微重力下生长的蛋白质晶体的溶剂结构研究

微重力下生长的蛋白质晶体的溶剂结构研究 董君潘冀森王耀萍毕汝昌 摘要 为了考察微重力在分子水平上的效应 ,特别是对水溶剂结构的影响 ,测定了空间和地面生长的多个鸡蛋清溶菌酶晶体和蝮蛇毒酸性磷脂酶 A2 晶体的结构 ,并做了结构比 较研究 。结果明 ,虽然微重力不足以改变蛋白质肽链的构象及与蛋白质分子联系较强 的溶剂分子的结合状况 ,但微重力可能改善与蛋白质分子联系较弱的有序水分子结构 。 这两种蛋白质晶体的结构测定结果也提示 ,微重力下蛋白质晶体质量改善的显示程度可 能与蛋白质晶体的溶剂含量相关 。这些发现从一个方面揭示了微重力改进蛋白质晶体质 量的机理 。另外 ,考虑到水分子对生命活动的重要性 ,这一初步结论的确认可能会对深入 开展微重力生命科学研究有所启示 。 关键词 微重力 蛋白质 晶体生长 晶体结构 水分子 中国图书资料分类法分类号 V534 St u dies on t he Sol vent St r uct u re i n P rotei n Cr yst a ls Grown i n M icrogr a vi t y. DON G J un , PAN J isen , WAN G Yaoping , B I Ruchang. Space Medicine & Medical Engineering ,1998 ;11 () 1:26,29 Abs t r act St ruct ures of Space - and gro und - grow n p rotein crystals were deter mined and co mpared fo r hen egg - w hite lysozyme and acidic p ho sp holipase A2 f ro m snake veno m. The result s show t hat microgravit y might imp rove t he st ruct ure of weakly bo und o rdered water molecules , t ho ugh it co uld not change t he p rotein co nfo r matio n and t he st ruct ure of solvent molecules bo und st ro nger to p rotein molecules. The result s also imply t hat t he degree of qual2 it y imp rovement of microgravit y - grow n p rotein crystals might be related to t he solvent co n2 tent in p rotein crystals. These findings might , in a respect , reveal t he mechanism of qualit y mp rovement of p rotein crystals grow n in microgravit y. In additio n , due to t he impo rtance of water molecules in life activities , t he co nfir matio n of t his p reliminary co nclusio n might en2 lighten guidance in f urt her st udies of life science in microgravit y. Key wor ds microgravit y p roteins crystal growt h crystal st ruct ure water molecule Address reprint requests to DON G J un . Instit ute of Biop hysics , Chinese Academy of Sci2 ences , Beijing 100101 ,China 主要用于三维结构测定的蛋白质晶体含有,简称为并具有不同程度有序性的结合水分子 大量水溶剂 ,一般占总体积的 30 %,75 % 。