利用三孢布拉氏霉菌生产-胡萝卜素的制备研究

利用三孢布拉氏霉菌生产-胡萝卜素的制备研究 β- β-胡萝卜素，特别是天然β-胡萝卜素具有明显的抗衰老、防癌抗癌等功效， 在医药、保健品及营养食品方面有着很大的应用市场。目前，全球β-胡萝卜素的生产量约为600t/a，年需求量为1200~1500t，且每年以7%~9%的速度增长。。2000年中国β-胡萝卜素的生产量为10t，其中40%用于出口。2001年我国β-胡萝卜素的生产能力为22t，生产企业有4家，其中发酵法生产占73%。国内β-胡萝卜素总消费量的70%用于食品工业，其次用于保健品和医药行业。天然β-胡萝卜素将以其特有的生 理功能成为未来β-胡萝卜素市场的主导产品。本文介绍了利用微生物发酵生产β-胡萝卜素。 ：β-胡萝卜素、发酵法、制备、合成 ABSTRACT ：β-Carotene,especially natural β-carotene possesses notable activities,such as anti-ageing,anti-cancer and so on.It was widely used in medicine,health protective and nutrient food.At present,the worldβ-Carotene output is about 600t/a,market demand is 1200~1500 tons,which is increasing by 7%~9% annually.In 2000,domesticβ-Carotene output was 10 tons,40% of which wah for exports.There were 4 β-Carotene producers with a total capacity of 22 tons at home in 2001,73% of the products was manufactureed by fermentation method.The consumption by food industry made up 70% of the total consumption of β-carotene,followed by health care products and pharmaceutical industry.Natural β-carotene will be the dominant products in market for its special physiological actions. Key words: β-carotene,fermentation,production,compounding 1 β-胡萝卜素是一种棕红色有光泽的斜方六面结晶，不溶于水，易溶于二硫化碳、 氯仿、己烷、植物油等有机溶剂。分子式为CH，其化学结构为两边反向对称，分4056 [1]子结构中包含有两个β-紫罗兰酮和四个异戊二烯[CH=C(CH)-CH=CH]。当β-胡232 ‘萝卜素于15、15双键处断裂后可分解为两分子的维生素A，因而在人体摄入后可作为维生素A源补充人体的维生素A。 胡萝卜素异构体有α-、β-、γ-胡萝卜素3种，其中β-异构体含量在80%以上。β-异构体还含有全反式、9-顺式和15-顺式3种。天然胡萝卜素为全反式和顺式的混 合构型，而化学合成的β-胡萝卜素为全反式构型。这种单一的结构使得产品的生物 利用率较低，其在人体内的吸收率仅为天然产品的10%。 