为了正常的体验网站,请在浏览器设置里面开启Javascript功能!
首页 > 纤维蛋白胶角膜细胞片及其对结膜上皮黏合作用的研究

纤维蛋白胶角膜细胞片及其对结膜上皮黏合作用的研究

2017-12-19 30页 doc 60KB 34阅读

用户头像

is_215732

暂无简介

举报
纤维蛋白胶角膜细胞片及其对结膜上皮黏合作用的研究纤维蛋白胶角膜细胞片及其对结膜上皮黏合作用的研究 纤维蛋白胶角膜细胞片及其对结膜上皮黏合作用的研 究 纤 维 蛋 白 胶 角 膜 细 胞 片 及 其 对 结 膜 上 皮 黏 合 作 用 的 研 究 中 文 摘 要 摘 摘 摘 摘 要 要 要 要 目 目 目 目 的 的 的 的 : : : : (1 ) 研 究 兔 角 膜 上 皮 、 基 质 及 内 皮 细 胞 体 外 培 养 的 生 物 学 特 性 , 探 索 和 改 进 这 3 种 细 胞 体 外 培 养 的 方 法 , 为 组 织 工 程 角 膜 的 构 建 奠...
纤维蛋白胶角膜细胞片及其对结膜上皮黏合作用的研究
纤维蛋白胶角膜细胞片及其对结膜上皮黏合作用的研究 纤维蛋白胶角膜细胞片及其对结膜上皮黏合作用的研 究 纤 维 蛋 白 胶 角 膜 细 胞 片 及 其 对 结 膜 上 皮 黏 合 作 用 的 研 究 中 文 摘 要 摘 摘 摘 摘 要 要 要 要 目 目 目 目 的 的 的 的 : : : : (1 ) 研 究 兔 角 膜 上 皮 、 基 质 及 内 皮 细 胞 体 外 培 养 的 生 物 学 特 性 , 探 索 和 改 进 这 3 种 细 胞 体 外 培 养 的 方 法 , 为 组 织 工 程 角 膜 的 构 建 奠 定 基 础 ; (2 ) 观 察 兔 角 膜 3 种 细 胞 在 体 外 构 建 的 纤 维 蛋 白 胶 薄 膜 表 面 的 生 长 状 态 , 探 讨 以 纤 维 蛋 白 胶 制 备 组 织 工 程 细 胞 片 的 可 行 性 ; (3 ) 研 究 纤 维 蛋 白 胶 对 结 膜 上 皮 的 黏 合 作 用 , 探 讨 纤 维 蛋 白 胶 行 无 缝 线 自 体 结 膜 瓣 移 植 治 疗 翼 状 胬 肉 的 可 行 性 。方 方 法 法 : : (1 ) 采 用 组 织 块 法 、 消 化 法 分 离 培 养 兔 角 膜 上 皮 、 基 质 和 内 皮 细 胞 , 观 察 细 胞 贴 壁 方 方 法 法 : : 生 长 情 况 , 同 时 对 生 长 良 好 的 原 代 细 胞 进 行 消 化 传 代 , 进 一 步 观 察 传 代 细 胞 的 形 态 和 生 长 情 况 ; (2 ) 将 培 养 扩 增 的 兔 角 膜 3 种 细 胞 分 别 接 种 于 纤 维 蛋 白 胶 薄 膜 表 面, 待 细 胞 生 长 融 合 后 , 利 用 细 胞 刮 铲 刮 取 角 膜 细 胞 片 , 采 用 倒 置 显 微 镜 ,HE 染 色 和 扫 描 电 子 显 微 镜 , 观 察 兔 角 膜 3 种 细 胞 在 纤 维 蛋 白 胶 表 面 生 长 情 况 ; (3 ) 结 膜 黏 合 手 术 选 用 20 只 雄 性 新 西 兰 白 兔 , 根 据 不 同 术 式 分 为 3 组 : 暴 露 组 ; 植 片 原 位 移 植 组 ; 仿 翼 状 胬 肉 术 式 组 。 观 察 术 后 结 膜 上 皮 组 织 黏 合 情 况 、 炎 症 反 应 、 上 皮 化 及 瘢 痕 形 成 情 况 。结 结 结 结 果 果 果 果 : : : : (1 ) 兔 角 膜 上 皮 、 基 质 和 内 皮 细 胞 均 在 培 养 24h-48h 内 贴 壁 生 长 , 在 培 养 6d-9d 能 形 成 良 好 单 层 , 细 胞 形 态 典 型 , 进 行 多 次 传 代 后 细 胞 仍 维 持 原 有 形 态 和 功 能 , 获 得 的 细 胞 能 进 行 长 期 培 养 ; (2 ) 制 备 的 纤 维 蛋 白 胶 薄 膜 光 滑 、 透 明 , 随 培 养 细 胞 的 生 长 部 分 降 解 , 可 获 得 仅 带 少 许 纤 维 蛋 白 胶 的 细 胞 片 。 角 膜 3 种 细 胞 在 纤 维 蛋 白 胶 表 面 生 长 良 好 , 可 保 持 生 理 状 态 的 细 胞 形 态 。 角 膜 上 皮 细 胞 可 形 成 单 层 和 复 层 , 细 胞 间 连 接 紧 密 。 角 膜 内 皮 细 胞 呈 圆 形 或 多 角 形 , 细 胞 大 小 一 致 , 排 列 紧 密 。 角 膜 基 质 细 胞 拉 长 生 长 , 呈 三 角 形 或 树 枝 状 , 细 胞 间 连 接 明 显 , 可 形 成 网 状 连 接 ; (3 ) 植 片 原 位 移 植 组 与 仿 翼 状 胬 肉 术 式 组 术 后 炎 症 反 应 较 轻 ,2w 内 均 实 现 完 全 上 皮 化 , 组 织 切 片 显 示 瘢 痕 组 织 形 成 较 少 。结 结 结 结 论 论 论 论 : : : : (1 ) 本 研 究 为 兔 角 膜 上 皮 、 基 质 及 内 皮 细 胞 体 外 培 养 , 提 供 了 方 便 高 效 的 方 法 , 并 对 比 了 各 种 不 同 方 法 分 离 培 养 兔 角 膜 3 种 细 胞 的 生 物 学 特 性 ; (2 ) 体 外 构 建 的 纤 维 蛋 白 胶 与 角 膜 3 种 细 胞 有 良 好 的 生 物 相 容 性, 利 用 纤 维 蛋 白 胶 包 被 培 养 皿 有 望 获 得 可 供 移 植 的 组 I 纤 维 蛋 白 胶 角 膜 细 胞 片 及 其 对 结 膜 上 皮 黏 合 作 用 的 研 究 中 文 摘 要 织 工 程 角 膜 细 胞 片 ; (3 ) 纤 维 蛋 白 胶 作 为 一 种 安 全 有 效 的 黏 合 剂 , 在 结 膜 瓣 移 植 中 应 用 可 有 效 缩 短 手 术 时 间 , 减 轻 术 后 炎 症 反 应 , 减 少 瘢 痕 组 织 形 成 。