这 有序水结构 ; 另一类是围绕蛋白质分子的大量 也赋予了晶体中蛋白质分子类似溶液里的环 的位置无序水分子 。众多的研究结果表明 ,这 境 ,使其具有几乎完全的生物活性 。这些水可 些水分子 ,除了对稳定晶体里蛋白质分子的有 分为两类 : 一类是与蛋白质分子成弱作用联系 序排列是必需的外 ,特别是那些与蛋白质作用 较强的保守水分子 ,对维系蛋白质结构及其功 能发挥是异常重要的 ,甚至是不可缺少的 。 董 君 , 潘冀森 , 王耀萍 , 毕汝昌. 中科院生物物理研究所 , 北 空间的微重力环境为生长蛋白质等生物大 京 100101 本文于 1997 - 09 - 17 收到 ,1997 - 10 - 15 修回 分子晶体提供了良好的条件 ,十多年来的努力0 . 20 nm ,所得衍射数据的 Rmerge 值分别为 6 . 已使其成为一种重要的空间生物技术 。然而 , 3 % 、6 . 3 %和 4 . 5 % 。 尚待进一步弄清楚微重力对蛋白质晶体生长的 应用 XPL O R 程序包 , 通过结构修正的办 6 作用机理 。近几年 ,我们成功地进行了一些空 法 ,首先获得了溶菌酶 三 颗 晶 体 的 结 构, 随 间微重力条件下的蛋白质晶体生长实验 ,并获 后应用同样的方法又解得了磷酯酶 A2 三颗晶 1 ,3 得了质量 较 好 的 蛋 白 质 晶 体。为 了 考 察 体的 结 构 。这 当 中 , 根 据 2 Fo - Fc 和 Fo - Fc 微重力在分子水平上的效应 ,特别是对水溶剂 两种电子密度图表现及周围环境加入水分子和 结构的影响 ,我们对空间和地面生长的蛋白质 其它溶剂分子 ,一般水分子能与其周围原子以 晶体进行了结构测定 ,并做了结构比较研究 。 氢键联系 ,并且具有合理的温度因子值 。对溶 菌酶和酸性磷酯酶 A2 各 2 颗空间晶体和一颗 地面晶体最后解得了一个晶体学不对称单位所 晶体和结构测定 含的有序水分子数 ,它们分别为 130 、116 、132 、 ( ) 鸡蛋清溶菌酶 简称溶菌酶由 S I GMA 公、142 和 97 。141 司生产 ,而且没有经过进一步的纯化 。蝮蛇毒 通过结构修正最后得到的结构模型具有较 () 酸性磷脂酶 A2 简称磷脂酶 A2则是由中科院 好的精度 。三 个 溶 菌 酶 晶 体 结 构 的 晶 体 学 R 上海生物化学研究所的科研人员从中国浙江蝮 因子分别为 18 . 2 % 、17 . 3 %和 18 . 3 % ,而磷脂 4 蛇的毒液中提取的。空 间 生 长 的 这 两 种 酶 酶 A2 晶体结构的则都低于 0 . 16 ;同时 ,所有结 ( 的晶 体 是 在 我 国 返 回 式 卫 星 微 重 力 水 平 < 构模型的立体化学指标也是合理可取的 ,键长 - 4 ) 10 g上 ,用上海技术物理研究所制造的管式 RM S 偏差和键角 RM S 偏差取值范 围 分 别 是 汽相扩散结晶装置获得的 。结晶温度为 18 ? 0 . 0012,0 . 0014 nm 和 2 . 448,2 . 633 nm 。1 ?,在空间生长近两周的时间 。地面生长的蛋 白质晶体 ,则是在实验室里用常规的悬滴汽相 结构比较结果扩散法培养出来的 ,其结晶条件几乎与空间实 验条件相同 。用于收集衍射数据的两颗空间生 溶菌酶晶体结构的比较 应用最小二乘叠长的溶菌酶晶体分别来自 1992 年和 1994 年的 合法 ,对首先测定的溶菌酶晶体结构进行了比 空间实验样品 ,其晶胞参数与地面实验室生长 较 。从三个晶体获得的溶菌酶分子结构基本上 α的晶体一样 ,为 a = b = 7 . 86 nm ,c = 3 . 83 nm , 是相同的 ,与已测定的同类溶菌酶分子结构差βγ =异很小 。对从两个空间晶体解出的两个溶菌酶 == 90 ; 而用来收集衍射数据的两颗空间 生长的磷脂酶 A2 晶体 ,是在 1992 年空间结晶 分子结构进行了叠合比较 ,对于所有非氢蛋白 质原子计算的位置 RM S 差异为 0 . 0167 nm ,而 实验的基础上经过结晶条件优化而在 1994 年 5 空间结晶实验中获得的,其晶胞参数也与地 这两个溶菌酶分子结构与从地面晶体得到的分 面实 验 室 生 长 的 晶 体 相 同 , 即 a = b = 8 . 