β-胡萝卜素作为一种食品添加剂、营养补充剂和医药制剂，是一种与人体健康 密切相关的、具有很高使用价值的药用有效成分，除作为维生素A源外，由于其自身具有的清除自由基和抗氧化的生理作用，可广泛用于抗衰老和预防老年性疾病，特 别是防癌作用。根据流行病学研究，β-胡萝卜素具有抗辐射和抗某些化学物质致癌 的作用，增强放疗、化疗对肿瘤的疗效，并减低它们对机体的毒副作用。大量资料表 明，人的血浆中β-胡萝卜素含量过低，与肺癌发生率高密切相关，与乳腺癌、胃癌、 膀胱癌、宫颈癌等的发生率呈负相关，同时还会引起眼疾，轻度者发生夜盲症，重度 者造成角膜溃疡、晶体脱落以至失明 ，[23]。所以研究开发β-胡萝卜素，特别是天然β [4]-胡萝卜素，促进其应用发展对人类健康保健具有十分重要的意义。 目前全世界β-胡萝卜素的生产量约为600t/a，,且每年以7%~9%的速度增长，美 国的需求量近些年以10%~15%的速率递增，且在欧美和日本等国都已形成市场。据 报道，全世界β-胡萝卜素的年需求量为1200~1500t。2000年中国β-胡萝卜素的生产 量为10t，其中40%用于出口。2001年我国β-胡萝卜素的生产能力为22t，生产企业 有4家，其中发酵法生产占73%。国内β-胡萝卜素总消费量的70%用于食品工业， 其次用于保健品和医药行业[5]。β-胡萝卜素作为食品添加剂和营养增补剂已被联合国 粮农组织和世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会推荐，被认为A类优秀营养色素，并在世界52个国家和地区获准应用。所以，β-胡萝卜素越来越引起人们的关注 和兴趣。 但是就目前而言，人们对β-胡萝卜素的提取技术处于探索优化之中。目前，用 于得到β-胡萝卜素的方法有天然物萃取法、化学合成法及微生物发酵法等。 1.1 从天然植物原料或者植物原料经加工处理后的下脚料中，采用有机溶剂（如石油 醚、氯仿、丙酮、乙醚、乙等）萃取β-胡萝卜素的一种方法。 自然界含有丰富的生物资源，每年能生产总量达百万吨的β-胡萝卜素[6]，但是它 [7]们在生物体内的含量并不高，一般仅占干重的0.2%左右。 1 目前，从天然植物中提取β-胡萝卜素的技术主要有有机溶剂提取技术。常用有 机溶剂为甲醇、无水乙醇、无水乙醚、石油醚、丙酮及石油醚—丙酮。但大量的有机 溶剂的使用会带来不同程度的污染，且不易回收。 据报道，在萃取过程中，压力越高收率越高，压力较小时，提高压力对提高收率 影响很大，压力较大时，提高压力收率增加有限；温度越高收率越高，因此采用超临 界二氧化碳萃取β-胡萝卜素时，适宜的操作条件为：压力30~35KPa,温度20~40ºC，CO[8]的流量为20~25Kg/g。但利用该设备生产胡萝卜素，成本高，对于大规模工业2 化生产不太适宜。 化学合成法是指采用有机化工原料，通过化学合成反应，人工合成β-胡萝卜素的一种方法。 根据近年来的研究报道，在合成品中的β-胡萝卜素全为全反式构型，而天然β-胡萝卜素除有全反式构型外，还含有程度不同的9-顺式和15-顺式构型，其中9-顺式β-胡萝卜素在胡萝卜素的遗传毒性和抗遗传毒性中起着关键作用。研究表明，不含 9-顺式β-胡萝卜素的合成胡萝卜素，和天然β-胡萝卜素相比有弱的多的抗遗传毒性， 高剂量时自身还有明显的毒性。而含9-顺式β-胡萝卜素的天然β-胡萝卜素，即使在高剂量区也无明显遗传毒性。由此可见，天然β-胡萝卜素较之化学合成的β-胡萝卜素具有更好的抗癌功效且无毒副作用。因此，大力发展天然β-胡萝卜素以代替化学 合成的β-胡萝卜素产品，对促进人类健康有重要意义，也有着更广泛的应用市场。 