受损背根节神经元持续性钠流的检测.doc

受损背根节神经元持续性钠流的检测.doc 受损背根节神经元持续性钠流的检测 作者:刘志洋，王玉英，王文挺, 胡三觉 【关键词】 持续性钠流 【Abstract】 AIM: To detect persistent sodium current and to study its relationship with subthreshold membrane potential oscillation in injured DRG neurons. METHODS: Wholecell patchclamp experiments were performed with medium and small DRG neurons freshly isolated from rats. RESULTS: In the voltageclamp, DRG neurons with depolarizated membrane potential from -80 mV to -30 mV in ramp, produced a persistent sodium current for 150200 ms. The current with amplitude of 89200 pA was sensitive to 100 nmol/L TTX. In the currentclamp, when 100 nmol/L TTX was added to the cells with subthreshold membranepotential oscillation (SMPO), the oscillation disappeared. CONCLUSION: The INap detected in the injured DRG neurons may be in some way responsible for the production of SMPO. 【Keywords】 ganglia, spinal; patchclamp techniques; persistent sodium current; subthreshold membrane potential oscillation 【摘要】 目的: 检测损伤大鼠背根节(DRG)神经元持续性钠流 (persistent sodium current， INap)并研究其与阈下膜电位振荡的关 系. : 术后3,6 d慢性痛大鼠模型背根节急性分离，消化离散 成单细胞，对中小型DRG神经元运用全细胞膜片钳技术. 结 果: 电压钳下，钳制电位在-80 mV，给予斜波去极化到-30 mV 时，细胞产生一持续时间150,200 ms,幅值89,200 pA的持续性内 向钠流，且对100 nmol/L TTX敏感.电流钳下，产生阈下膜电位振荡 的细胞，给予100 nmol/L TTX后，振荡消失. 结论: 在受损DRG 神经元上检测到的持续性钠流可能是产生阈下膜电位振荡的基础之 一. 【关键词】 神经节，脊;膜片钳术;持续性钠流;阈下膜 电位振荡 0引言 外周感觉神经损伤以后，常伴随产生异 常感觉，包括痛觉过敏现象.这些异常感觉主要由外周感觉神经的异 位自发放电引起,1,.背根节(dorsal root ganglia, DRG)作为外周 感觉信号传向中枢的第一站，担当异位自发放电“起搏点”的作用.异 位自发放电的基础是阈下膜电位振荡(subthreshold membrane potential oscillation, SMPO),2,.但这种振荡的离子基础还没有明 确的说法.通过本实验的研究，在受损DRG神经元上，检测INap及 其与SMPO产生的关系，有助于揭示异位自发放电产生的离子通道 机制，为深入了解慢性痛信号产生的机制奠定基础. 1材料和方 法 1.1材料 SD大鼠10 只，体质量 120,150 g，雌雄不 拘，由第四军医大学实验动物中心提供.胰蛋白酶(?型)，胶原酶 (? 型)，MgATP，CsF 购自Sigma 公司，其他试剂为国产. Axon 200A 放大器(美国Axon 公司). 1.2方法急性分离背根 节细胞后，进行全细胞膜片钳记录.实验在30个DRG细胞上记录，其中25个中细胞和5个小细胞.中细胞静息膜电位为(-51.3?4.1) mV, 小细胞为(-48.5?3.4) mV. 1.2.1DRG细胞的制备SD大鼠在戊巴比妥钠(40 mg/kg, ip)麻醉下，制备DRG慢性压迫模型，其制备方法参见文献,3,.