雷公藤多苷片高效液相指纹图谱的研究

雷公藤多苷片高效液相指纹图谱的研究 杨春欣，梁 健，沈 熊，吕迁州 (复旦大学附属中山医院药剂科药学研究室，上海 200032) 摘要:目的 雷公藤多苷片有抗炎及抑制细胞免疫和体液免疫等作用，是治疗类风湿性关节炎、肾病综合征、皮肤病等自身免疫性疾病的药物。目前雷公藤多苷片质量控制还不太完善，建立雷公藤多苷片的高效液相指纹图谱,为全面而有效地控制雷公藤多苷片的质量，对临床用药的有效性和安全性有很大的意义。方法 取不同生产厂家的雷公藤多苷片，采用高效液相色谱法，色谱柱为Diomonisl C分析18-1 柱，检测波长为218nm，柱温为35?，以水-乙腈为流动相，1.0mL?min的流速,梯度冼脱。结果 获得雷公藤多苷片的指纹图谱。其指纹图谱的方法有较好的重现性、精密度和稳定性。不同样品的高效液相指纹图谱的主要峰基本一致，提示不同厂家及批号的雷公藤多苷片的主要成分基本相同，但含量有所不同。确定了18个峰为雷公藤多苷片的共有峰，初步建立了雷公藤多苷片的HPLC指纹图谱，为衡量其质量优劣提供了依据。结论 利用雷公藤多苷片HPLC指纹图谱可以较好地反映雷公藤多苷片的内在质量，且该方法简便，快速，有效，灵敏，有助于雷公藤多苷片的质量控制。 关键词:高效液相色谱法，指纹图谱，雷公藤多苷片，雷公藤内酯醇 雷公藤多苷片是卫矛科(Celastraceae)雷公藤属雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f. )的干燥去皮根经提取、纯化后得到的有效组分。雷公藤多苷片与其它雷公藤制剂相比具有 [1]用量小,不良反应少等优点，雷公藤多苷片广泛应用于治疗类风湿性关节炎、肾病综合征、白塞氏三联征、麻风、自身免疫性肝炎及皮肤病等疾病，疗效显著，其生理活性是由二萜 [2]内酯、生物碱、三萜等多种成分协同产生。雷公藤多苷片是目前临床上使用较多的非甾体类免疫抑制剂。 目前国内雷公藤多苷片至今还没有很完善的质量控制标准,仅对雷公藤内酯醇或雷公 [3,4,5]藤内酯甲进行控制，以至不同厂家的产品存在不同程度的差异，为了准确地控制雷公藤 [6]多苷片中有效成分群的含量，建立雷公藤多苷片的指纹图谱，对其临床用药的有效性和安全性有很大的意义。 1 仪器与材料 Gillson 高效液相色谱仪系统，包括:306型泵，119紫外/可见光检测器，715色谱处理系统，Rheodyne 9125型进样阀，配以20 μL采样环，805测压仪，811C动态混合器，Gilson818柱温箱。EYELA旋转蒸发仪N1001型 (日本东京理化器械株式会社)。B2500S-MTH型超声波清洗仪(上海必能信超声有限公司)。AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)。雷公藤多苷片A,H共8个批号(上海复旦复华制药厂和江苏泰州美通制药厂);雷公藤内酯醇对照品,含量99.53%,雷公藤内酯甲，含量99.17%，均购自上海科卫医疗技术研究所。中性氧化铝，上海五四化学试剂厂生产;微孔滤膜，孔径0.45μm， 1 上海半岛实业有限公司净化器材厂生产。乙酸乙酯,分析纯;乙腈(色谱纯 ，美国Fisher公司);自制纯水;其他溶剂均为分析纯。 2 方法与结果 2.1 供试品溶液的制备:采用均匀取样法从雷公藤多苷片取出15片，研细成粉，精密称取400mg，置于25mL三角烧瓶中，加入20mL乙酸乙酯，超声提取30min，过滤，滤液过15 g中性氧化铝柱，用30mL乙酸乙酯洗脱，收集全部过柱后的洗脱液，回收乙酸乙酯，得残存物，加1.5mL乙腈溶解，0.45μm微孔滤膜过滤，备用。 2.2 雷公藤内酯醇对照品溶液的制备:精密称取干燥恒重的雷公藤内酯醇对照品 -10.00081g，用乙腈溶解并定容在10mL容量瓶中，制成浓度为0.081mg?mL对照品溶液，备用。 2.3 色谱条件:色谱柱:Dikma公司Diamonisl C (250 mm×4.6mm,5μm);流动相: 水(A)18 -1-乙腈(B)，梯度洗脱:0,70min，A: 65%,0%，B:35%,100%;流速:1.0mL?min ，检测波长: 218nm;柱温:35?;进样体积:20μL。 