采用化学方法合成的β-胡萝卜素由于不能完全被人体吸收，并对人体产生一定 的程度的毒副作用，长期服用还会对人体产生不可逆的病变，因此不被大多数食品学 家认同，在西方发达国家已被禁止用作食品添加剂等方面，天然提取的β-胡萝卜素易于被人体吸收，并具有良好的抗氧化能力，从而形成了较高的需求热潮 [9]。 1.3 生物合成法是指利用微生物培养技术，通过微生物的培养，利用微生物在其体 内合成β-胡萝卜素，然后自微生物体内分离得到β-胡萝卜素的一种方法。 1.3.1β-[10] 以4%的淀粉为碳源，以玉米浆与棉仁籽或黄豆粕粉混合物为主要氮源组成培养 基，通过发酵三孢布拉氏霉以生产天然β-胡萝卜素，研究表明，在30L发酵罐中发酵，平均生物量为每升发酵液31.3g干菌重，平均总色素量为1213.1mg，每克干菌粉平均含色素32.2mg；3m?罐中放大试验表明，平均生物量为每升发酵液38.0g干菌重，在3m?罐中总色素平均含量为1146.5mg/L，发酵液含干菌重32.0~45.0g/L。发酵液采用离心或压滤方法固液分离后，以有机溶剂浸取菌体内的色素，色素提取率在90%以上。提取得到的色素样品经HPLC，在总色素中天然β-胡萝卜素占92%~96%，其它类胡萝卜素的占4%~6%，在β-胡萝卜素中，反式异构体占90%~95%，9-、13-、 2 15-顺式异构体占5%~10%，同时，样品经安全和卫生测试，各项指标均符合国 家。 [11]1.3.2β- 以4%玉米浆和2%的甘蔗汁为培养基，在28ºC培养48h后红酵母生物量和β- 胡萝卜素产量分别可达15.3g/L和1126μg/L，在培养60h后，再转入蒸馏水中培养84h， 产色素良则可提高到1475μg/L。若以4%甘蔗、0.4%(NH)SO和2%玉米浆为培养基，424 在PH=0的条件下培养红酵母，则生物量可达27.7g/L，色素含量为每升干菌重375μg。 利用红酵母制取β-胡萝卜素，由于β-胡萝卜素为胞内产物，所以红酵母的细胞破壁 技术是制取色素的关键，通常是用有机溶剂如丙酮、乙烷或食用植物油进行萃取，然 后提纯，浓缩即可得到不同含量的油溶性或结晶产品。 1.4.1β-[12] 在杜氏盐藻中的β-胡萝卜素含量最高可达干细胞重量的13%，因而是提取天然β-胡萝卜素的理想原料。杜氏盐藻是一类生活在富含NaCl的水中，如海洋、盐湖、盐池、盐碱等中的单细胞低等真核生物，β-胡萝卜素作为盐藻光合作用的产物，受 生长环境的盐度、温度、光照条件及磷源的影响，根据这些条件对盐藻生长和β-胡萝卜素合成的影响，采用二步法培养杜氏盐藻，即先在盐藻有利的条件下培养，此时 藻体生长繁殖快，待藻体生长成熟，再收集藻体转入不利于藻体生长但有利于合成积 累β-胡萝卜素的强光、高盐、低氮、高温条件下培养，这样既可使藻体合成积累高 含量的β-胡萝卜素，又可以缩短培养周期而得高产量，这样培养得到的盐藻，可使 细胞积累干重达10%以上的β-胡萝卜素。然后通过溶剂萃取等方法即可从这类盐藻 中提取得到天然β-胡萝卜素。 1.4.2β- [13] 在10g新鲜的钝顶螺旋藻（干重0.5g，β-胡萝卜素含量为干重的0.9%）中，加入30ml有机溶剂，在室温下振荡浸提3次，抽提液在60ºC左右减压抽干，除去有机溶剂，然后加入适量乙醚溶解残留物，再加入等量的10%NaOH-甲醇溶液，室温下放置1~2h后，加入5%NaCl水溶液萃取，取上层乙醚层，如此反复抽提两次，合并乙 醚液，再加入5%NaCl水溶液洗涤3次后，在乙醚中加入少量无水硫酸钠，暗处过夜， 过滤除去硫酸纳，40ºC下除去乙醚即可得到天然β-胡萝卜素纯品，天然β-胡萝卜素的提取率为75%。 