【word】 离体条件下辽细辛精油对灰葡萄孢菌细胞壁降解酶活性的影响

【word】 离体条件下辽细辛精油对灰葡萄孢菌细胞壁降解酶活性的影响 离体条件下辽细辛精油对灰葡萄孢菌细胞 壁降解酶活性的影响 第28卷第6期 2009年l2月 华中农业大学 JournalofHuazhongAgriculturalUniversity Vo1.28No.6 Dec.2009,675,679 离体条件下辽细辛精油对灰葡萄孢菌 细胞壁降解酶活性的影响 王桂清孙华 (山东聊城大学农学院,聊城252059) 摘要以辽细辛精油为材料,以黄瓜灰霉病致病菌灰葡萄孢菌为靶标,利用紫外可见分光光度计,采用比色 法在离体条件下测定了辽细辛精油对灰葡萄孢菌细胞壁降解酶活性的影响.结果明:辽细辛精油对果胶甲基 半乳糖醛酸酶(pectinmethy1galactui.nase,PMG),胞内果胶甲基反式消除酶(pectinmethyltranseliminase, PMTE),果胶总酶,胞内1,28-D葡聚糖酶(C1酶),胞外羧甲基纤维素酶(Cx酶)和蛋白酶均主要表现为激活作 用;对胞外PMTE酶和胞内C1酶表现为抑制作用;激活/抑制作用与精油浓度之间不成比例关系.这说明辽细 辛精油对灰葡萄孢菌细胞壁降解酶活性的影响不是抑菌作用的主要机制. 关键词辽细辛精油;灰葡萄孢菌;细胞壁降解酶 中图法分类号S482.2文献标识码A文章编号1000—2421(2009)06—0675—05 多年来,化学农药因效果好,见效快,价格便宜, 使用方便,适合工业化大生产而在全世界范围内被 广泛应用.然而,随着化学农药的长期大量使用,其 副作用(对人畜的毒性,对环境的污染,有害生物抗 性的产生,杀伤天敌及引起害虫再猖獗等)越来越明 显.有机合成农药的种种弊端使天然产物农药日益 受到重视,寻找高效农药的替代品成为我国农业的 紧要任务.生物农药不污染环境,不产生公害,具有 广阔的发展前景,植物源农药是其非常重要的组成 部分. 辽细辛EAsarum,Pror0oe5Fr.Schmidt var.mandshuricum(Maxrm)Kitag.]为马兜铃科细 辛属草本植物,是我国重要的中草药_1].细辛中含 有挥发性植物油(占3左右),主要成分为甲基丁 香酚,香脂素,黄樟醚,细辛醚等.研究表明细辛提 取物对细菌,酵母,霉菌都有一定的抑菌作用[2,且 对番茄灰霉病菌菌丝生长和分生孢子萌发的抑制作 用均与浓度呈正相关E引.辽细辛精油对黄瓜灰葡萄 孢菌的抑菌效果较好l4].为进一步深入了解辽细辛 精油的抑菌机理,评价其应用价值和作为植物源农 药的开发前景,笔者以辽细辛精油为材料,以黄瓜灰 霉病致病菌灰葡萄孢菌为靶标病菌,在离体条件下 观察了辽细辛精油对灰葡萄孢菌细胞壁降解酶活性 的影响,旨在为开发和应用植物杀菌剂提供理论依 据. 1材料与方法 1.1供试病菌 引起黄瓜灰霉病的灰葡萄孢菌(Botrytiscine— rea)由聊城大学农学院植物病理实验室提供.将接 种好的PDA培养基放入(25?1)?的恒温箱中培 养5d左右,备用. 1.2植物提取物及配制 供试植物提取物为辽细辛精油.采用超临界 CO.萃取法(所用仪器为沈阳天诚超临界萃取有限 公司制造的TC-SFE-42—5—120S超临界萃取设备) 提取,提取率为2.279/6. 药液的配制:先将辽细辛精油用少许无水乙醇 充分溶解,用无菌水配制成3200mg/L的母液,然 后用无菌水稀释成200,400,8OO,1600,3200mg/L 等5个浓度梯度,备用. 1.3细胞壁降解酶的提取 1)细胞壁降解酶的诱导.先配制细胞壁降解酶 诱导培养基(KNOs2.0g,KC10.5g,FeSO 0.01g,KzHPO41.0g,MgSO4?7H2O0.5g,维 生素B10.1g,L-asparagines0.5g,CMC或果胶 收稿日期:2009,0211修回日期2009—06—09 *山东省自然科学基金项目(Y2008D57)资助 工桂清.女,1968年生,博士,教授.T作单位:山东聊城大学农学院,聊城252059.E-mail:guiqingwang2003@yahoo.com.en 华中农业大学第28卷 10.0g,HO1000mL),pH调到5.0,再分装于 250mL三角瓶中,每瓶100mL,高压灭菌消毒.在 生长旺盛的病菌菌落边缘用直径5cm的打孔器打 孔,向每瓶中移置菌饼5片.(25?1)?下恒温振 荡培养(摇速为120r/rain)10d(果胶酶类)或15d (纤维素酶类). 2)菌体内细胞壁降解酶的提取.