[宝典]饲料中氧化鱼油和维生素E对大黄鱼幼鱼抗氧化能力和丙二醛残留的影响

[宝典]饲料中氧化鱼油和维生素E对大黄鱼幼鱼抗氧化能力和丙二醛残留的影响 目 录 1 前言.................................................................................. 1 2. 材料与方法..................................................................... 2 2.1 实验饲料................................................................ 2 2.2 实验过程................................................................ 3 2.3 样品采集和分析 ................................................... 3 2.4 数据处理和统计方法 ........................................... 4 3.实验结果........................................................................... 4 3.1 鱼体生化组成........................................................ 4 3.2过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)4 3.3肝脏丙二醛(MDA)含量 ................................... 5 4 讨论.................................................................................. 5 饲料中氧化鱼油和维生素E对大黄鱼幼鱼抗氧化能力和 丙二醛残留的影响 1 前言 脂类在水产动物生命代谢过程中具有重要的生理功能，它能提供必需脂肪酸，是组织、细胞的组成成分，为水产动物提供能量，有助于脂溶性维生素的吸收和运输，此外还可提高某些水产动物对饲料蛋白质的利用率，有效节省蛋白质。随着饲料中脂肪含量的升高，饲料的氧化酸败问题已成为当今水产养殖产业中不可忽视的重要问题之一。鱼油是水产饲料最主要的脂肪来源，故造成水产饲料易氧化酸败的主要原因在于饲料中鱼油的氧化。已有研究明，鱼油氧化酸败产生大量具有不良气味的醛、酮等低分子化合物和过氧化物(徐继林等，2005)。这些活性化合物与饲料中的蛋白质、维生素或其他脂类作用引起饲料适口性下降、营养价值及消化率降低，从而导致水产养殖动物生长缓慢、免疫力和抗氧化力下降，而在饲料中添加D，L-α生育酚醋酸盐可 , 2007)。 防止上述病症(Lewis-McCrea等, 2007; Martins等 氧化鱼油对水产动物造成的危害主要表现为:抗应激能力下降，从而导致其生产性能下降、死亡率升高。其中抗氧化能力主要涉及动物体参与清除体内过多自由基的防御系统，该系统可以分为非酶系统和酶系统，非酶系统主要包括维生素E、维生素C、β-胡萝卜素、谷胱甘肽、巯基类化合物以及一些微量元素如硒、铜、锌等;而体内清除自由基的抗氧化酶系统主要包括超氧化物歧化酶(清除超氧阴离子)、过氧化氢酶(清除过氧化氢)、谷胱甘肽过氧化物酶及谷胱甘肽-硫-转移酶(清除脂质氢过氧化物)及谷胱甘肽还原酶(维持体内还原性谷胱甘肽的水平)等。研究表明，氧化鱼油能引起鱼体内抗氧化能力的改变(Lewis-McCrea等, 2007; Martins等, 2007)，它能消耗肝脏和肌肉等组织中的维生素E，并使鱼类体内的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶等抗氧化酶活性发生改变，但其影响抗氧化酶活性的机制尚需进一步研究。 丙二醛(MDA)被公认为脂质过氧化的最终产物，因此测定机体MDA含量可以反映机体脂质过氧化程度，同时也可间接反映细胞受损伤的程度。研究表明，鱼类摄食氧化鱼油会导致肝脏内MDA含量显著升高，这说明氧化鱼油能够诱导体内脂质过氧化。对真鲷幼鱼的研究也发现类似的现象，即氧化鱼油组肝脏中TBA值(MDA含量)显著升高。以上研究均表明，外源性过氧化物的摄入会加速机体肝脏中过氧化物的生成(任泽林等，2000;叶仕根等，2006;彭士明等，2007)。 维生素E是具有α-生育酚生物活性的所有分子的统称，维生素E作为脂溶性生物组织抗氧化剂，具有保护含磷脂的生物膜的作用，它能通过抑制脂质过氧化从而避免细胞的最终破裂。Huang等(2004)研究结果表明，杂交罗非鱼幼鱼(Oreochromis niloticus×O. aureus)摄食含氧化鱼油饲料时，维生素E的添加量对相对增重率和肝脏中谷胱甘肽含量有显著影响，高剂量维生素E添加组的相对增重率显著高于低剂量维生素E添加组。