1.5β-[9] 酶法提取β-胡萝卜素目前的研究主要是提高果汁饮料中β-胡萝卜素的含量。研究表明果胶酶和纤维素酶处理胡萝卜泥可以提高出汁率，胡萝卜素提出率可增加两倍 多，浑浊增加，稳定性提高，胡萝卜汁的颜色变深。传统的榨汁工艺不仅出汁率低， 而且只有20%的胡萝卜素进入汁液。酶法液化工艺生产胡萝卜素原汁工艺简单，无须 增加设备。但酶用量必须适宜若量大会带来异味。 3 近年来，有报道利用微生物生产微生物油脂，再从微生物油脂中提取β-胡萝卜素的方法。此法油脂含量高、微生物细胞增殖快、适应性强、生产周期短，同时，微 生物生长所需的原料丰富、价格便宜，如淀粉、糖类，特别是食品工业和造纸工业的 废弃物都可以加以利用，从而保护了环境。采用微生物方法进行生产，节省劳力，不 受季节和气候变化的限制，生产成本低，能连续大规模的工业生产。因此，利用微生 物制取纯天然的β-胡萝卜素技术是向工业化生产迈出可喜的一步[14]。 为了更好的研究β-胡萝卜素，进一步降低它的生产成本，本文采用微生物发酵 发法制备β-胡萝卜素，而利用三孢布拉氏霉菌发酵合成β-胡萝卜素是获得其产品的 一种重要途径。为此我们在实验室摇瓶中研究了培养基、添加剂、培养条件对三孢布 拉氏霉菌发酵合成β-胡萝卜素的影响。 2.1 2.1.1 三孢布拉氏霉菌雌、雄性菌株（称“-、+”株）来源于ATCC，14059，14060，本项研究中编为JM9203（正株）、JM9204（负株）。 2.1.2 2.1.2.1 PDA.斜面培养基：新鲜去皮马铃薯300g；葡萄糖20g；琼脂20g；自来水 1000ml；PH自然。分装试管后，0.1MPa灭菌20min，斜面表面水干后使用。 2.1.2.2 液体种子培养基：淀粉4%；葡萄糖2%；酪蛋白水解物0.2%；玉米浆0.5%； KH PO0.1%；MgSO0.01%；VB1mg/100ml；消前PH=6.7，装量为40ml/250ml2441 三角瓶，0.1MPa灭菌20min。 2.1.2.3 摇瓶发酵培养基：淀粉4%；黄豆饼粉4%；玉米浆3%；盐酸硫胺素10mg/L； KHPO0.1%；MgSO0.01%；灭菌前调PH=7.7，装量为50ml/500ml三角瓶，244 0.1MPa灭菌40min。 补料：在发酵48h左右添加0.1%β-紫罗兰酮及适量无菌水。 无菌操作台，灭菌锅，电子天平，恒温箱，水浴锅。 . 培养菌种?挑菌?划线?放平板?恒温培养?选取单菌落?接种至斜面上 操作要点： 配置每1000ml培养基，要在950ml去离子水（ddH O）中加2 4 入：胰蛋白胨10g?酵母提取物5g?NaCl 10g。摇动溶液直至溶解，用 5mol/L(约0.2mL)调PH至7.0，用去离子水定容至1L。 LB培养基倒入试管，倾斜放置，使其凝固后产生斜面 LB培养基加入5%卵黄悬液，即为卵黄培养基。倒平板是 在高压灭菌前加入细菌培养用的琼脂（Bacto-Agar）或琼脂糖15g/L,在 1.5MPa(1.05Kg/cm2。)高压下蒸汽灭菌20min。将培养基加热到45C左右倒平 板，水平静置待凝。 使用接种环，从待纯化的菌落或待分离的斜面菌种中沾取少量菌样， 在相应培养基平板中划线分离，划线的方法多样，目的是获得单个菌落。 。。 将皿倒置于37C或28C恒温箱中培养，24h后观察分离效果。若分 离效果好，会在第四区出现单菌落。 把第四区内出现的典型单菌落用记号笔在皿底作上标记。 