2.4 指纹图谱方法学建立与考察 2.4.1检测波长的比较: 本实验选择了210，215，218，219，225nm五个波长进行测定，结果在波长218nm下出现的色谱峰数目适中，内参物雷公藤内酯醇的色谱峰完整，且基线平稳，故选择218nm作为雷公藤多苷片HPLC指纹图谱的检测波长。 2.4.2不同流动相及洗脱方法的比较:采用乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸等不同流动相进行等度或梯度洗脱，结果发现含有磷酸的流动相并不能改变峰型。采用梯度洗脱, 可兼得二者的优点。见1。 表1 梯度洗脱 方案 时间(min) 乙腈(%) 水(%) 1 ? 15 35 65 1 15 ? 40 35 ? 100 65 ? 0 2 0 ? 40 40 ? 100 60 ? 0 3 0 ? 60 40 ? 100 60 ? 0 0 ? 30 20 80 4 30 ? 60 20 ? 100 80 ? 0 60 ? 70 100 0 5 0 ? 70 40 ? 100 60 ? 0 6 0 ? 70 35 ? 100 65 ? 0 2 结果发现在方法6的条件下，雷公藤内酯醇的保留时间和峰面积较稳定，与相邻其他色谱峰分离较好，且其它各色谱峰之间的分离效果也较好，且基线平稳，各峰峰形也较好，故最终选择6作为本实验高效液相色谱法的流动相。 2.4.3不同提取方法的比较:由于雷公藤多苷成分复杂，因此采用不同溶剂、洗脱柱、洗脱溶剂进行分离，见表2，以便获得良好的色谱图。 表2 雷公藤多苷片的提取方法 方法 提取溶剂 洗脱柱 洗脱溶剂 1 氯仿 中性氧化铝 氯仿 2 氯仿 中性氧化铝 甲醇 3 氯仿 硅胶 氯仿 4 氯仿 硅胶 甲醇 5 氯仿 硅胶 甲醇-氯仿(1:9) 6 氯仿 硅胶 甲醇-氯仿(1:1) 7 氯仿 中性氧化铝 甲醇-氯仿(1:9) 8 氯仿 中性氧化铝 甲醇-氯仿(1:1) 9 氯仿 硅胶-中性氧化铝复合柱(1:1) 氯仿 10 无水乙醇 中性氧化铝 乙酸乙酯 11 蒸馏水 过MCI之后过中性氧化铝 乙酸乙酯 12 乙酸乙酯 中性氧化铝 乙酸乙酯 结果发现，使用乙酸乙酯作为提取溶剂和洗脱剂，中性氧化铝作为洗脱柱为最佳的样品提取方法。 2.4.4稳定性试验: 取雷公藤多苷片样品A的供试品溶液，分别在0、2、4、8、12h进样测定。以雷公藤内酯醇为内参比峰，计算各共有峰的色谱相对保留时间和相对峰面积。结果显示，18个共有峰的色谱相对保留时间的RSD均小于0.56%、相对峰面积的RSD均小于5.67%。 2.4.5精密度试验: 取雷公藤多苷片样品B的供试品溶液，连续进样5次，计算各共有峰的色谱相对保留时间和相对峰面积。结果18个共有峰的色谱相对保留时间的RSD均小于0.52%、相对峰面积的RSD均小于4.66%。 2.4.6重现性试验: 取雷公藤多苷片样品A，平行取5份，按供试品溶液制备方法提取，得供试品溶液，分别进样检测，计算各共有峰的色谱相对保留时间和相对峰面积。结果显示，18个共有峰的色谱相对保留时间的RSD均小于0.6% 、同时以雷公藤内酯醇峰面积为观察指标，其峰面积的RSD为3.46% 2.4.7共有指纹峰的确定: 在色谱指纹图谱研究中，不同样品中相对保留时间相同的峰，称为色谱指纹图谱共有峰。按上述方法制备了2个厂家8批雷公藤多苷片的供试品，注入 3 色谱仪，记录色谱图，其典型的HPLC的色谱指纹图谱见图1。 A S t/min A 雷公藤多苷片指纹图谱 S 对照品图谱: 2.雷公藤内酯醇 18.雷公藤内酯甲 图1 雷公藤多苷片样本的指纹图谱 结果显示，共出现色谱峰近50个，其中22个为各样品所有。考虑到溶剂对保留时间小于5min的色谱峰的影响，并以单峰面积大于或等于1%为选择标准，确定了18个峰为共有色谱指纹峰，其共有指纹峰的总面积占总峰面积的90 %以上。 2.4.8雷公藤多苷片样品相对保留时间的分析: 选择2号峰(雷公藤内酯醇)为参照物，此峰为所有样品中共有，分别求出各特征峰的调整保留时间之比(α值)，结果见表3。 