Lewis-McCrea等(2007)对大西洋鳙鲽(Hippoglossus hippoglossus L.)的研究也证明维生素E作为一种抗氧化剂可降低氧化鱼油对鱼体的损害。 近年来的研究主要集中在氧化鱼油对对日本牙鲆(Estévez等，1997)、杂交罗非鱼(Huang等，2004)、大西洋鲑(Sutton等，2006)和大西洋鳙鲽(Martins等，2007;Lewis-McCrea等，2007)生长和抗氧化能力的影响;而氧化鱼油对大黄鱼影响的研究未有报道。 大黄鱼 (Pseudosciaena crocea R.) 属鲈形目，石首鱼科，黄鱼属，也称黄鱼、大黄花、大鲜，属近海暖温、集群洄游性鱼类，是我国黄海南部、东海、台湾海峡以及南海北部海水养殖的名贵经济鱼类。到目前为止，有关大黄鱼营养生理的研究己有相关报道(Mai 等，2006a、2006b;Ai 等，2006a、2006b)。然而，有关氧化鱼油对大黄鱼抗氧化能力和丙二醛残留的研究却未见相关报道。本研究通过在饲料中添加不同氧化程度的鱼油和VE，深入分析其对大黄鱼幼鱼抗氧化能力和丙二醛残留的影响，为大黄鱼的营养生理研究和优质高效的人工配合饲料开发提供基础资料，为水产养殖业的健康与可持续发展提供理论基础。 2. 材料与方法 2.1 实验饲料 -1实验设计制作了8种饲料。所用的4种鱼油是新鲜鱼油(过氧化值POV=1.72 meq kg) -1和3种不同氧化程度(POV分别为28.29、62.79和104.21 meq kg)的氧化鱼油。8种饲料是:未补充维生素E的饲料1~4，其中以新鲜鱼油为对照组(饲料1)，按鱼油 -1的氧化程度由小到大，依次制作饲料2、3和4。补充维生素E(600 IUkg)的饲料5~8，其中鱼油的过氧化值分别与饲料1~4的相对应 (表1)。新鲜鱼油和氧化鱼油脂肪酸组成见表4.3。实验采用未添加抗氧化剂的鲱鱼鱼油作为主要的脂肪源，氧化鱼油制作方法参考Koshio 等(1994)的方法，简言之，将鱼油置于50?C加热，通入空气气泡并不断搅动，每隔4h测定一次鱼油的过氧化值，直到达到特定的氧化程度， -1停止加热，加入150 mg kg乙氧基喹啉，防治鱼油进一步氧化。实验饲料的原料组成和营养成分见表2。 2.2 实验过程 养殖实验在浙江省宁波市象山港海水网箱养殖区进行。实验所用大黄鱼选用当年人工孵化的同一批鱼苗，实验开始前在网箱(3.0×3.0×3.0 m)中暂养2周，暂养期间投喂对照组饲料，使之逐渐适应实验饲料、投喂时间和养殖环境。 实验鱼经2周的驯化后，禁食24h，以丁香酚(1?10000，上海试剂厂，中国上海)麻醉，挑选出体格健壮、规格一致的大黄鱼(初始体重为7.82 ? 0.68 g)，作为实验用鱼。实验鱼随机养殖在24个海水网箱(1.0×1.0×1.5 m)中，每个网箱放养60尾实验鱼。将24个网箱随机分成8个组，投喂所对应8种饲料。每天投喂2次(04:30和16:30)，饱食投喂(以实验鱼不再争抢饲料为准)。实验期间的1~4周饲喂小粒径饲料，5~10周饲喂大粒径饲料，每天记录投喂量，以此计算摄食率。实验期间水温为 -126.5~30.5?C，盐度约为28‰，溶解氧约为7 mg L。饲养实验为期10周。 2.3 样品采集和分析 养殖实验结束后，实验鱼禁食24h，计数每个网箱中鱼的尾数，以此计算存活率。称量每个网箱中所有鱼的重量。每网箱随机取20尾鱼，经丁香酚(1?10000，上海试剂厂，中国上海)麻醉后，测定其体重和体长，其中5尾作为常规生化分析，-20?保存待测;6尾经尾静脉抽血以分离出血清，解剖取其肝脏和内脏称重，血清和肝脏置于-70?超低温冰箱中保存待测。参照AOAC (1995)的方法，做鱼体生化组成分析。鱼体蛋白质含量通过凯氏定氮法测定(N× 6.25，Kjeldahl method);脂肪采用减量法，用乙醚索氏抽提;灰分采用高温灼烧法(550?)确定。 脂肪酸采用气相色谱法(GC Agilent 6890，U.S.A.)，方法参照(Ai，2006a)。 样品处理:取l00mg左右真空冷冻干燥的饲料样品，加入带盖试管中，然后加入3ml 1N KOH-CHOH溶液，于75?水浴25min，经流水冷却后，加入3 ml 2N 3 HCL-CHOH溶液，于75?水浴25min，经流水冷却后，加入l ml的正己烷振荡，然3 后静置萃取(适量加水有助于分层)，取上清液进行色谱分析。 组织样品在 4?下解冻，剪碎，按1:9 重量体积比(w/v)加入预冷的 50mmol/L 磷酸缓冲液(pH 值 7.4)，然后匀浆(均在冰上操作)。匀浆液经 5000 r/min 离心 15min，取上清液备用。 超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的测定采用南京建成生物研究所的试剂盒，具体测定方法参照试剂盒的说明书。 SOD活性用SOD试剂盒(黄嘌呤氧化酶法)测定，其活性单位定义为:在37?条件下，每毫克组织蛋白在1ml 反应液中SOD抑制率达50,时所对应的SOD量为一个SOD活力单位。 