关 关 关 关 键 键 键 键 词 词 词 词 : : : : 角 膜 ; 纤 维 蛋 白 胶 ; 组 织 工 程 细 胞 片 ; 细 胞 培 养 ; 结 膜 ; 兔 II 纤 维 蛋 白 胶 角 膜 细 胞 片 及 其 对 结 膜 上 皮 黏 合 作 用 的 研 究 Abstract Abstract Objective: 1 To research the characteristics of corneal epithelial cells, keratocytes and endothelial cells of rabbit and lay a foundation for tissue engineering of cornea. 2 To study the status of three rabbit corneal cells growing on fibrin glue FG and investigate the feasibility of FG for cell sheet engineering. 3 To study the cohesion of FG on the conjunctival epithelium and investigate the practicability of sutureless conjunctival autograft transplantation for the treatment of pterygium with FG Methods: 1 Using tissue inoculation or digestion methods, rabbit corneal epithelial cells, keratocytes and endothelial cells were cultured. The cells were subcultured after they became confluent. The growing characteristics of cells were observed every day. 2 Three corneal cells were seeded on FG. After confluence, the corneal cell sheets were detached from the plate with a cell scraper, examined by inverted microscope, histologically by hematoxylin and eosin, and by scanning electron microscopy. 3 The cohesive surgery of ocular surface of 20 rabbits was carried, which were applied into three operating styles: exposed group, implanted group, pterygial group. The postoperative conglutinant effect, inflammatory reaction, reepithlialization and scar formation of conjunctival epithelium were observed Results: 1 The epithelial cells, keratocytes and endothelial cells adhered and grew within 24-48 hours and formed a confluent monolayer in 6-9 days. The shape of the primary isolated cells was typical, and the passage cells still maintained the characteristics of the primary cells. The cells grew very well and could be cultured for a long time. 2 The prepared membranes of FG were smooth and transparent. With cell growth, FG could degrade partly, and obtain cell sheet engineering with a small amount of FG. Corneal cells could grow well on the FG in vitro and maintain the physiological state of cells. Corneal epithelial cells formed unilaminar or stratified