4 表3 雷公藤多苷片样品相对保留时间的分析 相对保留时间 峰号 范围 α值 RSD% 1 0.6571,0.6674 0.6633 0.38 2 1.0000 1.0000 0.00 3 1.4434,1.4675 1.4604 0.88 4 1.5199,1.5633 1.5467 1.49 5 1.6294,1.6577 1.6488 1.13 6 1.8476,1.8919 1.8780 1.53 7 1.9213,1.9470 1.9374 1.00 8 2.0168,2.0729 2.0568 1.86 9 2.1047,2.1679 2.1494 2.08 10 2.2079,2.2805 2.2575 2.33 11 2.4021,2.4916 2.4647 2.91 12 2.4541,2.5470 2.5185 2.99 13 2.5438,2.6309 2.5978 2.58 14 2.6627,2.7126 2.6826 1.68 15 2.8036,2.8602 2.8350 1.94 16 3.0101,3.0763 3.0471 2.31 17 3.0756,3.1445 3.1100 2.59 18 5.2153,5.2964 5.2605 2.58 2.4.9共有指纹峰的相对峰面积: 以图谱中雷公藤内酯醇为内参物，将各色谱峰峰面积与 同一图谱中内参物的峰面积比较，其比值为各色谱峰的相对峰面积，见表4。 表4 8个雷公藤多苷片样品特征(峰)成分相对含量 峰号 样品的相对峰面积 A B C D E F G H 1 3.8910 4.6068 8.3091 6.8045 13.9921 5.8076 8.2454 2.6284 2 1 1 1 1 1 1 1 1 3 0.5450 0.3962 0.5823 1.2165 0.2581 0.2174 0.2414 0.2033 4 0.6100 0.4495 0.7321 1.1416 0.2677 0.1377 0.5564 0.5579 5 0.8891 0.6991 1.8121 1.4908 1.4269 0.7955 0.9461 0.6579 6 1.0561 1.1507 2.8491 3.1387 1.9575 1.7891 1.5894 1.4578 7 0.7319 0.7892 1.5908 1.9621 0.9265 0.6537 0.7495 0.7837 8 5.0417 5.6876 10.8064 11.2999 6.6612 4.1904 5.5447 6.1135 9 4.4203 4.5320 10.3477 9.3618 4.4994 3.2274 3.5701 5.4567 10 4.8472 5.1394 12.4808 10.7411 4.1611 2.3332 4.0474 6.6463 11 1.1928 1.4817 2.5346 3.9365 1.858 1.091 1.4106 1.1739 12 2.0248 2.6368 7.1231 4.6612 7.9467 5.2452 6.6606 3.6661 13 6.2671 5.7545 17.8339 12.4137 4.1802 2.4565 4.1547 8.0255 14 10.2483 10.9751 21.8945 15.8692 21.3303 16.3802 18.8213 16.8209 15 2.8471 2.5745 7.5838 5.9659 3.3999 2.1645 3.051 4.0458 16 7.1079 6.9311 17.5901 11.6925 7.0876 3.756 6.2334 10.1271 17 2.8940 3.2141 7.0647 5.2732 3.0991 2.1635 3.2095 5.1804 18 0.1908 0.1838 0.4340 0.2562 0.3395 0.3683 0.4929 0.3922 5 3 讨论 雷公藤多苷片是从雷公藤根提取精制而成的脂溶性成分混合物,目前国内不同厂家生产的雷公藤多苷片因缺乏有效的质量控制方法，因而其化学成分及含量存在着一定的差异。