术后3,6 d，取制备好的动物模型，再用戊巴比妥钠麻醉，迅速取出L4L5背根节，置于氧饱和的M1640液中，镜下仔细剪除多余的神经纤维后，再剪碎神经节置于含酶的M1640液2 mL中(胰蛋白酶0.375 g/L，胶原酶1.125 g/L)，37?水浴消化30 min后，加入胰酶抑制剂终止消化.置细胞于一次性培养皿中，用细胞外液灌流(1.5 mL/min)，其配方如下(mmol/L): NaCl 150， KCl 5， MgCl2 1， CaCl2 5， Glucose 10， Hepes 10.细胞贴壁1 h后进行电生理记录.依据细胞体积，DRG细胞可分为大(直径>40 μm)、中(直径40,30 μm)、小型(直径<30 μm)分别对应于Aα, Aβ, Aδ及C纤维细胞,4-6,.本文检测的DRG细胞主要为中小型. 1.2.2电压钳记录采用全细胞膜片钳方式记录.细胞电位钳制在-80 mV, 给以斜波去极化至-30 mV.电极电阻为2,4 MΩ,封接阻抗达到1 GΩ以上.实验在室温下进行.电极内液配方(mmol/L): CsF 140， EGTA 1， NaCl 10， Hepes 10，细胞外液配方(mmol/L): NaCl 140， KCl 3， MgCl2 1， CaCl2 1， Hepes 10. 1.2.3电流钳制电压钳模式下启动，先用电压钳模式完成高阻封接，后转向电流钳模式进行记录，记录内外液换成正常液体，电极内液(mmol/L): K gluconate 140， MgCl2 2， EGTA 1.1, Hepes 10， MgATP 2，用KOH调pH值为7.2左右.细胞外液配方(mmol/L): NaCl 150， KCl 5， MgCl2 1, CaCl2 5， glucose 10， 10 Hepes，用NaOH调pH值为7.4左右.以上实验，封接电阻低于1 GΩ的细胞或静息电位低于-40 mV，记录中电位衰减明显的细胞放弃.在此过程中，始终保持漏流在100 pA以内. 统计学处理 : 采用pCLamp 6.0, Origin 6.0进行刺激和记录及数据获取和.数据均用x?sx . 2结果 2.1持续性钠流的引导成功封接的30个DRG细胞，给予斜波(-80 mV至-30 mV，时间3 s)刺激，当去极化到-30 mV时，显示一内向持续电流.根据细胞大小不同，电流也有所不同.较大细胞有较大电流.幅值平均在(150?40) pA. 引出的持续内向电流的时间跨度差别不是很大，中等细胞的持续时间为(180?20) ms，小细胞的持续时间为(165?15) ms，平均电流持续时间为150,200 ms之间(Fig 1). 2.2对TTX的敏感性测出的持续性电流，在加入100 nmol/L的TTX 2 min以后，电流幅值逐步减小，至10 min后基本消失.当洗脱TTX 10 min以后，持续性电流逐渐恢复其原来大小,说明这种电流对TTX比较敏感(Fig 2). 2.3持续性电流与SMPO的关系在电流钳记录模式下，给予细胞斜波(强度200 pA,时间1500 ms)刺激，引出SMPO,频率为(35?5) Hz，振幅为(12?5) mV,.当加入100 nmol/L TTX 5 min 以后，振荡减小至消失，洗脱TTX 8 min以后，振荡恢复(Fig 3).说明该持续性电流可能介导SMPO的产生. 3讨论 我们在损伤DRG神经元上记录到的这种持续内向电流，一是电压依赖性的，给予斜波刺激，去极化至-70 mV可激活引出，在-55 mV时达到最大值，比动作电位快钠通道的激活电位低10,20 mV.此种慢去极化电流可使介导动作电位的快钠通道失活. 二是记录到电流幅值较小，在89,200 pA范围内，远远低于快钠电流，且对1×10-9 mol/L TTX敏感.三是这种内向电流的持续时间较长，在150,200 ms之间.这些特征与其他神经元上报道的持续钠流结果一致,7,.说明我们记录的是持续性钠流.产生病理性神经痛的关键之一是作为“起搏点”的DRG神经元兴奋性异常增高，产生持久的异位自发放电，而这种自发放电的基础已经证明是SMPO,2,.但产生这种振荡的离子通道机制还没有定论.有文献报道是TTX敏感钠通道的作用,8,，因为该振荡在胞外钠离子被替代或施与利多卡因/TTX时消除.另外由持续性钠流介导的振荡在皮层神经元上也有报道,9,. 从我们的实验结果来看，这种内向电流对微量TTX敏感，且阻断后不影响动作电位的产生，另外该种电流激活电压水平较低，且激活时间较长，幅值较小, 不被钙通道阻断剂CdCl2阻断. SMPO在给予微量TTX后被消除.说明这是一种不同于快钠通道的持续慢钠通道介导SMPO的结果.由此，我们认为，慢性神经痛的产生可能和这种持续性钠流的存在有关，它在较低的电位处激活，介导产生SMPO，当振荡总和叠加达到动作电位的阈值时，爆发动作电位，引起DRG持续自发放电. 【