取培养好的菌 体经抽滤,自然晾干后,取1g加入2mL0.2mol/I 的磷酸缓冲液(pH7.0)放人预冷研钵中,在冰浴下 研磨成匀浆,转人离心管,4?14000r/min条件下 离心20min.以上清液作为酶提取液,置于一20? 冰箱中,备用. 3)菌体外细胞壁降解酶的提取.滤出菌体的培 养液转入离心管,4?14000r/min条件下离心 20min,上清液作为酶提取液,保存于一2O?冰箱 中,备用. 1.4细胞壁降解酶活性的测定 酶液的处理:取提取的原酶液0.2mL,分别与 各浓度精油溶液0.2mL混合(精油溶液的终浓度 为100,200,400,800,1600rag/L),37?反应 10min后作为新的离体测定用酶液. 果胶甲基半乳糖醛酸酶(pectinmethylgalactu— ionase,PMG),果胶甲基反式消除酶(pectinmeth— yhrans—eliminase,PMTE)和羧甲基纤维素酶(Cx 酶)活性的测定参照高增贵等的方法进行L5;果胶总 酶活性的测定参照李忠福等的方法进行__6]. 蛋白含量的测定采用考马斯亮兰G250方法进 行;内切1,4-t?一D葡聚糖酶(C1酶)活性的测定参照 张树政的方法进行[;蛋白酶活性的测定:利用果胶 酶的粗提取液作为酶源,参照郭圣茂等的方法进 行E引. 1.5数据分析 试验结果采用MicrosoftExcel软件进行数据 分析,线性回归由SPSS10.0完成;差异显着性分析 依据DuncanS新复极差法,由DPSv3.01完成. 2结果与分析 2.1辽细辛精油对PMG酶活性的影响 离体条件下辽细辛精油对灰葡萄胞菌PMG酶 活性的影响结果见表1. 由表1可知,离体条件下,处理组PMG酶活性 均高于对照组,对于胞内酶而言,酶活性提高率为 12,47,对于胞外酶而言,酶活性提高率为 679/6,81.这说明辽细辛精油对灰葡萄胞菌 PMG酶具有激活作用,且对胞外酶的激活作用高于 胞内酶.如在400mg/I浓度时,胞内酶活性提高 率为24,胞外酶活性提高率为74. 离体条件下辽细辛精油浓度对灰葡萄孢菌 PMG酶的活性有影响,表现为随着辽细辛精油浓度 的增大,酶活性升高,且对胞内酶影响较大;在不同 辽细辛精油浓度下,PMG胞内酶活性差异极显着, 胞外酶活性差异不显着. 表1离体条件下辽细辛精油对灰葡萄胞菌PMG酶活性的影响 Table1TheeffectsofasarunlessentialoilOilPMGofcucmnberB.cinereavitr o 1)同列数值后相同的小写或大写字母表示在0.05或0.01水平差异不显着,”一”表示不计算CK自身酶活性抑制率(下表同) Figuresfollowedbycommonletterwithinthesamecolumnarenotsignificant at0.05Or0.01level,”一”isthepercentageinhibition ofCK(thesameaSinthefollowingtables) 2.2辽细辛精油对PMTE酶活性的影响 由表2可知,离体条件下,精油处理后灰葡萄胞 菌PMTE酶活性发生变化,对于胞内酶而言,酶活 性抑制率在一98,219/6之间,差异极显着.当精 油浓度为100mg/L时,PMTE酶活性比对照组低, 酶活性抑制率达21;当精油浓度?200mg/I时, PMTE酶活性比对照组均高,表现出精油对PMTE 酶的激活作用,但激活程度并不随精油浓度的增大 而提高;对于胞外酶而言,精油处理后PMTE酶活 性下降,酶活性抑制率为12,87%,差异不显着. 这说明辽细辛精油对PMTE酶有抑制作用,但抑制 程度与精油浓度之问不成比例关系. 第6期王桂清等:离体条件下辽细辛精油对灰葡萄孢菌细胞壁降解酶活性的影响677 表2离体条件下辽细辛精油对灰葡萄胞菌PM-I-E酶活性的影响 Table2TheeffectsofasarunlessentialoiIonPMTEofcucumberB.cinereainv itro 2.3辽细辛精油对果胶总酶活性的影响 离体条件下,辽细辛精油对灰葡萄胞菌果胶总 酶活性的影响结果见表3. 由表3可知,离体条件下,精油处理后灰葡萄胞 菌果胶总酶活性提高,酶活性提高率为18, 48.这说明辽细辛精油对果胶总酶有激活作用, 但该激活程度与精油浓度无关. 随着精油浓度的增大,胞内酶活性呈现为先降 低后升高再降低的趋势,胞外酶活性呈现为先升高 后降低再升高的趋势.试验结果表明,辽细辛精油 对果胶总酶胞外酶的影响较大,且不同浓度间酶活 性的抑制率差异显着. 