牦牛角真皮乳头cDNA文库的构建_cropped

牦牛角真皮乳头cDNA文库的构建_cropped 摘要 构建 cDNA 达文库用于克隆和研究牦牛角生长相关基因 。Trizol 提取牦牛角真皮乳头总 RNA 并纯化 mRNA ,用 ZAP Express cD2 NA Synthesis Kit 合成双链 DNA ,进行末端修饰 ,接入 ZAP 表达载体 。经 Gigapack ? Gold Packaging extract 体外包装 ,转染 XL12Blue MRF’宿 7 主菌 ,形成初级文库 ,初级文库进一步扩增形成稳定的 cDNA 文库 。结果表明 ,文库库容量为 4 ×10,重组率达 93 % ,为进一步从文库中 筛选相关基因提供了有效工具 。 关键词 牦牛 ;角 ;真皮乳头 ;cDNA 文库 () 文章编号 0517 - 6611 200712 - 03495 - 02 中图分类号 Q789 文献标识码 A Construction of the Horn Dermal Papilla cDNA Library in Bos mut us ( )CHEN Jia et al College of Animal Science & Technology ,Northwest A&F University , Yangling ,Shaanxi 712100 Abstract The total RNA was extracted from the dermal papillae of Bos mutus horns ,and the mRNA was purified. The double2strand DNA was synthesized ΙΙwith ZAP Express cDNA Synthesis Kit ,dsDNA was ligated with EcoRadapter and phosphorylated ,and then digested by Xho. The cDNA fragments were ligated with the ZAP Express vector . The ligated cDNA were packed and incubated with XL1 2Blue MRF’to construct primary library. The primary library 7 was amplified to make a stable library. The content of the stable cDNA library was 4 ×10and the recombination was 93 %. Key words Bos mutus ; Horn ;Dermal papilla ;cDNA library ( ) RNA 中的 mRNA 进行分离纯化 ,具体操作按书进行 ,并牦牛 Bos mutus是我国青藏高原特有的一种偶蹄动物 , 生活在海拔 3 000 m 以上的山地 ,无论在生物学还是遗传学 且测定其含量 。 μ 1. 2. 3 cDNA 第一链 、第二链的合成 。取 mRNA 3 g ,与含研究中 ,牦牛都有着独特的 、不可替代的重大意义 。牦牛角 ( ) Oligo T的引物 、DNA 合成底物 、RNA 酶抑制剂及反转录酶在 属于洞角 ,是由特化的角质鞘包围额骨上的骨质突而形成 , 连接角质鞘和骨质突的是皮肤的真皮延伸部分 ,嵌入角质外 适当条件下合成第一链 ;冰浴终止反应 ,再加入第二链合成 Ι 壳的真皮乳头极为发达 ,赋予牦牛角超乎想象的强度 。 底物 ,RNase H 及 DNA 聚合酶进行第二链合成 。 Ι 1. 2. 4 连接载体 。在合成好的双链 cDNA 两边加上 EcoR真皮乳头能分泌多种细胞因子和生长因子 ,对皮肤衍生 Ι的接头 ,用 Xho进行酶切 。酶切好后的双链 cDNA 被重新 物形态发生的诱导和调节作用已有大量证据证明 ,例如 ,哺 沉淀提取出来 ,分级分离后测定其含量 。按照 100 ng DNA?乳动物的毛囊 、牙齿 、蹄 ,鸟类的羽毛 、喙等 。洞角亦是皮肤 μ衍生物 ,真皮乳头在其形态发生和生长过程中也应具有上述 1g载体的比例与载体连接 。 (μ) 1. 2. 5 体外包装 。向连接反应物中加入 1 管 25l 包装蛋 作用 ,但至今国内外均未见有关研究报道 。 () 白 ,22 ?孵育 ,加入 SM buffer 及氯仿后混匀 ,短暂离心沉淀碎 上皮 —间充质相互作用是研究器官 包括皮肤衍生物 () 片 ,转出上清 ,即已得到初级文库 。形态发生的 发育生物学热点领域 ,对牦牛角形态发生的研 1. 2. 6 初级文库的重组率测定 。XL12Blue MRF’宿主菌培养 究不仅可以与毛囊生物学相辅 ,更可为上皮 —间充质相互作 至 OD约为 0. 7 ,离心弃上清 ,用 10 mmol/ L 灭菌 MgSO溶 用提供新的研究模型 。