CAT活性用CAT试剂盒测定，其活性单位定义为:每克组织蛋白中过氧化氢酶(CAT)每秒钟分解吸光度为0.50~0.55的底物中的过氧化氢相对量为一个过氧化氢酶的活力单位。 -1丙二醛MDA用 TBA 法测定(nmolmg prot)(Rueda-Jasso等，2004)。 组织匀浆液的蛋白含量以福林--酚试剂法测定(Lowry等，1951)。 4 数据处理和统计方法2. 采用Statistica 6.0统计软件对所得数据进行单因素方差分析(ANOVA)，若差异达到显著，进行Duncan多重比较，显著性水平为P<0.05。 3.实验结果 3.1 鱼体生化组成 氧化鱼油和维生素E对大黄鱼的鱼体水分、蛋白质和灰分含量没有显著的影响(P>0.05)，但是对鱼体脂肪含量产生了显著的影响(P <0.05)(表4)。未补充维生 -1素E时，氧化鱼油处理组大黄鱼体脂肪含量均低于新鲜鱼油对照组。补充600mg kg维生素E时，大黄鱼鱼体的脂肪含量升高。新鲜鱼油中补充维生素E的处理组(饲 ?1料5，1.72 meq kg+VE)大黄鱼的体脂肪含量最高。 3.2过氧化氢酶(Catalase, CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD) 氧化鱼油和维生素E对大黄鱼血清过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性造成了显著的影响(P<0.05)。未补充维生素E时，随鱼油过氧化值的升高，大 黄鱼血清CAT和SOD活性显著升高(P <0.05)。补充维生素E后，新鲜鱼油组大黄鱼血清CAT和SOD的活性升高，而氧化鱼油(28.29-104.21 meq/kg)的处理组的大黄鱼血清CAT和SOD活性显著降低(P<0.05)(表5)。 3.3肝脏丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量 氧化鱼油和维生素E对大黄鱼肝脏中丙二醛的含量产生了显著的影响(P<0.05)。未补充维生素E时，新鲜鱼油组大黄鱼肝脏丙二醛的含量最低，氧化鱼油组大黄鱼肝脏丙二醛含量随着过氧化值的升高而显著增加(P<0.05)。补充维生素E显著降低了肝脏丙二醛的含量(P<0.05)，但各处理组间差异不显著(表5)。 4 讨论 从实验中4种不同鱼油的脂肪酸测定结果得知，新鲜鱼油的高不饱和脂肪酸的总量高于氧化鱼油的，随氧化程度的升高，高不饱和脂肪酸的总量下降。高不饱和脂肪酸(特别是EPA和DHA)含量随氧化程度的加大而降低(表3)。 很多研究显示，鱼体的脂肪含量和脂肪酸组成受到饲料中脂肪特性的影响(Estévez 等, 1997; Kestemont 等, 2001; Lewis-McCrea 和 Lall, 2007; López 等, 2009)。本实验中，氧化鱼油使大黄鱼鱼体的脂肪含量下降，而补充维生素E使脂肪含量上升。这可能是由于维生素E阻止了脂肪的氧化，保证了鱼体内脂类的正常代谢。 本实验的结果显示，氧化鱼油使大黄鱼血清中过氧化氢酶(CAT)和超氧化物岐化酶(SOD)的活性升高，补充高浓度的维生素E，则降低了这两种抗氧化酶的活性。这与Mourente 等(2002)的发现相一致，他们发现氧化鱼油提高了海鲷(Sparus aurata)的CAT和SOD活性，而添加维生素E则降低了酶的活性。Fontagné 等(2006)也发现氧化鱼油使西伯利亚鲟鱼(Acipenser baeri)的SOD活性升高。氧化鱼油使抗氧化酶的活性提高，分析其原因可能是大黄鱼摄食氧化的鱼油后细胞中氧自由基等生物活性物质的浓度会升高，即抗氧化酶反应底物的浓度增加，提高了SOD和CAT的活性。 丙二醛是脂肪过氧化最重要的产物之一，与动物在逆境下遭受伤害与活性氧积累诱发的过氧化作用密切相关。丙二醛含量一定程度上反映了动物遭受到的氧化胁迫压 力的大小。本实验发现，结果与之相似。Tocher 等(2003)也发现在饲料中添加氧化脂肪，会导致鱼体内的过氧化物产物含量增加。由过氧化产物引起的氧化胁迫压力可能是导致摄食氧化鱼油饲料的大黄鱼生长下降的原因。 表1 不同氧化程度鱼油和维生素E添加对大黄鱼生长影响实验设计 Table 1 Experimental design 处理组(过氧化值) 鱼油过氧化值 维生素E添加量 -1?1?1Diet(POV meq kg) POV (meq kg) VE supplementation (IU kg) 1饲料1(Diet 1, 1.72) 1.72 0 2饲料2(Diet 2, 28.29) 28.29 0 3饲料3(Diet 3, 62.79) 62.79 0 4饲料4(Diet 4, 104.21) 104.21 0 5饲料5(Diet 5, 1.72+VE) 1.72 600 6饲料6(Diet 6, 28.29+VE) 28.29 600 7饲料7(Diet 7, 62.79+VE) 62.79 600 8饲料8(Diet 8, 104.21+VE) 104.21 600 1 添加新鲜鱼油(Fresh fish oil) 2 添加较低过氧化值的氧化鱼油(Supplemented with oxidized fish oil of low peroxide value)。 