layers with cellular joins. Corneal endothelial cells with almost same size formed round or polygon and lined up tightly. Corneal keratocytes formed triangle and arborization, cell-cell junctions were obvious, and formed network link. 3 Inflammatory reaction of implanted group and pterygial group were relatively slight three days after operation. In two weeks, they were covered with epithelial layer completely, histological section showed that the reconstruction ofIII 纤 维 蛋 白 胶 角 膜 细 胞 片 及 其 对 结 膜 上 皮 黏 合 作 用 的 研 究 Abstract the damaged conjunctival tissue with less scar formation Conclusions: 1 The research established a simple, highly efficient method for culture of rabbit corneal epithelial cells, keratocytes and endothelial cells in vitro. 2 FG is well compatible with three corneal cells, which can construct tissue engineered cell sheet of cornea, so as to reconstruct ocular surface. 3 FG is a safe and effective cohesive for the conjunctival grafts. The use of FG results in shorter operating times, less postoperative inflammatory reaction and scar formation Key words: cornea; fibrin glue; cell sheet engineering; cell culture; conjunctiva; rabbitIV 纤维蛋白胶角膜细胞片及其对结膜上皮黏合作用的研 究 目 录 目 目 目 目 录 录 录 录 中文摘 要…………………………………………………………………………………… ? Abstract…………………………………………………………………………………… ? 目 录…………………………………………………………………………………… ? 前 言…………………………………………………………………………………… 1 1.组织工程角膜的研究现 状……………………………………………………………… 1 2.纤维蛋白胶的生物学特 性……………………………………………………………… 2 3.纤维蛋白胶在组织工程角膜中的应 用………………………………………………… 2 4.纤维蛋白胶在角结膜疾病中的应 用…………………………………………………… 3 5.纤维蛋白胶在眼科应用的发展前 景…………………………………………………… 4 6.本研究的目的及意 义…………………………………………………………………… 5 第一部分 兔角膜上皮、基质和内皮细胞的体外培 养………………………………… 7 引 言…………………………………………………………………………………… 7 一、体外培养兔角膜上皮细 胞…………………………………………………………… 7 材料与方 法………………………………………………………………………………… 7 结 果…………………………………………………………………………………… 14 讨 论…………………………………………………………………………………… 15 附 图…………………………………………………………………………………… 17 二、体外培养兔角膜基质细 胞…………………………………………………………… 19 材料与方 法………………………………………………………………………………… 19 结 果…………………………………………………………………………………… 20 讨 论…………………………………………………………………………………… 21 附 图…………………………………………………………………………………… 22 二、体外培养兔角膜内皮细 胞…………………………………………………………… 23 材料与方 法………………………………………………………………………………… 23 结 果…………………………………………………………………………………… 24 讨 论…………………………………………………………………………………… 24 附 图…………………………………………………………………………………… 26 第二部分 纤维蛋白胶组织工程角膜细胞片的构 建…………………………………… 27 引 