCa () 放概率并不发生明显改变, 而在此液中加入 终浓度 100ƒ开放概率由 0. 042?0. 015 增加到 0. 385?, GD C Λm o lL KCa 2+ ()0. 330和 0. 551?0. 163 = 4, 均< 0. 05。浴液中不含 , 并加入 浓度为 50, 100, 250ƒ开放概 , , n P C aE GTA GD C Λm o lL KCa 2+ 2+ () ( 率显著增加 = 4, 均< 0. 05, 但比浴液中有 时增加程度小。 ?内面向外式膜片下, 浴液中无 , 加入 10,n P C aC aGD C () )50, 100, 250开放概率无明显改变 = 2, > 0. 05。 结论 ?对 有明显的激活作用, 并有浓度依赖 ƒ, Λm o lL KCa n P GD C KCa 2+ 2+ 2+ 性。 ?既有引起胞外 内流, 也能诱导内贮 的释放。 ?对 的激活是通过 实现的。GD C C aC aGD C KCa C a 【关键词】 甘氨脱氧胆酸 肝细胞 钙激活性钾通道 膜片钳 【中图分类号】R 333. 4 【文献标识码】A - 1, In f luen ce of g lycodeoxycho la te on open probab il ity of ca lc ium ac t iva ted po ta ss ium chann e lH u ang W enf ang K ang , , . , ′, , 610072G ef e iL i X iaog ang e t a lD ep a r tm en t of C l in ica l L abora tory S ich u an P rov inc ia l P eop les H osp ita lC h eng d u ( ) 【】 2 A bstrac tO bjec t ive T o inve st iga te th e inf luence o f g lyco deo xycho la te GD C o n op en p ro bab ility o f ca lc ium ) (. 2ac t iva ted po ta ssium KCa in ra t h ep a to cy te sM e thods G lyco deo xycho la ted w a s u sed to t rea t th e ra t h ep a to cy te s cu ltu red . 2- - . in v it roO p en p rop ab ility o f KCa w a s de te rm ina ted by p a tch c lam p in ce lla t tach ed p a tch and in siedo u t p a tchRe sults 2+ ? ƒ- , 50, 100, 250, In ce lla t tach ed p a tch w h en GD C w a s added w ith f ina l co ncen t ra t io n s Λm o lL re sp ec t ive lyand C aw a s - 710ƒ?0. 009 0. 620?0. 338, 0. 951?0., 0. 038p re sen t in m ed ium w ith m o lL th e KCa op en p ro bab ility inc rea sed f rom up to 2+ - 7 - 6 - 5() 163 0. 895?0. 176 = 4, < 0. 01. , 10, 10ƒ10and n a ll P W h en C ain m ed ium w itho u t GD C w a s ch anged w ith m o lL 有无, 来判断或找到声门的位置。 本组 1 例 5 岁小儿, 20% 时, 需补充全血。 补入。术中失血量达全血容量的 由于咽喉部被烧碱灼伤以及术前多次行食管扩张术, 另外, 还应注意患儿术中保暖, 以免体温过低而导致苏 在咽后壁与舌根处形成一环状瘢痕, 将食管入口、会厌 醒延迟。 及声门均遮掩于其后, 插管时多次将其误认为气管开 2. 4 手术时间长。 一般 5, 9 小时, 帄均为 6. 5 小时,口而将导管插入食管, 后通过判断呼吸气流的方向在 故术中呼吸道的管理非常重要。 该型手术通常需将结 环状粘连带的后上方找到声门的位置, 方将导管成功 肠经胸骨后前纵隔隧道上提至颈部与颈部食管吻合, 插入气管内。 操作过程中有时容易损伤纵隔胸膜引起气胸。 本组有2. 3 注意小儿麻醉的特点。这类患者多见于学龄前儿 1 例 3 岁小儿, 在上提结肠时左侧纵隔胸膜受损, 脉搏 童或帅儿, 12 岁以内小儿占 36% 。 本组病例中年龄最 氧饱和度稍下降, 术毕听诊肺部发现左侧气胸后行闭 小者为 2 岁 10 个月, 手术时体重仅 8. 5。 麻醉者应 式引流, 方使患儿转危为安。 若破口大而又发现不及 k g 熟悉小儿解剖、生理、药理方面的特点, 采用相应的麻 时, 必然会造成严重的呼吸功能障碍。醉方法和适合小儿的监测设备, 使小儿安全度过麻醉 2. 5 为配合手术医生顺利解剖颈部食管以及明确狭 和手术期。 