该实验构建牦牛角真皮乳头 cDNA 文 600 4 解 ,取适量初级文库与宿主菌共孵育 ,向孵育物中顺次加入库 ,为进一步研究真皮乳头的功能基因在牦牛角形态发生过 NZY top agar 、0. 5 mol/ L 的 IPTG、X2gal 后立即倒入干燥 、预热 程中的作用奠定基础 。 的 NZY 琼脂平板 ,均匀涂布 ,凝固后倒置培养过夜 。初级文 1 与方法 ) ( 库重组率 = 白 色 噬 斑 数/ 蓝 色 噬 斑 数 + 白 色 噬 斑 数× 1. 1 动物材料和试剂 100 %。1. 1. 1 动物材料 。牦牛角采自青海省西宁市乐家湾畜产品 1. 2. 7 文库的扩增及滴度测定 。提前准备宿主菌的肉汤培 加工园区 ,剥除角质外壳后 ,取真皮层用 4 %多聚甲醛固定 养物 ,将原始文库等分 ,每一份与适量宿主菌共孵育 ,加入 备用 。 (NAY top agar 后倒入 NZY 平板 ,凝固后倒置培养 6,8 h 根据 1. 1. 2 试剂 。Trizol Reagent 购自 Invitrogen 公司 ,mRNA 纯化 ) 噬菌斑大小控制时间。用 SM buffer 涮 洗 平 板 , 收 集 到 的试剂盒购自 Qiagen 公司 , ZAP Express cDNA Synthesis Kit and # buffer 加入氯仿离心 ,收集上清 ,测定滴度 ,加 DMSO 后分装 ( ZAP Express cDNA Gigpack Gold Cloning Kit Catalog 200451 , 3 ( 保存于 - 80 ?。文 库 滴 度 = 噬 斑 数 ×稀 释 倍 数 ×10) Stratagene。 μ) l/ ml/ 铺平板用稀释库的微升数 。 1. 2 实验方法 2 结果与分析1. 2. 1 总 RNA 的提取 。刮取真皮层乳头在 Trizol 中研磨 ,加 2. 1 组织样品的分离纯化 由于真皮乳头与角质外壳嵌合 入氯仿分离 ,上清用预冷的异丙醇沉淀 ,再用 75 %的乙醇洗 紧密 ,用工具剥除牦牛角的角质外壳后 ,真皮层的乳头表面 涤 ,最后溶于 DEPC 水中备用 。还附着大量角质与黑素细胞 ,加之新鲜组织含水量大 ,角质 1. 2. 2 mRNA 的分离纯化 。使用 Qiagen 的纯化试剂盒对总 细胞与真皮乳头很难分离 。笔者采用以下步骤分离纯化角 () 作者简介 陈佳 1982 - ,女 ,重庆人 ,硕士研究生 ,研究方向 :动物生物 真皮乳头 :4 %多聚甲醛固定角真皮 ?徕卡体视显微镜下用 技术 。 3 通讯作者 。 手术刀分离真皮乳头 ?生理盐水反复冲洗 ?将分离得到的 收稿日期 2006212220 5 Trizol 中研磨 ,提取足量总 RNA 用于构建文库 。(真皮乳头于 ) 直径 1,2 mm。经计算 ,初级文库的库容量为 6. 07 ×10, 7 2. 2 总 RNA 纯度及完整性检测与 mRNA 的纯化 RNA 的 重组率高达 93 % ,扩增后 ,文库滴度为 4 ×10pfu/ ml 。根据美 质和量是文库构建的基础 ,笔者用 ND21000 核酸蛋白检测仪 国 Clontech 公司的质量标准 ,笔者所构建的文库质量良好 ,理 测定总 RNA 样品 OD/ OD的值 ,平均为 1. 83 ,纯度较高 ,论上可以涵盖与重要功能蛋白相对应的稀有 mRNA 的克隆 。260280 甲醛变性凝胶电泳检测其完整性 ,如图 1 所示 , RNA 几乎未 3 讨论 () 被降解 ;用 Qiagen 公司的迷你型 Oligo dT纤维柱纯化试剂盒 构建 cDNA 表达文库是克隆已知基因特别是发现新基 因的主要手段和途径 ,这对研究器官发育过程中细胞基因组 纯化 mRNA ,并用 ND21000 核酸蛋白检测仪测定其纯度和含 μ 量 , OD/ OD的值为 2. 0 ,含量为 3. 5 g 。上述说明 RNA的转录表达特征有重要意义 。该文库的构建对研究牦牛角 260280 的含量和纯度均已达到 cDNA 合成和文库构建的要求 。形态发生及生长的分子机理而言是一项基础而重要的工作 , 2. 3 cD NA 的分级分离 用梯度离心法对 cDNA 离心分离 ,有利于进一步研究 、筛选和克隆控制其生长发育相关基因 。 并进行电泳检测 ,电泳结果见图 2 ,最小片断约为 300 kb 。参考文献 1 萨姆布鲁克 J ,拉塞尔 D W. 分子克隆实验指南M. 3 版. 北京 :科学出 版社 ,2002. 2 张晓军 ,王兵 ,张绍萍 ,等. 中国对虾 6 种组织 cDNA 文库的构建J . 海 () 洋学报 ,2005 ,27 5:92 - 95. 3 李文卉 ,罗建勋 ,殷宏 ,等. 微小牛蜱幼蜱 cDNA 表达文库的构建J . 中 () 国兽医科技 ,2005 ,35 12:994 - 996. 4 杜昀泽 ,徐文新. 