言…………………………………………………………………………………… 27V 纤维蛋白胶角膜细胞片及其对结膜上皮黏合作用的研究 目 录 一、组织工程角膜上皮细胞片的构 建…………………………………………………… 27 材料与方 法………………………………………………………………………………… 27 结 果…………………………………………………………………………………… 29 讨 论…………………………………………………………………………………… 29 附 图…………………………………………………………………………………… 31 二、组织工程角膜基质细胞片的构 建…………………………………………………… 32 材料与方 法………………………………………………………………………………… 32 结 果…………………………………………………………………………………… 32 讨 论…………………………………………………………………………………… 33 附 图…………………………………………………………………………………… 34 三、组织工程角膜内皮细胞片的构 建…………………………………………………… 35 材料与方 法………………………………………………………………………………… 35 结 果…………………………………………………………………………………… 35 讨 论…………………………………………………………………………………… 36 附 图…………………………………………………………………………………… 37 第三部分 纤维蛋白胶对兔结膜上皮黏合作用的研 究………………………………… 38 引 言…………………………………………………………………………………… 38 材料与方 法………………………………………………………………………………… 38 结 果…………………………………………………………………………………… 40 讨 论…………………………………………………………………………………… 42 附 图…………………………………………………………………………………… 45 结 论…………………………………………………………………………………… 47 问题与展 望………………………………………………………………………………… 48 参考文 献…………………………………………………………………………………… 49 英文缩略 词………………………………………………………………………………… 57 在读期间发表文 章………………………………………………………………………… 58 致 谢…………………………………………………………………………………… 59VI 纤维蛋白胶角膜细胞片及其对结膜上皮黏合作用的研究 前 言 前 前 前 前 言 言 言 言 1、 、 、 、组 组 组 组织 织 织 织工 工 工 工程 程 程 程角 角 角 角膜 膜 膜 膜的 的 的 的研 研 研 研究 究 究 究现 现 现 现状 状 状 状 正常角膜是组成眼球外壁的透明纤维膜, 具有防御和屈光等多种主要功能。角膜组织 有上皮层、前弹力层、基质层、后弹力层及内皮层5层结构,其中前、后弹力层为无细胞成 分的均质结构。角膜是构成眼球的第一道屏障,完成90%以上的屈光功能, 对视觉形成极其 重要, 同时角膜病患病率高,是主要的致盲性眼病之一,且每年因眼外伤和角膜溃疡而致盲 [1] 的新发病例达到150-200万 。 同种异体角膜移植术是治疗角膜盲的唯一有效方法, 但角膜 供体来源匮乏、术后并发症限制了它的临床应用, 因此,寻求可用于人体移植的人工角膜, 扩大供体来源,满足患者需求成为迫切需要解决的问题。 组织工程技术的兴起和发展则为其开辟了崭新的治疗前景。组织工程学是应用生物学 和工程学的原理,在正确认知哺乳动物正常及病理两种状态下组织结构与功能关系的基础 [2] 之上, 研究开发能够修复、维持或改善损伤组织功能的生物替代物的一门科学 。组织工 程角膜是近年来随着生物材料、细胞生物学以及人工器官研制的迅速发展而出现的高科技 项目,是利用组织工程技术、细胞工程技术以生物材料或人工合成材料为载体,将角膜3 种细胞共同接种于载体上进行培养,体外重建角膜组织,构建与正常角膜功能等效的活性 人工角膜,以其取代人供体角膜,旨在为角膜病及眼表疾病的临床治疗提供较好的材料来 源,解决供体角膜来源匮乏的问题。这种应用三维培养技术构建形态、功能与正常角膜类 似的活性人工供体角膜,代替常规角膜移植治疗角膜疾病,是角膜疾病治疗的新思路。 [3] 1993年Mimami等 应用三维培养技术,首先成功建立牛角膜重建模型,角膜基质细胞 加入三维胶原凝胶,上下表面覆盖角膜上皮和内皮细胞,采用气-液界面技术共同培养。体 外重建角膜与正常角膜具有相似结构,上皮有5-6 层细胞, 细胞间连接存在, K3 特异 性,AE5单抗染色阳性;角膜基质细胞呈纺锤状、长形,与胶原凝胶表面平行排列;内皮细胞 层呈网状结构;上皮与基底膜可测得整合素和基底膜成分阳性。之后,Griffith、Germain 、 [4 5] 等 对三维角膜的构建进行了深入的研究。随着各种三维角膜的重建,提供了与活体角 膜更接近的理想模型,促进了对体外培养条件下角膜细胞特性的研究。例如,现在已应用 重建的三维角膜研究细胞间、细胞-基质间相互作用及其机制、毒性及药效的检验,以及角 膜生理、病理、基因表达等方面的研究。目前,对于全层角膜组织的研究仅限于体外构建, 而分层组织工程角膜中角膜上皮细胞的培养及移植已应用于临床,组织工程角膜的发展进 入一个新的阶段。