以汉坦病毒重组核衣壳蛋白为抗原进行ELISA血清分型的研究

以汉坦病毒重组核衣壳蛋白为抗原进行ELISA血清分型的研究 以汉坦病毒重组核衣壳蛋白为抗原进行 ELISA血清分型的研究 酗N1007—8738 ? 研究原着? CellM269 文章编号:1007.8738(2001)03.269-03 以汉坦病毒重组核衣壳蛋白为抗原进行EI,ISA血清分型的研究 刘京梅',李采根"',李新军,张伶,刘雪林',李森林,ElghF.3,4 (总后勤部防疫趴疾病监督雎测中心,北京,100039;北京军区联勤部防疫趴;'DeparmmmofMicrobiology.Divi8i眦ofNBC Defence,DofenceResearchEstablishmentumea,Sweden;'DepaMnmntofVimlogy,Ume3 tUrfversity【柏Sweden) 关键词:汉坦病毒;重组楮表亮蛋白;血清型;DOB;ELISAl0calevidenceofthethirdscrotgpeDOBWasdiscoveredinchjIl丑 中图分类号:R373.32文献标识码:A 摘要:目的以汉坦病毒重组棱衣壳蛋白(NP)为抗原,对陕 西,河北两省部分地区HFRS患者的血清进行ELlSA分 型.方法用5种汉坦病毒NP为抗原.建立一种间接 ELISA法,并检测上述地区患者血清中特异性I.结果 陕西,河北两省部分地区汉坦病毒的感染以血清型HTN为 主,其次为SEO型,并检测出2倒疑似DOB型感染的血 清.结论用汉坦病毒NP作抗原进行ELISA血清分型是可 行的,并首次发现我国存在BOB血清型的免疫学证据. Useofreco~nmleocapadproteinof hamaviras舔ara~mini~JSAforserotrr~ serafromItFRSpalieats LIUfing-mei~,L1Quan-gen''",LIXin-jun~,ZHANG Ling',LlUXue-ling~,LI&ElgbP' CemreofDi瑚?ControlandPrevention.DetxartmentofGen— end,PLA,Beijlng100039;CentreofDiseaseControl andPrevention,BeijingMilitaryDistrict;DepartmentofMicro- biology.DivisionofNBCDofeneeDefenceResem'ehEstablisIi- ment,Sweden;DepartmentofVirology,Ume/tUniversity.Sweden KmkhanLavims~recombinantnueleocapsidprotein; setotype;IX)B;ELISA ^】,醴嘣:AhTomakeELISAtypingofserafrom肼ISpatients fromDaldistrictsofHebeiandShaanxiProvincesusinghart- tavimsnucleoc~psidprotein(NPlnBanfi~emlV~fllodsAnindi— reelELISAw口establishedbyusing5kindsoftheNPallgenBand specificIinthepatient'吕erafromabovedistrietsw珏detected. Resul塘ThetypeofHa/ltaviru~,infeedonwa吕mainlysetotype HTN.see~adlyserotypeSEOandsimultaneouslyalsoddededtwo se1"8WhichweredoubtfullyinfectedwithserotypeDOBvirus. Conclusl~ItisfeasiblethattheNPantigenoflumtavirusisused forELISAtypmgof8mfromHFRSpatients.ThefastJ/llnltl/lO- 收稿日期:2001—02—06;修回日期:2001—03—05 基盒项目:军队医药卫生科研基金赍助.?9gM154 作者筒介:捌京棒(1969一),士,北京市凡,主管技师,士生 现为第四军医太学旱n流行病学教研室硕士研究生 '课题负责及联系凡,E-marl:liquangen@eudora~ail.一 北京市丰台蓐26号,Te1.(010】66933356(0) 汉坦病毒属布尼亚病毒科(Bunyaviridae),是引 起肾综合征出血热(hae~orrhagicfeverwithrenal syndrome,HFRS)和汉坦病毒肺综合征(hantavirus pulmonarysyndrome,HIS)的病原体.近年来不断发 现新的血清型和基因型,迄今已发现至少8个血清 型'.对该病毒属的序列分析显示有23个种',但 与人类疾病相关者仅有5个血清型:即汉滩 (Hantaan,8TN),汉城(Seoul,SEO),多布拉 (Dobrava,DOB),波马拉(Puumala,vuu)和辛诺 勃(SinNombre,SN).我国在血清型的检测和研 究方面也做了大量工作,至今已发现了两种血清 型HTN和SEO,仍有部分血清未能明确分型,因 此提出了所谓"中间型"和"混合型"等概念.国外, 采用RT.PCR检测汉坦病毒基因组,已被应用于汉 坦病毒的分型和诊断.但由于易被污染,目前国 内还不适于在基层实验室开展.现在常用的,简 便可靠的检测手段仍然是血清学试验,但缺少敏感 性和特异性均较满意的ELISA分型试剂盒.Elgh 等131发现,汉坦病毒的核衣壳蛋白(NP)的基因片 在间 段,在大肠杆菌中的表达产物可作为抗原,接ELISA中检测特异性IgG和IgM,对多数血清可 以定型.已研制出可鉴定5个血清型的重组抗 原.但是,缺点是分群容易,分型难.另外,重 组质粒的稳定性欠佳.因此,建立一种经济,简 便,可靠,易于推广的检测方法,对HFRS进行流 行病学研究和疾病监控,已显得非常重要和迫 切.我们在El小工作的基础上,通过改进表达重 组抗原的设计,增强抗原的稳定性和特异性.