术中除严格按公斤体重准确算出每小时输 窄起始部位, 可于气管插管成功后, 再经口咽缓慢置入 液量外, 还应根据小儿特点及术中失血量及时补充全 一内径为 5的较柔软的无套囊气管导管于食管腔 mm 血。 本组小儿输液维持量按每公斤体重每小时 10内直至遇有阻力而停。 以便于术中术者通过触摸此管 m l 计算, 手术开始后的前两个小时, 还应补充患儿禁食的判定食管所在位置及狭窄的上界, 有助于食管的解剖。( )20000725 收稿 ( 1ƒ2 缺失量 按每公斤体重每禁食一小时补充 4计 m l ) 算总量, 余下的1ƒ2缺失量在以后的几个小时内均匀 - , . , resp ec t ive lyno sign if ican t ch ange o f th e KCa op en p ro bab ility w a s o b se rvedH ow eve rw h en GD C w a s added w ith f ina l 100ƒ?0. 015 0. 385?0. 330 , 0. 042co ncen t ra t io n Λm o lL th e KCa op en p ro bab ility inc rea sed sign if ican t ly f rom up to and ()()0. 551 ?0. 163 = 4, < 0. 05. 50, 100, 250ƒn P w h en E GTA and GD C f ina l co ncen t ra t io n s Λm o lL w e re added to m ed ium w 2+ 2+ () , < 0. 05, - = 4, itho u t C ath e KCa op en p ro bab ility inc rea sed o bv io u sly n a ll P bu t it w a s low e r th an th a t w ith C ain 2+ . ? , - , m ed iumIn in sied o u t p a tch w h en GD C w a s added to m ed ium w itho u t C ano sign if ican t ch ange o f th e KCa op en ()= 2, > 0. 05. ?- , p ro bab ility w a s no ted n a ll P Con c lus ion KCa o f ra t h ep a to cy te s co u ld be act iva ted by GD C w h ich is 2+ 2+ - . ?, do sedep enden tGD C co u ld induce ex t race llu la r C ainf lux and in t race llu la r sto red C are lea sew h ich a re re la ted to 2+ . ?.co ncen t ra t io n o f GD CGD C ac t iva ted th e KCa o f ra t h ep a to cy te s by C ap a thw ay 【】 - - Key wordsG lyco deo xycho la te H ep a to cy te C a lc ium ac t iva ted po ta ssium ch anne l P a tch c lam p肝脏疾病有多种致病过程可导致胆汁郁积, 而胆 1. 8 数据采用贮存与 实验中单通道电流信号 汁酸在细胞内的堆积是导致肝细胞损伤的最终途径之 经膜片钳放大器放大后分为二路: 一路输入记忆示波 〔1〕器进行观察, 另一路径 ?转换器输入计算机 ƒƒA D D A 一。疏水性胆汁酸能导致肝细胞膜脂质过氧化, 细胞 〔2〕2+ 进行采样、贮存, 用四极低通滤波器滤波、滤波频率为 膜流动性降低, 并可诱导细胞凋亡。 而 在细胞 C a () 损伤和凋亡中起着重要作用。钙激活性钾通道 在 KCa 3, 采样频率为33. 33。 采样方式为“”。 kH zkH zgap f ree生命的生理过程中具有重要作用, 并特异性地受胞内 实验所得数据采用 软件系统进行分6. 02 pC a lm p 2+ 2+ [] 的 影 响, 胞 内 [ ] 的 微 小 变 化 都 可 影 响 C ai C ai () 析处理。 通道开放概率 由以下公式计算出: P 0 的开放状态。本研究应用膜片钳技术通过贴附式和 KCa = ƒP 0 T 0 N T i 内面向外式膜片测定大鼠肝细胞 开 放 概 率 等 指 KCa 标, 以观察 对大鼠肝细胞 的影响, 同时间接 GD C KCa 2+ 为记录膜 T 0 为通道开放时间, T i 为记录时间, N 探讨 对大鼠肝细胞 [] 改变的影响。GD C C ai 片上的通道数目。1 材料和方法 进行电流分析时将电流幅值大于通道电流幅值 50% 作为通道开放, 而将电流幅值低于 50% 作为通道 关闭处理。 1. 1 实验动物 雄W ista r 大鼠, 体重 200, 300g, 由 1. 9 统计学处理: 实验结果采用两样本均数 检验。