由于眼免疫赦免现象和角膜的无血管特性,角膜移植术成功率达80%以上,是全身器官 1纤维蛋白胶角膜细胞片及其对结膜上皮黏合作用的研究 前 言 移植中成功率较高的,这就为体外构建组织工程角膜取代人供体角膜移植奠 定了解剖及组 [6] 织学上的可行性 。角膜上皮层、基质层、内皮层以及全层角膜构建的深入研究,为实现 复层生物角膜的构建打下了基础,随着种子细胞来源的拓展以及新生物材料的开发与应 用,借助于生物学、工程材料学、医学等各领域的发展,构建在物理和生理特性上更接近 正常组织、生物相容性更好、免疫原性更低的组织工程化角膜成为可能,用组织工程化角 膜取代人供体角膜移植有望成为现实,这将改变角膜病的治疗手段,具有重要的临床意义 和使用价值,是眼科界研究的热点。 2、 、 、 、纤 纤 纤 纤维 维 维 维蛋 蛋 蛋 蛋白 白 白 白胶 胶 胶 胶的 的 的 的生 生 生 生物 物 物 物学 学 学 学特 特 特 特性 性 性 性纤维蛋白胶(fibrin glue, FG),又称纤维蛋白黏合剂(fibrin sealant, FS),是一种生物 蛋白制剂,主要成分是纤维蛋白原和凝血酶,各成分混合后模拟体内凝血的最后阶段,最 终形成稳定的纤维蛋白多聚体,最早应用于伤口止血,FG对机体不产生毒副作用,不引起 炎症反应,组织反应性极小,在促进伤口愈合、封闭组织缺损等方面有着良好 的作用。近 年来在临床各科手术中广泛应用。随着眼科医疗技术要求的不断提高,FG已在多种眼科疾 病的治疗中获得成功应用,并作为一种生物材料支架用于组织工程角膜的构建,有着良好 的应用前景。 FG由含纤溶酶原、纤维结合蛋白、凝血因子XIII的纤维蛋白原、凝血酶、抑肽酶、氯 化钙组成,使用时将冻干纤维蛋白原溶于抑肽酶溶液中,把冻干凝血酶溶于氯化钙溶液中, 两种溶液混合后,纤维蛋白原在凝血酶作用下形成纤维蛋白单体,纤维蛋白单体可由氢键 2+ 及静电引力作用聚合成不稳定的可溶性纤维蛋白纤维。凝血酶同时还激活因子XIII,在Ca 存在下,活性态XIIIa参与纤维蛋白多肽的交联,形成坚固的不易降解的凝块,它还能刺激 成纤维细胞的生长。纤维结合蛋白、纤维蛋白可与组织中胶原交联,因此FG在胶原丰富组 [7] 织如角膜基质中表现出高粘附性 。 3、 、 、 、纤 纤 纤 纤维 维 维 维蛋 蛋 蛋 蛋白 白 白 白胶 胶 胶 胶 在 在 在 在组 组 组 组织 织 织 织工 工 工 工程 程 程 程角 角 角 角膜 膜 膜 膜中 中 中 中的 的 的 的应 应 应 应用 用 用 用近年来, FG作为组织工程支架材料在体外重建软骨组织、皮肤等均获成功并用于移植。 [8] 傅捷等 在 FG中培养关节软骨细胞,发现软骨细胞可在 FG中增殖,保持其表型并可分泌 [9] 软骨基质。Park 等 用 FG 与透明质酸酶制备复合支架,植入裸鼠皮下,研究发现使用复 合材料可缩短类软骨物质形成时间,增加细胞外基质、胶原等的分泌,并可保持其原始尺 [10] 寸,作为组织工程软骨支架具有良好的可行性。葛薇等 将诱导的骨髓间充质干细胞与 FG 复合后接种于裸鼠皮下,6w时形成软骨样组织,12w时组织块体积增大强度增加,FG完 全降解,构建的软骨样组织具有软骨组织典型的形态和特征,并且分泌功能旺盛。在皮肤 2纤维蛋白胶角膜细胞片及其对结膜上皮黏合作用的研究 前 言 [11] 组织工程方面,Kamolz 等 在 FG中加入人成纤维细胞作为角朊细胞培养系统,15d 后形 成 3-4 层细胞的规则上皮片,认为该系统为角朊细胞移植提供了良好的媒介,易于观察其 生长,消除了酶的影响,缩短了细胞培养时间,有着良好的应用前景。近年来,FG 作为 组织工程角膜的一种新型支架材料逐渐成为研究的热点。 FG有一定的可塑性,可制成各种形状和厚度,可被机体降解吸收,吸收时间的长短与 局部纤溶活性及 FG 的厚度有关,并且它具有一定的韧性,可用于临床移植,是比较理想 [12] 的组织工程角膜支架材料。Rama等 应用 FG进行角膜缘干细胞的培养,并对干细胞严重 [13] 丧失的患者进行了自体移植,术后大部分患者获得完整透明的角膜上皮。Han 等 的研究 表明,以 FG 为基础的基质支持角膜上皮细胞的生长与分化,由于细胞和 FG 的各种成分 [14] 均来自人体,使自体生物工程替代物的制备具有良好的发展潜力。梅芳等 将新生兔与成 兔角膜缘上皮种植于 FG载体,培养 10d-14d 透射电镜下 FG上的角膜上皮细胞超微结构良 好,体外培养 7d 左右即能较好地形成单层上皮细胞,2w 左右形成的复层上皮细胞与 FG [15] 构成角膜上皮组织经检测与生理状态下的角膜上皮组织相近。Talbot 等 将培养的兔自体 角膜缘上皮细胞接种于 FG,待其融合后,用显微镊将 FG自培养皿剥离,修剪后以缝线缝 合于裸露的角膜表面,3d FG 即完全降解,角膜上皮附着于角膜基质,7d 出现 2~3 层上 皮细胞,2m 组织学检查即可见眼表有正常角膜上皮表型形成。上述实验均证实 FG是一种 理想的角膜细胞生长及移植载体。尽管以 FG 为载体角膜细胞的体外培养取得了初步成果, 但其稳定性及在临床应用的可行性还有待做进一步的研究。 4、 、 、 、纤 纤 纤 纤维 维 维 维蛋 蛋 蛋 蛋白 白 白 白胶 胶 胶 胶在 在 在 在角 角 角 角结 结 结 结膜 膜 膜 膜疾 疾 疾 疾病 病 病 病中 中 中 中的 的 的 的应 应 应 应用 用 用 用 传统的眼科手术采用显微缝线闭合角结膜植片,将对组织造成医源性再损伤,缝线的 异物性,造成病人的不舒适感,且术后易继发感染。