将作有标记的单菌落移接至适当的斜面培养基上，经培养后 即为纯种微生物。 在种子培养基或摇瓶发酵培养基中改变碳、氮用量比（见表1，2）。装量为40ml/250ml三角瓶，每组设三个重复，0.1MPa灭菌40min。“+、-”菌株按5：5的比例总量10%接种，于28ºC、200r/min振荡培养。培养48h，无菌操作补加0.1%β-紫罗兰酮。培养至120h终止。 2.3.3 在单因素试验后，确定了培养基中的四种因素及三个水平按L 排列组合（见表93）。装量为50ml/500ml三角瓶，三个重复。 2.3.4 β- 离心收集发酵液中的菌丝体，50~55ºC真空干燥、研磨。有机溶剂提取菌体中的 色素采用普通硅胶G薄板层分离[15]，用紫外分光光度计测定最高吸收峰的吸光值， [16]参照方法测定并计算β-胡萝卜素的含量。 2.3.5 除种子培养基碳源试验外，菌种不同性别发酵试验以及种龄试验均按常规方法进 行。 2.3.6 准确量取发酵液，用双层纱布过滤，自来水反复冲洗、拧干、撕成碎片置于平面 皿内，50~55ºC抽真空干燥，用1/100g精确度天平称量。 5 .1 3.1.1 β- 表1 碳源对β-胡萝卜素生产水平的影响 试碳源及配比 生物量干类胡萝卜β-胡萝卜素 验菌体g/L 素mg/L mg/L 占% mg/g干号 菌体 1 葡萄糖5% 36.8 728 618.0 85.0 16.8 2 淀粉4% 43.0 1113 956.9 86.8 22.5 3 淀粉3%+葡萄糖1% 42.0 917 860.0 90.0 20.5 4 淀粉2%+葡萄糖2% 36.8 864 741.2 85.0 20.1 5 淀粉4%+葡萄糖1% 42.8 106 930.6 77.2 21.8 6 淀粉4%+葡萄糖4% 39.8 1206 509.0 84 12.8 试验结果表明，以4%为碳源较为适宜，生物量和β-胡萝卜素的生产水平都较高。 虽然在4%淀粉的基础上再添加1%葡萄糖总色素水平有所提高，但是β-胡萝卜素未增加，因而无实际意义。 3.1.2 β- 由于试验所采用的氮源均为农副产品，其营养成分与含量差异较大，因而不同的 氮源对β-胡萝卜素合成水平有很大影响，结果见表2。 表2不同氮源的农副产品对三孢菌β-胡萝卜素合成水平的影响 试碳源及配比 生物量干类胡萝卜β-胡萝卜素 验菌体g/L 素mg/L mg/L 占% 萝卜素号 mg/g干 菌体 1 玉米浆3% 45 276.7 226.0 81.7 5.02 2 黄豆饼粉4% 339 429.0 390.0 91.0 1.15 3 黄豆饼粉4% 45 732.0 620.0 85.0 13.8 玉米浆3% 6 4 黄豆饼粉4% 36 516.7 413.4 80.0 11.5 酒糟水2% 5 棉籽仁4% 648 525.8 494.1 94.0 0.76 6 棉籽仁4% 60 1006.0 803.5 80.0 13.4 玉米浆3% 8 豆饼水解液4% 33 33.2 20.4 61.4 0.6 表2中的结果表明，以棉籽仁和黄豆饼粉为主要氮源所组成培养基较为适宜， 而玉米浆与棉籽仁或黄豆饼粉混合使用更有利于提高生物量和β-胡萝卜素的产生水平。 3.1.3 在碳、氮物质因素试验后，我们拟定淀粉、黄豆饼粉、玉米浆以及植物油为影响 三孢布拉氏霉菌合成β-胡萝卜素水平的主要因素设计正交实验，其结果于表3。 