348 子结 构 的 同 类 差 异 分 别 为 0 . 0208 和 0 . 0215 αβγnm ,c = 3 . 289 nm , == 90 , = 120 。 nm 。考虑到测定误差的影响 ,三个晶体的溶菌 酶分子结构应该是相同的 。另外 ,在这三个测 用不同的面探测器系统收集了上述 6 颗蛋 白质晶体的衍射数据 : 两颗溶菌酶空间晶体的 定的溶菌酶晶体结构中 , 在相同的位置上发现 了 Na 离子和 Cl 离子结合部位 。 蛋白质晶体衍射分辨率分别为 0 . 16 和 0 . 18 nm ,相应的地 面晶体的分辨率高于 0 . 15 nm ,这三套溶菌酶 中的水溶剂对保持晶体的稳定 晶体 衍 射 数 据 的 Rmerge 值 分 别 为 5 . 83 % 、 性是至关重要的 ,特别是由弱作用力维系的蛋 白质分子周围的有序水分子结构 ,对稳定分子 6 . 18 %和 6 . 41 % ; 两颗空间生长的磷酯酶 A2 表面的距离分为小于 3 . 4A 、在 3 . 4 , 4 . 5A 间A2 结构的相同部位上也都发现在三个磷脂酶 和大于 4 . 5A 的三个壳层 。图 1 表明 , 位置等 了与磷脂酶 A2 分子相结合的钙离子 。 晶体中效的有序水分子所占的比例随着蛋白质分子表 的有序水结构是我们分析重点 。虽 面的距离而变化 ,距离越远 ,所占的比例越小 。 然三个晶体的衍射分辨率基本上是一样的 ,但 另外 ,在每个距离壳层里 ,空间生长的两个晶体 地面生长的晶体里的有序水分子明显比空间生 的等效水分子所占的比例要比地面晶体中的 长的晶体少 。我们对有序水结构做了统计分析 高 。一般来讲 ,有序水分子是通过氢键作用相 和比较 。图 2 给出三个晶体中有序水分子在三 个距离壳层的数目 。可以看出 ,如果说在可与 联系的 ,我们计算了平均每个水分子所拥有的 氢键数 ,结果发现空间生长的晶体里平均每个 水分子所拥有的氢键数要多一些 。 图 2 磷脂酶 A2 晶体中在不同距离壳层里的有序水 分子数 ( ) SP1 和 SP2 为空间晶体 , G 为地面晶体 Fig. 2 Number of ordered water molecules in shells with diff erent distances in space - gro wn crystals SP1 , SP2 and ground - gro wn crystal G of acidic phos2 图 1 溶菌酶晶体里位置等效的水分子在不同距离壳 phol ipase A2 层中所占的百分率 ( 空间晶体 SP1 和地面晶体 Gd 的结构分别与空间晶体 蛋白质分子形成氢键的第一个壳层里有序水分) SP2 结构比较子的数目相差无几的话 ,在距蛋白质分子较远 Fig. 1 Percentage of equivalent water molecules in shells 的第二和第三个壳层中 ,地面晶体里的有序水 with diff erent distances in lysozyme crystals SP1 分子的数目明显比空间晶体少 ,而且这种差异 and Gd in comparison with lysozyme crystal SP2 随着到蛋白质分子的距离增加而增大 。另外 , 对三个晶体里有序水分子在这三个距离壳层中 A2 晶体结构的比较 对测定的三磷脂酶 形成的氢键的数目统计结果表明 ,地面晶体里 个磷脂酶 A2 结构也进行了比较 。以所有蛋白 的氢键数也少于两个空间晶体 ,而且这一差别 质非氢原子来计算 ,地面结构同两个空间结构 与到蛋白质分子的距离相关 ,距离越远 ,差别也 的原 子 位 置 RM S 偏 差 分 别 为 0 . 0302 nm 和 越明显 。当然 ,这与各壳层中的水分子数相关 , 0 . 0237 nm ,而两个空间结构的 RM S 偏差则为但可能也取决于有序水分子间的联系程度 。后 0 . 0257 nm ; RM S 偏差比较大的残基大都位于 一种可能性已被另一种统计所证实 ,即在空间 磷脂酶 A2 分子结构的表面肽链环区 。考虑到 目前结构测定的精度以及对活动性大的原子准 晶体里 ,特别是在远距离壳层中形成两个以上体中溶剂结构的改进比溶菌酶晶体中明显 ,可 以做这样的推论 : 微重力改进蛋白质晶体质量 氢键的有序水分子数明显地多于地面晶体 。