FG 具有一定的可塑性、粘附性,模 拟体内凝血的过程,是自然愈合过程的强化,代替缝线固定植片,可缩短手术 时间,大大 减少病人术后异物感,长期的实验研究和临床应用证明其对人体无毒性作用,近年在封闭 角膜溃疡穿孔,固定角结膜移植片术中得到越来越多的应用,取得了良好的治疗效果。 角膜溃疡时,裸漏的角膜基质含有大量的胶原,FG可与富含胶原的组织相互交联、粘 连。FG中的纤维结合蛋白具有刺激成纤维细胞增殖的作用,可刺激溃疡愈合。Duchesne [16] 等 在角膜穿孔羊膜移植术中使用FG,术后均无并发症发生,初步显示出FG优越性。 [17] Sharma等 进一步比较了FG与氰基丙烯酸酯(为合成材料黏合剂)在角膜穿孔治疗中的作 用,发现对直径3mm以下的角膜穿孔二者的治疗效果相近,不同的是FG更接近生理愈合过 [18] 程,新生血管较少。最近,Hick等 采用羊膜联合FG治疗14例角膜溃疡穿孔病人,仅1例 3纤维蛋白胶角膜细胞片及其对结膜上皮黏合作用的研究 前 言 严重Stevens-Johnson综合症伴弥漫性角膜缘缺损的病人未实现上皮再生, 治愈率达到92%, 而单独羊膜治疗组治愈率仅为74%。FG能够刺激成纤维细胞活性,并为其移行提供细胞外 基质,无毒性作用,因而能够激活伤口愈合过程。作者认为对于直径3mm以下的角膜溃疡 穿孔,羊膜联合FG移植是一种有效的治疗方法,能够促进快速稳定的眼表组织重建。 板层角膜移植术常规用缝线固定,缝线虽然可使植片固定良好,但同时也增加了术后 散光和缝线感染的危险性,而以 FG 为基础的无缝线固定技术的应用则可很大程度上减低 [19] 这种风险。Rosenthal 等 最早尝试用血小板、纤维蛋白原、凝血酶混合物行无缝线兔自体 板层角膜移植术,50%获得成功,对角膜无抗原性及毒性,不引起炎症反应,并对角膜透 [20] 明度及上皮重建无影响。陈蔚 等用微型角膜刀制作植片和植床,并用 Tisseel(奥地利 BAXTER AG公司)将植片黏附于植床,92%的植片在位,术后一个月角膜完全透明,证明 此手术方式简便、安全,术后角膜的创伤愈合反应轻微,FG 不影响角膜的光 学性能。 [21] Kaufman 等 进行的角膜疤痕无缝线板层角膜移植术中,利用 FG 将羊膜移植于行病灶清 除术后的组织缺损处,术后应用绷带式软性角膜接触镜,最终所有板层角膜移植片愈合良 好并保持透明。研究表明 FG 的使用可缩短手术时间,减少缝线对植床边缘的创伤及术后 缝线感染的风险,FG 的止血作用也可减少瘢痕清除过程中的出血。 翼状胬肉是局部球结膜纤维血管组织呈三角形增生并可侵犯角膜的一种疾病,常规的 治疗大都采用胬肉切除后显微手术缝线固定结膜植片修补结膜缺损。Cohen等最早将FG应 [22] 用于翼状胬肉手术,联合缝线确保移植片固定良好。Koranyi等 在20例鼻侧翼状胬肉手术 中,将凝血酶溶液滴于巩膜暴露区,而将纤维蛋白溶液滴于植片内表面,在30s内迅速翻转 植片覆盖于植床并使其对合良好,结果显示FG与对照组的使用缝线可明显缩短手术时间和 [23] 减轻术后痛。Pfister等 则在角膜缘干细胞移植物与巩膜暴露区之间注射 薄层FG治疗翼状 胬肉,术后仅1例发生轻微复发且无并发症,进一步证明了FG在翼状胬肉手术中的有效性 [24] 和安全性。在Marticorena等 的实验中,同样用FG黏合自体结膜瓣,术后仅25%病例有轻 微异物感,90%的病例结膜瓣在位,FG的使用可避免缝线带来的并发症,并可减轻术后异 物感。这些实验均FG黏合法是翼状胬肉手术中植片固定的有效替代技术。 5、 、纤 纤维 维蛋 蛋白 白胶 胶在 在眼 眼科 科应 应用 用的 的发 发展 展前 前景 景 、 、纤 纤维 维蛋 蛋白 白胶 胶在 在眼 眼科 科应 应用 用的 的发 发展 展前 前景 景 FG的止血和黏合特性在眼外科等领域发挥了重要作用,随着对其生物学特性、临床安 全性和释放降解机制研究的进一步深入,有望成为眼科医生的有力武器。FG 的研究方向 主要有: ?作为组织工程角膜支架材料,由于其良好的可塑性和生物降解性,可用于体外 构建人工角膜,治疗角膜疾病,缓解因角膜来源匮乏带来的诸多问题; ?作为止血剂和黏 4纤维蛋白胶角膜细胞片及其对结膜上皮黏合作用的研究 前 言 合剂,FG有望发挥独到的止血和黏合特性,缩短手术时间,有效控制眼科手术创面渗血, 减少使用缝线引起的吻合口漏、术后不适感等并发症的发生; ?作为药物载体,FG 可准 确定位并局部缓慢释放药物,避免全身用药治疗局部疾病而造成对血液、肝肾功能的影响, 如抗生素以 FG 为载体治疗细菌性角膜炎症; ?进一步提高安全性,尽量减少因使用人血 制品而造成疾病传播的危险。随着生物工程技术的不断发展,过去 FG 应用的不利因素例 如病毒传播、制备和应用的复杂性、胶体的不稳定性等正逐渐解决,相信未来 FG 将会在 眼科及组织工程的应用方面发挥更大的作用。 6、 、 、 、本 本 本 本研 研 研 研究 究 究 究的 的 的 的目 目 目 目的 的 的 的及 及 及 及意 意 意 意义 义 义 义 6.1 兔 兔 兔 兔角 角 角 角膜 膜 膜 膜3种 种 种 种细 细 细 细胞 胞 胞 胞体 体 体 体外 外 外 外培 培 培 培养 养 养 养的 的 的 的研 研 研 研究 究 究 究 体外培养角膜 3 种细胞是构建组织工程角膜的基础工作,掌握角膜组织 3 种细胞体外 培养的生物特性,可以为构建组织工程角膜提供更好的种子细胞。