表3离体条件下细辛精油对灰葡萄胞菌果胶总酶活性的影响 Table3TheeffectsofasarunloiloilpectinaseofcucumberB.cinereainvitro 2.4辽细辛精油对C1酶活性的影响 离体条件下,辽细辛精油对灰葡萄胞菌C1酶 活性的影响结果见表4.由表4可知,离体条件下, 不同浓度的辽细辛精油对灰葡萄胞菌C1酶活性的 影响差异性不显着;辽细辛精油对胞外C1酶表现 为激活作用,酶活性提高率为40,80,但随着 精油浓度的增大,酶活性呈现先降低后升高再降低 的趋势,当精油浓度为800mg/L时,酶活性达到最 大(0.5843U/g),酶活性提高率达81;辽细辛精 油对胞内Cl酶表现为抑制作用,酶活性抑制率在 10,24之间,且随着精油浓度的增大,酶活性降 低,酶活性抑制率增加. 表4离体条件下辽细辛精油对灰葡萄胞茵C1酶活性的影响 Table4TheeffectsofasarulnessentialoilonC1ofcucumberB.cinereainvitro 2.5辽细辛精油对Cx酶活性的影响 离体条件下,辽细辛精油对灰葡萄胞菌胞外Cx 酶活性的影响结果见表5.测定结果表明,不同浓 度的辽细辛精油对胞外Cx酶活性的影响差异性不 显着,表现为激活作用;与对照比,精油处理后Cx 酶活性升高,增加1.2,1.7倍,酶活性提高率为 20,65;但随着辽细辛精油浓度的增大,酶活性 呈现先升高后降低的趋势,当精油浓度为800mg/L 时,酶活性达到最大,为14.0338U/g,酶活性提高 率达65. 678华中农业大学第28卷 表5离体条件下辽细辛精油对灰葡萄胞菌胞外Cx酶活性的影响 Table5TheeffectsofagarulnessentialoilonextracellularCxofcucumberB.ci nereainvitro 2.6辽细辛精油对蛋白酶活性的影响 离体条件下,辽细辛精油对灰葡萄胞菌蛋白酶 活性的影响结果见表6. 测定结果表明,不同浓度的辽细辛精油对蛋白 酶活性的影响存在极显着性差异,对胞内酶和胞外 酶活性升高,酶活性提高率增加,精油浓度与酶活性 成正比;胞内酶活性提高率为8,163,胞外酶 活性提高率为59/6,88.只有当精油浓度为100 mg/L时,胞外酶活性比对照低(156.2500U/g), 酶活性抑制率达5,精油对蛋白酶表现为抑制作 酶均主要表现为激活作用,且随着精油浓度的增大,用,其它浓度均表现为激活作用. 表6离体条件下辽细辛精油对灰葡萄胞菌蛋白酶活性的影响 Table6TheeffectsofasarlllnessentialoilonproteinaseofcucumberB.cinerea invitro 3讨论 本试验结果表明:辽细辛精油对PMG酶表现 为激活作用,且随着精油浓度的增大,酶活性升高; 对于PMTE酶,辽细辛精油对胞内酶主要表现为激 活作用,对胞外酶表现为抑制作用,但作用程度均与 精油浓度之问不成比例关系;辽细辛精油对果胶总 酶表现为激活作用,但该激活程度与精油浓度无关; 对于C1酶,辽细辛精油对胞外酶有激活作用,但随 着精油浓度的增大,酶活性呈现先降低后升高再降 低的趋势,对胞内酶有抑制作用,且随着精油浓度的 增大,酶活性抑制率增加;辽细辛精油对胞外Cx酶 有激活作用,且随精油浓度的增大,酶活性呈现先增 大后降低的趋势;辽细辛精油对蛋白酶主要表现为 激活作用,且随着精油浓度的增大,酶活性升高,酶 活性提高率增加,精油浓度与酶活性成正比.从酶 活性的变化可知,辽细辛精油对灰葡萄孢菌细胞壁 降解酶活性的影响主要表现为激活作用,这说明辽 细辛精油对灰葡萄孢菌的抑菌机理并不在于对病菌 细胞壁降解酶活性的抑制作用. 近年来,国内外对植物源农药在防治病害的机 理上取得了一定的研究成果.张龙等Eg]利用电导率 法和高效液相色谱法测定结果表明,绿帝和银泰2 种药剂对小麦纹枯病菌菌体细胞膜通透性和细胞麦 角甾醇含量没有影响,抑制作用机制应该进一步靶 向药剂对病菌细胞呼吸作用和对病菌细胞壁胞外水 解酶的影响等方面.周莉君等口0]以马桑提取物对 姜瘟病致病菌青枯假单孢菌的抑制机理做了初步探 索,结果表明,马桑提取物通过破坏病菌的细胞壁结 构,使细胞产生不正常空泡结构,细胞壁不完整,染 色质固缩,加人马桑提取物处理细胞的时间越长,此 种抑制作用越明显.夏忠弟等l11]研究了山苍子油 乳剂对白色念珠菌的抗菌机制,发现该香精中能抑 制标记前体的掺入(胸腺嘧啶核苷,尿嘧啶核苷,亮 氨酸,葡糖胺,醋酸钠标记前体),电镜观察可见胞壁 疏松,膜密度减少,推测该精油可抑制胞壁和胞膜成 分的合成,引起菌体破裂,内容物渗出致真菌死亡. 