3添加中等过氧化值的氧化鱼油(Supplemented with oxidized fish oil of middle peroxide value)。 4添加较高过氧化值的氧化鱼油(Supplemented with oxidized fish oil of high peroxide value)。 5添加新鲜鱼油，补充维生素E(Fresh fish oil, with vitamin E supplementation)。 6添加较低过氧化值的氧化鱼油，补充维生素E(Supplemented with oxidized fish oil of low peroxide value, with vitamin E supplementation)。 7添加中等过氧化值的氧化鱼油(Supplemented with oxidized fish oil of middle peroxide value, with vitamin E supplementation)。 8添加较高过氧化值的氧化鱼油(Supplemented with oxidized fish oil of high peroxide value, with vitamin E supplementation)。 表 2 实验基础饲料配方及营养组成(%干物质) Table 2 Formulation and proximate composition of the experimental diets (% dry matter) 饲料 饲料 1 饲料2 饲料3 饲料4 饲料5 饲料6 饲料7 饲料8 Diet no. Diet 1 Diet 2 Diet 3 Diet 4 Diet 5 Diet 6 Diet 7 Diet 8 原料(Ingredients) 1鱼粉(Fshmeal) 43.0 43.0 43.0 43.0 43.0 43.0 43.0 43.0 豆粕(Soybean meal) 15.0 15.0 15.0 15.0 15.0 15.0 15.0 15.0 2鱼油(EQ free Oil) 7.0 7.0 7.0 7.0 7.0 7.0 7.0 7.0 啤酒酵母(Beer yeast) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 小麦粉(Wheat meal) 25.2 25.2 25.2 25.2 25.2 25.2 25.2 25.2 维生素预混料 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 3(Vitamin mix) 矿物质预混料 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 3(Mineral mix) 化学组成 Chemical analyses (%) 干物质(Dry matter) 92.6 92.8 92.9 92.6 92.2 92.2 92.8 92.0 蛋白质(Crude protein) 脂肪(Crude lipid) 12.9 13.1 12. 9 12.7 13.1 13.3 13.0 13.2 灰分(Ash) 12.4 13.6 13.8 14.0 12.4 14.1 14.1 14.3 1鱼粉为日本白鱼粉(蛋白含量为69.70%，脂肪含量为7.07%)。 2 未添加抗氧化剂的鱼油从山东圣达鱼粉和鱼油有限公司购得(Shandong , China)。 3 维生素和矿物质预混料组成，参见Ai 等 (2006)。 表3 新鲜鱼油和3种不同氧化程度鱼油的脂肪酸组成 Table3 Fatty acid composition of Fatty acid composition of fish oil with different POV 脂肪酸(%总脂肪酸) Low POV Middle POV High POV Fresh fish oil Fatty acid(%Total fatty fish oil fish oil fish oil -11.72 meq.kg -1-1-1acid) 25 meq.kg 50 meq.kg 100 meq.kg C16:0 20.07 20.02 20.68 20.97 C18:0 3.36 3.37 3.46 3.52 C20:0 5.14 5.25 5.32 5.37 ΣSAF 28.58 28.64 29.46 29.86 C16:1 6.81 6.82 7.06 7.16 C18:1n-7 10.05 10.18 10.36 10.53 C18:1n-9 2.38 2.42 2.44 2.47 ΣMUFA 19.23 19.42 19.87 20.15 C18:2n-6 1.98 1.97 1.96 1.98 C18:3n-3 1.35 1.33 1.30 1.31 C20:5:n-3(EPA) 0.61 0.60 0.57 0.57 C22:6n-3(DHA) 9.70 9.54 8.84 8.91 ΣPUFA 11.26 11.17 10.06 9.47 注:SAF: 饱和脂肪酸; MUFA:单不饱和脂肪酸; PUFA:多不饱和脂肪酸。 