事实上, 眼科研究工作 者在角膜上皮细胞、基质细胞、内皮细胞体外培养上已经进行了长期的探索,本研究综合 过去多种培养方法,反复实验,探索相对方便高效的兔角膜 3 种细胞的原代培养方法和体 系,研究角膜组织 3 种细胞体外培养的生物学特性,为构建组织工程角膜奠定实验基础。 6.2 纤 纤 纤 纤维 维 维 维蛋 蛋 蛋 蛋白 白 白 白胶 胶 胶 胶为 为 为 为载 载 载 载体 体 体 体角 角 角 角膜 膜 膜 膜细 细 细 细胞 胞 胞 胞片 片 片 片的 的 的 的研 研 研 研究 究 究 究组织工程化角膜的构建一般应用经典的组织工程方法,即借助载体支架复合构建移植, 然而载体材料的使用也会带来一系列问题,如与组织的相容性问题,降解产物对组织是否 具有毒性等。而无载体细胞片工程(cell sheet engineering)的发展则为解决这一难题指明 了方向。自该技术首次报道以来,在各种器官二维和三维的细胞片工程研究中取了瞩目的 成果。细胞片工程已成为再生医学领域的研究热点。利用细胞片工程技术已成功制备了血 [25-28] 管内皮细胞、肾上皮细胞、角膜上皮和内皮细胞片 。 目前研究较多的温度敏感培养皿及磁组织工程无载体细胞片制备方法,培养 体系的制 备过程复杂,技术要求高,在一般实验室无法完成,广泛应用尚存在一定的技术难题,因 [29] 此寻找一种适合广泛开展的组织工程细胞片制备方法就显得极为迫切。Itabashi 等 将心 肌细胞种植于FG包被的培养皿表面,4d获得的心肌细胞片完整,细胞损伤小,检测发现与 生理状态下心肌细胞相似,表现较强的自律性。研究证实FG与心肌细胞具有良好的组织相 容性,在体外培养条件下,可被细胞分泌的蛋白酶类降解,短期内即可获得状态良好的无 载体组织工程细胞片,且FG包被培养皿的制备无需特殊设备和技术,材料易得,几乎所有 的细胞均可粘附于其表面生长, FG包被培养皿有望成为一种简便高效的组织工程细胞片制 备方法。本研究在成功进行了角膜3种细胞的常规培养、羊膜上培养及壳聚糖和胶原合成 5纤维蛋白胶角膜细胞片及其对结膜上皮黏合作用的研究 前 言 材料培养的基础上,在FG上培养角膜3种细胞,观察角膜3种细胞生物活性及细胞与FG生 物相容性,尝试构建无载体组织工程角膜细胞片,为下一步进行组织工程角 膜的构建和移 植打下基础。 6.3 纤 纤 纤 纤维 维 维 维蛋 蛋 蛋 蛋白 白 白 白胶 胶 胶 胶对 对 对 对兔 兔 兔 兔结 结 结 结膜 膜 膜 膜黏 黏 黏 黏合 合 合 合作 作 作 作用 用 用 用的 的 的 的研 研 研 研究 究 究 究 FG是一种生物止血和黏合剂,它模拟体内的凝血过程,具有一定的可塑性和黏附性, 且无排斥反应和毒副作用,在眼睑成型术、封闭角膜溃疡穿孔、闭合角、结膜及白内障手 [7] 术切口等眼科领域的应用均有报道 。翼状胬肉是眼科常见病,在广东部分沿海地区尤其 [22-24] 多发。目前,FG黏合角膜缘结膜自体移植是临床治疗翼状胬肉的热点 ,针对 FG黏合 自体结膜移植相关基础研究报道较少的现状,我们进行了 FG在兔结膜上黏合效果的研究, 拟探讨 FG 黏合结膜及角膜缘上皮后在促进上皮再生、伤口愈合及提高植片吻合效果等方 面的情况,对这些客观指标做出评价,为 FG 在眼科领域的临床应用提供实验支持。6纤维蛋白胶角膜细胞片及其对结膜上皮黏合作用的研究 第一部分 第 第一 一部 部分 分第 第一 一部 部分 分兔 兔 兔 兔角 角 角 角膜 膜 膜 膜上 上 上 上皮 皮 皮 皮、 、 、 、基 基 基 基质 质 质 质及 及 及 及内 内 内 内皮 皮 皮 皮细 细 细 细胞 胞 胞 胞体 体 体 体外 外 外 外培 培 培 培养 养 养 养 引 引 引 引 言 言 言 言 组织工程角膜是应用兔角膜上皮细胞、基质及内皮细胞和生物材料,通过三维培养技 术,获得培养重建的角膜,体外培养角膜 3 种细胞是组织工程角膜的基础工作,事实上, 眼科研究者在角膜上皮细胞、基质细胞及内皮细胞体外培养上已经进行了长期的探索,但 [30] 获得角膜细胞纯培养仍存在问题 ,本文探索相对简单、高效的兔角膜 3 种细胞的原代纯 培养方法和体系,研究体外培养的角膜 3 种细胞的生物学特性,为构建组织工程角膜提供 良好的种子细胞。 一 一、 、体 体外 外培 培养 养兔 兔角 角膜 膜上 上皮 皮细 细胞 胞 一 一、 、体 体外 外培 培养 养兔 兔角 角膜 膜上 上皮 皮细 细胞 胞 材 材 材 材料 料 料 料和 和 和 和方 方 方 方法 法 法 法 1.主要实验材料 1.1 主要试剂 1.1.1 一般试剂 氯化钠 Sodium chloiride 广州化学试剂厂 氯化钾 Potassium chloiride 广州化学试剂厂 磷酸二氢钠 Dissodiun hydrogen phosphate dodecalogdrate广州化学试 剂厂 磷酸二氢钾 Pattassium dihudrogen phosphate 广州化学试剂厂 碳酸氢钠 Sodium hydrogen carbonate 广州化学试剂厂 氢氧化钠 Sodium hydroxide 广州化学试剂厂 硫酸 sulphuric acid广州化学试剂厂 重铬酸钾 Potassium dichromate 广州化学试剂厂 1.1.2 细胞培养试剂 D-MEM/F12 培养基Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12美国 Gibco 公司 胎牛血清 Fetal Bovine serum ,FBS奥地利 PAA公司 胰蛋白酶 Tryptase美国 Amresco 公司 中性蛋白酶?