如何在提高药效和降低毒副作用之间找到一种平衡, 并据此制定一个有效的质控标准, 对于雷公藤多苷片这一非甾体类免疫抑制剂的临床应用和药效评价都具有重要意义。 此次试验初步建立了雷公藤多苷片的HPLC指纹图谱，由试验结果可以看出: 不同样品的高效液相指纹图谱的主要峰的面积基本一致，提示不同厂家及批号的雷公藤多苷片的主要成分基本相同，但含量有所不同。利用雷公藤多苷片HPLC指纹图谱可以较好地反映雷公藤多苷片的内在质量，为今后雷公藤多苷片的质量控制提供了依据。 色谱指纹图谱实验条件应能满足指纹图谱的需要，不宜简单套用含量测定的实验条件，为获取足以代表雷公藤多苷片特征的指纹图谱。参考有关文献后，首先选择了等度洗脱为流动相，如乙腈-水(30:70)，乙腈-水(35:65)，乙腈-水(40:60) ，乙腈-水(60:40), 乙腈-0.1%磷酸(40:60)等等度洗脱，但分离效果不理想，各峰重叠率较高，内参物雷公藤内酯醇的色谱峰不能完全分离。当流动相中乙腈比例在30%,60%时，随着乙腈比例减少，指纹图谱中各色谱峰保留时间呈延长趋势。 雷公藤多苷片中含有较多的化学成分, 当流动相采用等度洗脱及采用不同比例的流动相时，则出峰时间拉长或色谱峰不能达到基线分离。采用梯度洗脱, 可兼得二者的优点，雷公藤内酯醇的保留时间和峰面积较稳定，与相邻其他色谱峰分离较好，且其它各色谱峰之间的分离效果也较好，且基线平稳，各峰峰形也较好。 采用不同的提取溶剂时，首先尝试了用氯仿进行分离提取，结果各色谱峰不能够较好的分离，内参物雷公藤内酯醇峰面积较小，且与其它色谱峰重叠，不能准确辨别出雷公藤内酯醇的色谱峰。当采用无水乙醇或蒸馏水作为提取溶剂时，色谱峰出峰的效果较氯仿佳。采用用乙酸乙酯来取代氯仿、无水乙醇或蒸馏水所制得的供试品，杂质较少，各色谱峰基本可以完全分离，且雷公藤内酯醇的相对峰面积较大，与相邻其它色谱峰分离较好。 采用不同的洗脱溶剂时，当使用氯仿作为提取溶剂，甲醇或甲醇-氯仿作为洗脱剂时，内参物雷公藤内酯醇的峰面积较大，但其它杂质峰面积变得更大，反而使得雷公藤内酯醇相对峰面积减小。相比之下当乙酸乙酯作为洗脱溶剂时，色谱指纹图谱的效果最为理想。 采用不同的洗脱柱时，其中中性氧化铝柱对内参物雷公藤内酯醇的吸附能力较硅胶小，所以过中性氧化铝柱的供试品的雷公藤内酯醇的峰较大，且杂质不与其重叠，使实验结果更加准确可靠。而MCI(聚苯乙烯型大孔吸附树脂)柱对雷公藤多苷片中各成分均有较强的吸附性，使得各色谱峰的峰面积明显变小，且大部分重叠，不能辨别出雷公藤内酯醇的相对 6 保留时间， 中成药的成分复杂，其活性也常常是多种成分共同组成的结果，中成药质量的全面控制难度很大。中成药的质量控制从显微鉴别发展到专属性成分的定性鉴别，到指标成分的含量测定。随着现代分析仪器和分析技术的发展，谢培山先生等提出以指纹图谱来全面控 [7]制中成药的质量。利用色谱指纹图谱可以较为全面地检测其多种成分在药物中分布的全貌, 使药物的内在质量情况可一目了然。 参考文献 [1] 毛庆秋,黄真. 雷公藤多苷的临床应用进展[J]. 时珍国医国药, 2005,16(5) :424-425. [2] 杨光忠,郭夫江,李援朝. 雷公藤多苷三萜类成分的研究[J]. 中国药学杂 志,2000,35(1):50-51. [3] 刘法千,鲍立曾,熊仕强. HPLC法测定雷公藤多苷中雷公藤内酯甲的含量[J]. 中国药 品标准,2007,8(4):38-40 [4] 庄莹，宋敏 ，杭太俊，等.雷公藤多苷片中雷公藤总内酯及雷公藤内酯醇的测定[J]. 药物分析杂志，2008，28(1):36-40 [5] 鲍立曾,刘法千,熊仕强. HPLC法测定雷公藤多苷中雷公藤内酯醇的含量[J]. 药物分 析杂志,2007,27(6):896-898. [6] 谢培山. 色谱指纹图谱分析是中草药质量控制的可行策略[J]. 中药新药与临床药理, 2001,12(3):141-143 [7] 谢培山. 中药质量控制模式的发展趋势[J].中药新药与临床理,2001,12(3):188-191 7 8