建 立了一种具有推广应用价值的间接ELISA法,并 用此方法调查了陕西和河北两省部分疫区汉坦病 毒血清型的分布. 1材料和方法 1.1材料本中心所用Elgh等构建的重组NP质 粒,是在BL21一CodonPlus(DE3)菌株中表达后,提 堡望!:1塑照与王鱼矍学杂志fJceIiMo!lmmunoI)2001;17(3 纯的产物.血清标本为随机收集的陕西,河北两 省HFRS进行期患者的血清共150份.抗HFRSV 抗体阳性对照血清6份,阴性对照血清1份,由瑞 典UmeA大学提供.HRP标记的羊抗人IgG,羊抗 鼠G,均为Sigma公司的产品. 1.2方法由于El曲构建的质粒表达载体在大肠 杆菌BL21(DE3)株中的表达产物,产量不稳定且常 失败.故我们采用了BL21.CodonPlus(DE3)株作为 表达菌株,增加了识别精氨酸,亮氨酸和脯氨酸 的tRNA,克服了难题.HFRS患者血清特异性抗 体的检测,采用间接ELISA法.包被抗原为1:50 的HFRSVNP(80tzg/L),阻断剂为PBsT+40g/L 脱脂奶粉+30mg/L小牛血清+l0mL/LECA(自 制),第2抗体为1:4000的HRP-羊抗人I,用 TMB显色,于450i111,1测定光吸收(A)值.结果按 下列公式判定:(1)阳性结果的判定:?样品的A 值需i>0.2;?样品A一空白对照的A值/阴性对 照的A值一空白对照的A值?2.(2)DOB血清型 的判定标准:DOB型的A值/HTN或SEO型的A 值?1.5.采用LaserGenesoftwareprogramsEdit— Seq,MegAlign和Protean序列分析软件,对7个血 清型病毒的NP,进行了氨基酸序列分析研究.取 2份健康人和2份HFRS患者的血清,在同一块板 内,于不同时间重复3次测定其A值,计算批问 和批内的变异系数(CV). 2结果 2.1汉坦病毒NIP氨基酸序列的比较我们比较了 7个血清型的汉坦病毒NP的N端氨基酸序列,发 现它们既有高度的同源性,又具有血清型特异性 (表1).根据其同源性的高低,可将它们分成两 群:HTN/SEO/DOB(HTN群)和SN/PUU/PH/TUL (PUU群).前者各型之问的同源性为78.6%一 82.9%;后者为71.8%一84.6%.但两群之间 的同源性较低,仅为49,6%一57.3%.因为 PUU群中,只有PUu和sN与人的HFRS相关, 而PUU与SN之间的同源性并不很高(71.8%)o 因此.从理论上来讲,用我们建立的ELISA法来 分辨血清型是可靠的.从实验方法上来看,我们建 立的间接ELISA法的稳定性很好,批内的CV为 3.72.批间的CV为7.61. 2.2分型抗原与阳性血清的反应性以重组汉坦 应用间接ELISA法检测了 病毒NP为分型抗原, I50份HFRS患者的血清标本.其中有2份可与分 型抗原DOB起明显地特异性反应,提示我国可能 存在DOB血清型(表2).我国陕西,河北两省汉 坦病毒的感染以HTN为主(陕西为53%,河北为 35%),SEO次之,还有相当一部分血清(42%)未 能确切定型.其中17%,23%的血清能定为HTN 群(表3). 袁17种血清型重组嚣丧壳蛋白N端氯基蘸序,0的同性比鞋 Tab1TheHomologouscompariSOnofminoaddsequencere binanlnueleocapsidataminoterminalamong~mtypas ofhantavi~ses Homologousaminoacidsequencesimilarityf1,117】% Virusstrain'....'................---------------—..-----,—-———??'?'—---------------一 SE0VOOBVSNVPUUVPHVTULV HTNV{76-118) SEO~(SR一11) DOBV(3970/87】 SIWq(NMH10) PUUVf&舯D) 明V(Prospeettt) lrUlf53Ma/87) 573 564 573 77S 77.8 84.6 袁2与DO8型抗原有较高反应性的两债忘者血清(柚值J Tab2Reaetivifiesoflwosore(1l0andJ104)fromthepalientstothe serotypeDOBantlgc,nf^value】 Serotvpa而面 S82HTN1520.67021仉19019 L91SEO0.921.800.48028026 93—7818DoB0.84n81183028022 93—888PUU0.40n21019114024 93~114PUU55n49O.241060.54 Jl0'DOBn890811.6i0220.28 J104'OO8007i062.碍0.430.41 398514Control0120140.140.150.10 'I10和J104fromHeBeiProvinc~99.7813,39888,938414and 998514fromUmeAUneilSwedenS82fromShn~axiP~vinceand 191fromShandongProvinee. 表3睫西,河北两省患者的血清分型 Tab3Serotypingforthepatient'serafromShamaxiandHabaiProvinces Scn'AypeSem陀B0?eanddetectedsamplenumber Shaanxi(月=115)Habei=85 'Mul~Metype?Bmesmwhichmmac【totheflyeanligens fHTN,SEO,DOB,PUUandSN),buttheAvalue~hasnooBvious differencesamongthem—HTN口me曲slhewhichI t0HTN.SEOandD0Banfisens.butAvaesishigherthanm咖of lw0SNandPUU.Afar雎Avalueaarecen~medtheamn0obvi一 .usdn嘶mon曼'sEDoB1 (下转第299页) 67889跬扭弧 606诋跬 眨 驼