(Dispase?) 美国 Sigma公司7纤维蛋白胶角膜细胞片及其 对结膜上皮黏合作用的研究 第一部分 乙二胺四乙酸二钠EDTA美国 Amresco 公司 胰岛素 Insulin 美国 Sigma公司转铁蛋白(transferr)美国 Sigma公司 表皮生长因子epidermal growth factor,EGF日本 TOYOBO 公司 腺嘌呤 Adenine 美国 MBChem 公司 氢化可的松 Hydrocortisone沈阳济世制药有限公司 青霉素Penicillin,链霉素Streptomycin 广州天心药业股份有限公司 1.1.3 免疫组化试剂 5-溴-2’脱氧尿嘧啶(5-Bromo-2’-Deoxyuridine BrdU) 美国 Sigma公司 Triton-X100 美国 Sigma公司 4%多聚甲醛 广州新成化工厂 3%过氧化氢 广州新成化工厂 中性树胶 中国上海标本模型厂 5-溴-2’脱氧尿嘧啶单抗(Monoclonal Anti-BrdU)美国 Sigma公司 FITC-IgG 武汉博士德生物工程有限公司 SABC 免疫组化试剂盒武汉博士德生物工程有限公司 DAB显色试剂盒 武汉博士德生物工程有限公司 角蛋白Keratin, Pan A6-1(AE1/AE3)单克隆抗体 美国 Lab Vision 公司 1.2 主要实验仪器及器材 1.2.1 细胞培养所用仪器及器材 SartoriusBS210S 型电子天平 北京塞多利斯仪器系统有限公司 l32R 型低温离心机 德国 FORMA3111 型二氧化碳培养箱美国 Forma公司 LEOCADM IL HC 型倒置显微镜德国 Leica 公司DM RA2 型正立电动荧光显 微镜德国 Leica公司 BCD-195D型冰箱 中国海尔集团 细胞记数板 国产 6 孔、24 孔培养板 CORNING公司 美国 2 25cm 塑料培养瓶 CORNING公司 美国 RS-1300 型超净工作台苏净集团安泰公司8纤维蛋白胶角膜细胞片及其对结膜上皮黏合作用的研究 第一部分 78HW-1 型恒温磁力搅拌器 杭州仪表电机厂 GF-2 型鼓风电热恒温干燥箱广州东方红医疗器械厂 1810B型自动双重纯水蒸馏器 上海申力玻璃仪器有限公司 XTL-30-D型连续变倍体微镜 北京泰克仪器有限公司 蠕动泵 D100B 上海 1000ml 300-4100 型可反复用抽滤装置 Nalgene公司,德国 6130-0020 型手动真空泵Nalgene公司,德国 一次性 0.22μm 针筒滤器Millipre公司 美国 眼科剪、环钻、虹膜恢复器、角膜菱形刀等器械 苏州明仁医疗器械厂 1.2.2 扫描电镜设备 HCP-2 型 CO2 临界干燥器HITACHI公司,日本 JEDL/JFC-1100 真空离子溅射仪 HITACHI公司,日本 PHILIPS XL-30ESEM 扫描电镜Philips 公司, 荷兰2. . . .主 主 主 主要 要 要 要方 方 方 方法 法 法 法2.1 主 主 主 主要 要 要 要试 试 试 试剂 剂 剂 剂的 的 的 的配 配 配 配制 制 制 制 2.1.1 D-MEM/F12 基础培养基 三蒸水溶解粉 D-MEM/F12(1 包)加入 1.2g NaHCO ,磁力搅拌器充分混匀,加三蒸 3 水至最终量,定容至 1000ml。PH试纸测培养基 PH值,加入少量 1 M NaOH或 1M HCL 调 PH至 7.0 左右,用抽滤装置和普通滤纸粗过滤培养基,用一次性 0.22μm 孔径针筒滤器 再次过滤除菌,4 ?下保存备用。 2.1.2 角膜上皮细胞完全培养基取 90ml D-MEM/F12 基础培养基,加入 10ml 胎牛血清, 100u 胰岛素, 1μg EGF, 0.05mg 4 氢化可的松,0.018mM 腺嘌呤,0.5mg转铁蛋白,1×10 u 青霉素,10mg 链霉素。 2.1.3 组织培养、传代消化液 取 0.5g、 0.25g胰蛋白酶干粉分别溶解于 100ml D-Hanks液中,用 1 M NaOH或 1 M HCL 调 P H至 8.0 左右,充分搅拌,用一次性 0.22μm 孔径针筒滤器过滤除菌,每 2ml 分装,最 终浓度达 0.5%和 0.25%胰蛋白酶消化液。-20 ?下保存备用。 取 0.04g EDTA溶于 100ml D-Hanks 液中, 充分搅拌,用一次性 0.
/
本文档为【纤维蛋白胶角膜细胞片及其对结膜上皮黏合作用的研究】,请使用软件OFFICE或WPS软件打开。作品中的文字与图均可以修改和编辑, 图片更改请在作品中右键图片并更换,文字修改请直接点击文字进行修改,也可以新增和删除文档中的内容。
[版权声明] 本站所有资料为用户分享产生,若发现您的权利被侵害,请联系客服邮件isharekefu@iask.cn,我们尽快处理。 本作品所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用。 网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽..)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。

历史搜索

    清空历史搜索