表3 三孢菌在培养基正交试验中胡萝卜素的生产水平 试验组合 淀粉 黄豆饼玉米浆 植物油 生物量干胡萝卜素 % 粉% % % 菌体g/L mg/L 1 2 6 3 4 54.4 681.7 2 2 4 3 3 45.1 568.0 3 2 5 3 5 69.2 1008.4 4 3 5 3 3 44.1 547.7 5 3 6 3 5 54.5 764.8 6 3 4 3 4 51.3 668.7 7 4 4 3 5 45.9 566.8 8 4 5 3 4 49.1 654.1 9 4 6 3 3 35.1 544.7 7 K 2258.1 1893.5 1627.2 1 K1981.2 2210.1 2004.5 2 K1732.3 1958.0 2339.8 3 R极差 525.7 316.6 712.6 正交试验表明，培养基组合3无论其生物量，还是胡萝卜素水平均高于其它组合， 可能是因其碳、氮以及植物油配较佳所致。R-极差分析表明，影响胡萝卜素合成水平 的主要因素依次为植物油、淀粉，影响影响较小的应为黄豆饼粉。 3.2 3.2.1 ：三孢布拉氏霉菌有雄性（+）和雌性（-）菌株，在相同条件下， 单独发酵“+”和“-”株，其类胡萝卜素合成水平分别为36.6mg和263.7mg/L 发酵液，而当“+” “-”菌株混合发酵时，其胡萝卜素合成水平达1113mg/L 发酵液，这是因“+”和“-”株混合培养有利于产生促进胡萝卜素的三孢酸所 起的作用。 3.2.2 ：分别采用培养24、32、40、44和48h的液体菌种发酵试验结果表明， 培养32~48h的菌种均可用于发酵，但培养40~44h的菌种更有利于胡萝卜素的 合成。 3.2.3 表4 种子培养基中碳源对β-胡萝卜素合成水平的影响 试验号 碳源及用量比 生物量 类胡萝卜素 β-胡萝卜素 干菌体mg/L mg/L 占% g/L 1 5%葡萄糖 60.0 170 117.7 69.2 2 2%葡萄糖+4%淀粉 43.1 1113 965.9 86.88 3 3%葡萄糖+3%淀粉 46.3 948 740.0 78.0 4 3%葡萄糖+2%淀粉 47.3 1429 1286.1 90.0 5 5%淀粉 49.3 1046 963.5 92.0 试验表明，在相同的条件下，以4号种子培养基胡萝卜素产量最高。而单用葡萄 糖为种子培养基的碳源培养基质粘性差，不利于菌体伸张，易形成较大的团块，这样 8 可能造成种子菌体被接入发酵培养基后营养物质的利用不良。 本研究在实验室条件下，以三孢布拉氏霉菌编为JM9203（正株）、JM9204（负株）为原料，通过对三孢布拉氏霉菌合成β-胡萝卜素、菌种培养基和发酵培养基摇 瓶发酵比较实验，以生物量（每升发酵液中菌丝体干重）、类胡萝卜素和β-胡萝卜素合成水平为结果标准，筛选出适用于发酵三孢布拉氏霉菌培养基的碳、氮源物质和配 比。为深入研究三孢布拉氏霉菌的发酵与β-胡萝卜素产品研制奠定了基础[16]。 主要结论如下： 1 由碳源对β-胡萝卜素产生水平的影响的结果表明，以4%为碳源较为适宜。 2 以棉籽仁和黄豆饼粉为主要氮源所组成的培养基较为适宜。 3. “+”和“-”株混合培养有利于产生促进胡萝卜素的三孢酸所起的作用。培养40~44h 的菌种有利于胡萝卜素的合成。 9 [1]施跃峰.天然β-胡萝卜素研究开发动态[J].食品研究与开发，2000，（2）：13~16。 [2]顾学裘，张永恒，吴玉波等. β-胡萝卜素具有防癌功效的机制[J].哈尔滨医科大学学报，1996，（4）：430~404。 [3]王庆伟.类胡萝卜素的研究进展与临床应用[J].中国药事，2000，（1）：58~60。 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