t 泸州医学院实验动物中心提供。2 实验结果 ( 1. 2 实 验 设 备 二 氧 化 碳 孵 箱 1815- T C SH EL ) ( 美 国 , 膜 片 钳 放 大 器 - 220 L A B C E Z N IHON2. 1 细胞贴附式膜片下, GD C 对 KCa 的作用 ) (日 本 , 记 忆 示 波 器 - 11 KO HD EN V C N IHON 2. 1. 1 对通道开放概率的影响 当浴液中游离 GD C - 7) (日 本, 、转 换 器 -ƒƒKO HD EN A DD A D IG IDA TA 钙离子浓度为 10钳制电压为- 60, 加入, ƒm o lL mV ) 1200 美 国, 数 据 处A XON IN ST RUM EN T P c lam p 终 浓 度 分 别 为 50Λm o lL 、100Λm o lL 、250Λm o lL 的ƒƒƒ ( ) (理 软 件 系 统 6. 0. 2 () A xo nIn st rum en t s B u r lin gm e 分别 4时, 通道开放概率由 0. 038?010090 = GD C n ) ( ) CA 。4, < 0. 01 , 0. 951 ? 增 加 到 0. 620 ? 0. 338、= P n ()甘氨脱氧胆酸 、K 型胶原酶、 1. 3 药品试剂GD C ( )( 0. 163 = 4, < 0. 01 、0. 895 ? 0. 176 = 4, < n P n P H E P E S、W E 人工培养基均购于 S igm a 公司。 其他药 ) 0. 01 , 说明 对通道具有明显的激活作用, 并显 GD C 品均为市售分析纯。示有一定的剂量依赖性。 2+ 1. 4 试剂配制及肝细胞分离纯化、培养试剂配制见文当浴液中不加入 加入 , 使其最终浓度 , GD C C a〔2〕- 7- 6- 5 献。分别为 10、10和 10通道ƒƒƒ; m o lL m o lL m o lL KCa 〔2〕 ( 1. 5 大鼠肝细胞的分离纯化见文献。的开放概率并不发生改变, 而当浴液中加入 终GD C 2+ - 71. 6 大鼠肝细胞原代培养 将分离纯化的大鼠肝细 增加 ) 100后, 再将 浓度 10浓度 ƒƒ Λm o lL C am o lL- 6- 5胞, 经台盼蓝染色, 活细胞> 90% , 调整细胞数为 1 × 到 10和 10钳制电压260, 通道开 ƒƒ, m o lL m o lL mV 6 () 10个ƒ。 加大放有经胶原处理过的盖玻片的帄皿 放概率由 0. 042?0. 015 = 4增加到 0. 385?0. 330m ln () 和 0. 551?0. 163 = 4, 均< 0. 05, 提示 能引 中, 每个帄皿加 10细胞悬液, 培养 4 小时, 待细胞贴n P GD C m l 2+ 壁后, 取出放入倒置显微镜上的浴槽中, 选择贴壁良起细胞外 内流。C a 2+ 当 浴 液 中 不 含 C a, 并 加 入 E GTA , 以 除 去 外好, 镜下观察细胞面光滑的大鼠肝细胞供实验之用。 〔3〕2+ 1. 7 膜片钳实验试剂的配制方法见文献。对 实 验 的 影 响, 以 观 察 是 否 能 引 起 内 贮C aGD C 2+ ()() 的释放。 浓度分别为 50ƒ、100ƒ 化 酶 、合成酶、磷脂酶 蛋白激酶 , C aGD C Λm o lL Λm o lA C N O C PL C C ( ) () 和磷脂酶 , 使通道蛋白磷酸化等, 引 时, 通道开放概率显著增加, 但比浴液 P KC A 2 PL A 2 、250ƒL Λm o lL 2+ 2+ 中有 时增加程度小。 说明有内贮 的释放。 起通道活性的增强。 磷酸化对任何一种离子通C aC acAM P 〔4〕2. 1. 2 对通道帄均开放时间和关闭时间的影响 GD C 道调节都是重要的, GD C 可能与细胞膜上的 Β受体 当浴液中加入 其终浓度分别为 50ƒ、结合, 进而激活细胞内腺苷酸环化酶, 使胞内 GD C Λm o lL cAM P 时, 通道帄均 100Λm o lL 、250Λm o lL 钳制电压260mV 含量增加, 引起钙通道蛋白磷酸化导致通道构型发生 ƒƒ 2+ () 开放时间由 2. 550?3. 401= 4分别增加8. 470? 改变, 使 内流增加。m s n C a () ( 12. 567= 4, < 0. 05, 35. 068 ?38. 053=钙激活性钾通道对调节细胞的兴奋性具有重要的m s n P m s n 作用, 它主要参与静息电位的形成, 产生超极化电位, ) () 4, < 0. 05, 19. 675?16. 940= 4, < 0. 05, 而 P m s n P 〔5〕从而调节锋电位的发放频率。 激活 , 使 GD C KCa KCa () 通道帄均关闭时间分别由 65. 161?100. 960= 4m s n + + 开放概率显著增加, 胞内 外移增加, 胞外 浓度 K K + ( ) 分 别 减 少 到 5. 129 ? 15. 506= 4, < 0. 05 ,m s n P 增加, 胞内外 浓度梯度减小, 膜电位增加, 使细胞 K () ( 1. 828?16. 