罗曼等[12-133采用多道分光光度分析系统与单细胞凝 胶电泳图像分析相结合,阐明了柠檬醛致黄曲霉孢 子丧失萌发力的机制,认为柠檬醛首先通过改变膜 的通透性损伤质膜进入细胞,进入细胞后,与DNA 相互作用,使DNA产生不可逆损伤,且与柠檬醛浓 第6期王桂清等:离体条件下辽细辛精油对灰葡萄孢菌细胞壁降解 酶活性的影响679 存在明显的剂量关系,从而失去对代谢的调节控 以及自我复制的正常进行. 刘海燕等_l采用电导法,测定了细辛挥发油对 生链格孢Alternariahumicola细胞膜通透性的 响,结果表明细辛挥发油可以破坏供试菌株细胞 的选择通透性,导致内容物的外渗,细胞膜是细辛 发油抗菌作用靶点之一.本研究结果表明,辽细 精油对灰葡萄孢菌的抑菌机理并不在于对病菌细 壁降解酶活性的抑制作用.辽细辛精油具有较广 高效的抗菌效力,推测其对菌体的效应可能不只 局限于某个方面,再者辽细辛精油中含有多种单体 成分,抗菌作用效果也可能是多种成分协同作用的 结果.辽细辛精油对病原菌细胞壁和细胞膜结构是 否有影响?是否对病原菌细胞核酸和蛋白质起作 用?是否对病原菌细胞能量代谢起作用?这些都有 待于进一步研究. 参考文献 [1]回瑞华,魏倩,盖泽广.辽细辛挥发油化学成分的研究[J]_辽宁 大学,1993,20(2):87—93. r2]张妙龄,唐裕芳,叶进富,等.细辛超临界CO2萃取物抑制活性 研究_J].四川I食品与发酵,2004,40(1):36—38. 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TheEffectsofAsarumEssentialOilonCellWallDegradation EnzymeofBotrytiscinereainvitro WANGGui—qingSUNHua (CollegeofAgronomy,LiaochengUniversity,ShandongProvince,Liaoche ng252059,China) AbstractTheasarumessentialoilsisanimportanttraditionalherbalmedicinei nChina.Itisre— portedthatithasantifungalactionandthemaincomponentsarevolatileoils.In ordertoexplorethemi— crobiostaticmechanismoftheasarumessentialoi1andprovidethetheoretica1basisforthedevelopment ofplantsourcedisinfectant,theultraviolet—visiblespectrophotometerwasu sed,thecolorimetricmethod wasadopted,cucumberBotrytiscinereawasusedasthetargetgerm,andtheeffectsofasarumessential oilonthecellwalldegradationenzymeactivityfrompathogeninvitro.Theresultsshowedthatthe3C— tivitiesofpectinmethylgalactuionase,intracellularpectinmethyltrans—eli minase,pectinase,extracellular C1,extracellularCxandproteinasewereactivatedbyasarumessentialoil;theactivitiesofextracellular pectinmethyltrans—eliminaseandintracellularC1wereinhibitedbytheasarumessentialoil.Thereisno proportionrelationbetweenactivation(orinhibition)andasarumessentialoi1concentration.Theout— comeindicatesthattheinhibitionofthecellwalldegradationenzymeactivityfrompathogenisntoneof microbiostaticmechanismsofasarumessentialoilonBotrytiscinerea. Keywordsasarumessentialoil;Botrytiscinerea;cellwalldegradationenzyme (责任编辑:陈红叶) 度制土影膜挥辛胞谱