从石蜡包埋组织中提取 DNA 进行 PCR 扩增的影响 () J . 国外医学 :临床生物化学与检验学分册 ,1996 ,17 4:182 - 183. 5 李海军 ,柳刚 ,蒋会勇 ,等. 固定剂及固定时间对 DNA 提取质量的影响 () J . 诊断病理学杂志 ,2004 ,11 3:182 - 184. 6 BIELAWSKI K, ZACZEK A ,LISOWSKA U ,et al . The suitability of DNA ex 2 图 1 总 RNA 的提取 图 2 cD NA 分级分离 tracted from formalin2fixed , paraffin2embedded tissues for double differential 2. 4 初级文库重组率与扩增文库滴度的测定 此实验步骤 polymerase chain reaction analysis international J .J Mole Med ,2001 ,8 :573 - 578. 难点在于文库扩增时对噬菌斑大小的掌握 。根据说明书要 7 MOTOI NISHIMURA , NORIHIDE YOKOI. Construction of a multi 2functional 求噬菌斑生长时间为 6,8 h ,研究发现 ,将噬菌斑生长时间 cDNA library specific for mouse pancreatic islets and its application to microar2 rayJ . DNA Research ,2004 ,11 :315 - 323. 延长 2,3 h 效果更好 , 但又不超过重组噬菌斑的大小要求 ()上接第 3482 页 RNA 质量较高 ,RT2PCR 后获得了目的片断 ,为后续分子 的 μμ 取 2l RNA 样品 ,加入 98l DEPC 处理的水后 ,在核酸 生物学的研究打下了基础 。 蛋白 分 析 仪 上 测 定 , 发 现 CTAB 法 和 SDS 法 提 取 RNA 的 OD/ OD分别为 1. 926 4 和 1. 903 1 ,说明提取的 RNA 无260 280 β 杂质污染 , 提取过程中加入的 CTAB 、SDS、2巯基乙醇 、PVP 等物质能有效地去除多糖 、蛋白质 、酚类物质等的干扰 。 图 2 银杏 PAL 基因的 RT2PCR 图谱 参考文献 1 莫小路 ,黄学林. 银杏悬浮培养细胞的生长 、分化与萜内脂化合物的积 () 累J . 生物工程学报 ,2004 ,20 3:445 - 449. 2 程水源 ,陈昆松 ,杜何为 ,等. 银杏 RNA 的提取J . 果树学报 ,2005 ,22 () 4:428 - 429. 3 蒋建雄 ,张天真. 利用 CTAB / 酸酚法提取棉花组织总 RNAJ . 棉花学 图 1 银杏叶片总 RNA 图谱 () 报 ,2003 ,15 3:166 - 167. 4 杨谷良 ,谭晓风. 热硼酸盐法提取梨雌蕊 RNA 方法改进及提取效果 分别以 CTAB 法和 SDS 法提取的银杏叶片 RNA 为 () J . 西北林学院学报 ,2006 ,21 2:54 - 56. 进行逆转录 ,以逆转录得到的 cDNA 为模板 ,利用引物对 UP 5 ( )程超华 ,赵立宁 ,减巩固 ,等. 一种提取悬铃叶苎麻[ B . tricuspis Hance () Marino 花序 RNA 的方法J . 中国麻业 ,2006 ,28 2:76 - 78. 和 DOWN 进行 PCR 扩增 ,扩增结果如图 2 所示 ,均得到了一 6 张今今 ,王跃进 ,王西平 ,等. 葡萄总 RNA 提取方法的研究J . 果树学 条大小为 670 bp 左右的扩增条带 。 () 报 ,2003 ,20 3:178 - 181. 7 刘海 ,林德球 ,徐杰 ,等. 一种从富含香蕉水果果肉的多酸和多酚化合 3 结论() 物中提取 RNA 简单和快捷的方法J . 果树学报 ,2006 ,23 1:136 - 137. 由于所选择的材料为银杏的老叶 ,多糖 、酚类等物质含 8 曹庆芹 ,湛谋华 ,伊华林 ,等. 柑橘及近缘属总 RNA 的有效提取J . 果 2 () 树学报 ,2005 ,22 4:426 - 427. 量较高,提取高纯度的 RNA 有一定的难度 。在提取过程 9 TRIzol plus RNA purification kit manuals EB/ OL . 2006 209220 . http :/ / β中 ,使用了亚精氨 、2巯基乙醇和 PVP 等物质 ,同时 ,增加了 www. invitrogen. com/ content/ sfs/ manuals/ 15596026. pdf . 10 () NaAc 等的纯化步骤 ,降低了多糖 、酚类等的干扰,所获得10 李宏. 植物组织 RNA 提取的难点及对策J . 生物技术通报 ,1999 1: 36 - 39.