425= 4, < 0. 05, 1. 135?2. 850 m s n P n易发生过度超极化, 细胞兴奋过度抑制, 从而可导致细 + 胞损伤。 另一方面, 由于胞外 浓度增加, 细胞为了 K )= 4, < 0. 05。 说明 增加通道开放概率时间主 P GD C + + + 维持胞内外 浓度的帄衡, , - 酶活性 K K N aA T P 要通过增加帄均开放时间, 及减少帄均关闭时间, 特别 加强, 大量消耗 使细胞受损。, A T P 是通过后者来实现。 对通道时间分布直方图进行指数 对 的激活作用可间接反映 对细胞 GD C KCa GD C 拟合, 其中帄均开放时间分布直方图仍适合用双指数 2+ 内[] 增加的影响。研究发现 能诱导大鼠肝C ai GD C 拟合, 而帄均关闭时间分布直方图也适合用双指数拟2+ () 细胞凋亡及坏死性损伤 另文报道, 而 是细胞内 C a合, 从指数曲线拟合的时间常数表明对帄均关闭时间 重要的第二信使物质, 不仅在正常的细胞功能中起着 的影响主要是缩短其慢关闭时程。 极其重要的作用, 而且还参予许多疾病的发生和发展。当浴液 2. 2 内面向外式膜片下, GD C 对 KCa 的作用 2+ 现广泛认为胞内 超载是细胞死亡的最后共同通 C a2+〔6〕加 入 其 终 浓 度 为 0ƒ、中 不 含 GD C Λm o lL C a路, 也是细胞凋亡的关键因素之一。 诱导肝细 GD C 2+ 2+ 胞 外 内 流 及 内 贮 的 释 放, 最 终 导 致 胞 内 50Λm o l、100Λm o lL 、250Λm o lL 钳 制 电 压 为260mV ƒƒƒC aC a2+ [ ] 的增加, 可能在 所致的细胞坏死和细胞 C ai GD C ( ) 时, 其 通 道 开 放 概 率 分 别 为 0. 018 ? 0. 008 = 2 、n 凋亡中起着重要作用。 ()(0. 021?0. 009 = 2, > 0. 05、0. 015?0. 003 = 2, n P n ) ()> 0. 05, 0. 019?0. 014 = 2, > 0. 05。说明 P n P GD C 2+ 对 的激活是通过 而实现的。KCa C a 3 讨 论 参 考 文 献 1 G re im H , e t a l. M ech an ism o f cho le sta sis. 6. B ile ac id s in h um an 在内面向外式膜片下, GD C 对肝细胞 KCa 不具有 . , 1972,live r s w ith o r w itho u t b ilia ry o b st ruc t io nG astroen terology 激活作用。 说明 并不能直接激活肝细胞 , 而 GD C KCa 63: 846 2+ 是通过细胞内 的增加而实现的。 使细胞内 C aGD C 黄文方, 等 1 甘氨脱氧胆酸对大鼠肝细胞膜流动性及脂质过氧化的 2 2+ 作用研究 1 中华肝脏病杂志, 1999, 7: 46 增加的机理可能是: ?所用 是一种水溶性C aGD C , . - -H am ill O P A et a lIm p ro ved p a tch ch am p tech n ique s fo r h igh 成分, 它不易穿过细胞膜的脂质层而作用于通道内口,3 - re so lu t io n cu ren t reco rd ing f rom ce lls and ce ll f ree m em b rane 因此在细胞贴附式膜片下才对 有激活效应, 这种 KCa . , 1981, 391: 85p a tch e sPf lu eg ers A rch 激活效应不是直接而是间接作用, 可能是 引起 GD C R eu te r H. C a lc ium ch anne l m o du la t io n by neu ro t ran sm it te r enzym e 细胞去极化致电压依赖性钙通道开放或者谷氨酸释放 4 and d rug s. N a tu re, 1983, 301: 569 的增多, 激活谷氨酸受体, 尤其是对电压敏感的 2甲 N () J enk in so n D H , e t a l. C a lc ium - ac t iva ted po ta ssium ch anne ls in live r 基22天 门 冬 氨 酸 受 体 介 导 的 钙 通 道 被 激 D NM DA 5 . , 1983, 4: 429ce llsC el l C a lcium 活, 钙 离 子 内 流, 通 过 一 系 列 的 胞 内 过 程, 包 括 、 IP 32+ 本身引起的胞内钙库的释放, 胞内钙离子浓度迅 T hom a s C E , et a l. C u r ren t sta tu s o f ca lium in h ep a to ce llu la r in ju ry. C a6 ( ) , 1989, 10 3: 375速提高, 激活 。?可能与细胞膜上的特异性受 H ep a tology KCaGD C ( )20000306 收稿, 20000519 修回 体直接结合, 通过胞内过程, 激活多种酶, 如腺苷酸环