表4 不同氧化程度的鱼油和维生素E对大黄鱼鱼体组成的影响 Table 4 Body composition of large yellow croaker fed diets containing oxidized fish oil 1and vitamin E 粗蛋白 粗脂肪Crude 灰分 饲料(过氧化值)Diet水分 Crude protein lipid Crude ash -1(POV meq kg) Moisture (%) 2(% w.w.) (% w.w.) (% w.w.) a14.7 5.3 3.7 饲料1 (1.72) 76.8 bc14.5 4.5 3.9 饲料2 (28.29) 77.9 c14.6 4.2 3.8 饲料3 (62.79) 78.2 ab饲料4 (104.21) 77.3 15.0 4.8 3.6 a14.8 5.4 3.9 饲料5 (1.72VE) 76.6 ab14.4 5.1 3.8 饲料6 (28.29VE) 77.6 abc14.9 4.7 3.7 饲料7 (62.79VE) 77.4 ab14.8 4.9 3.9 饲料8 (104.21VE) 77.3 总体误 0.41 0.23 0.82 0.09 3Pooled S.E.M. 单因素方差分析 4ANOVA F值(F value) 1.400 0.550 2.309 0.960 P值(P value) 0.232 0. 784 0.045 0.473 1 数据为三个网箱数据的平均值(n=3)。同一列中有相同的上标字母表示差异不显著 (P > 0.05, Duncan’s test). 2 w.w.: 湿重(Wet weight)。 3 S.E.M.: 平均值标准误(Standard error of means)。 4 ANOVA: 单因素方差分析(One-way analysis of variance)。 表5 饲料中添加不同氧化程度的鱼油和维生素E对大黄鱼血清过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和肝脏丙二醛(MDA)含量的影响 Table 5 Catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD) and the liver malondialdehyde (MDA) concentration of large yellow croaker fed diets containing different levels of 1oxidized fish oil and vitamin E 饲料(过氧化值)Diet 超氧化物歧化酶丙二醛 过氧化氢酶 -1(POV meq kg) CAT SOD MDA decc1.68 232.38 饲料1 (1.72) 2.54 cabb饲料2 (28.29) 3.01 316.36 6.31 babab4.33 348.39 饲料3 (62.79) 7.77 aaa5.14 364.07 饲料4 (104.21) 8.21 deabc1.94 338.37 饲料5 (1.72VE) 2.01 eabc1.43 308.47 饲料6 (28.29VE) 2.05 cbc饲料7 (62.79VE) 2.54 293.78 2.08 cdbc2.31 301.17 饲料8 (104.21VE) 2.11 总体标准误 0.19 14.66 0.43 Pooled S.E.M. 单因素方差分析 ANOVA F值(F value) 29.423 5.668 23.050 P值(P value) 0.000 0.002 0.000 1数据为三个网箱数据的平均值(n=3)。同一列中有相同的上标字母表示差异不显著 (P > 0.05, Duncan’s test)。 2 S.E.M. :平均值标准误(Standard error of means)。 3 ANOVA:单因素方差分析(One-way analysis of variance)。 参考文献: 彭士明, 陈立侨, 叶金云, 龙章强, 李二超, 王伟, 王友慧, 2007. 饲料中添加氧化鱼油 对黑鲷幼鱼生长的影响. 水产学报 ,3l(增刊). 任泽林, 曾虹, 霍启光, 周文豪, 范志影, 2000. 氧化鱼油对鲤肝胰脏抗氧化机能及其 组织结构的影响. 大连水产学院学报, 15(4). 徐继林, 严小军, 傅惠萍, 刘清, 2005. 鱼油脂肪酸的自由基氧化变化研究. 中国食品 学报 5, 5-10. 叶仕根, 汪开毓, 何显荣 ,2006. 鲤摄食含氧化鱼油的饲料后其病理学的变化. 大连水 产学院学报,21(1). 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