的显示程度可能与蛋白质晶体的溶剂含量相 关 ,溶剂含量较高的蛋白质晶体在微重力下的 改进可能更明显些 。事实上 ,溶菌酶晶体和磷 初步结论 脂酶 A2 晶体的空间结晶实验结果指出 , 在结 晶条件优化足够好的情况下 ,溶剂含量高的磷 正如所预料的那样 , 磷脂酶 A2 的结构测3 脂酶 A2 晶体的质量改进较明显。 定结果同鸡蛋清溶菌酶晶体结构测定结果相一 蛋白质晶体的溶剂结构分析是一个复杂问致 ,表明重力的变化不足以改变蛋白质分子的 构象和与蛋白质分子联系较强的溶剂离子及水 7 题。虽然我们做了两种 蛋 白 质 多 个 晶 体 结分子的结合状况 。然而 ,从上述有序水结构的 构测定和比较 ,并且获得了规律性的初步结论 ,比较可以看出 ,在重力和微重力条件下 ,那些与 但不得不考虑精确分析的干扰因素或不足之 蛋白质分子联系较弱的有序水分子分布状况是 处 。测定误差和结晶条件的差异可能导致或大 有差别的 。不同重力条件下的鸡蛋清溶菌酶晶 或小的溶剂结构分析结果的 假 象 或 错 误 。因 体结构的研究结果表明 ,微重力下生长的晶体 此 ,上述初步结论有待进一步深入研究和确认 。里的有序水结构可能不同于重力场里生长的晶 另一方面 ,鉴于水分子对生命活动的重要性 ,如体的有序水结构 ,微重力有可能增强蛋白质分 果我们的发现能够得到最后的确认 ,将可能对 子间的水桥联系 。磷脂酶 A2 晶体结构测定结 深入进行微重力生命科学研究产生重要影响 。 果进一步证实了这一事实 ,而且这种差异显示 得更明显 。这可能与磷脂酶 A2 晶体中较高的 参考文献溶剂含量相关 ,溶剂含量越高 ,与蛋白质分子联 系较弱的有序水分子就越多 , 这为微重力改进 1 毕汝昌 ,桂璐璐 ,师 珂等. 微重力下的蛋白质晶溶剂结构提供更大的可能性 。 ( ) 体生 长 . 中 国 科 学 , B 辑 , 1993 ; 23 11 : 1153 ,蛋白质晶体的质量主要取决于晶体内三维 1157 有序化程度 ,而水分子为稳定蛋白质晶体内分 Bi RC , Gui LL , Han Q et al . Protein Crystallizatio n 2 in Space. Microgravit y Science and Technology , 子有序排列起着重要作用 。与蛋白质分子结合 () 1994 ;7 2:203,206 不变的水分子是蛋白质结构的有机组成部分 , 3 王耀萍 ,潘冀森 ,毕汝昌等 . 我国第二次空间蛋白质 一般是维持其三维结构和发挥其生物活性所不 ( ) 晶体生长实验. 中国科学 ,C 辑 ,1996 ; 26 2: 121, 126 可缺少的 。有研究结果表明 ,带结合水的蛋白 Gui LL , Niu XT , Bi RC et al . Preliminary crystallo2 4 质分子或其聚合体在形成晶体过程中会发生某 grap hic st udy of t he platelet aggregatio n inhibitor f ro m 些结合水分子的重排 ,即根据晶体特征的分子 t he veno m of Agkist rodo n halys pallas. Chinese Sci Bull ,1992 ;37 :1394,1396 包装方式形成联系蛋白质分子的水桥 。这类由 Pan J S , Niu XT , Gui LL et al . Crystallizatio n under 5 有序水分子构成的水桥对稳定蛋白质晶体中分 Microgravit y of Acidic Phosp holipase A2 f ro m Veno m 子有序排列是相当重要的 。我们的结构测定结 of Agkist rodo n halys Pallas. J Crystal Growt h , 1996 ; 果暗示 ,这些由弱作用维系的水桥在微重力条 168 :227,232 Do ng J , Han Q , Wang YP et al . St ruct ural st udies of 6 件下可能会比地面晶体增多 。这可能是微重力 lysozyme crystals grown in microgravit y and gravit y. 改善蛋白质晶体质量的一个重要因素 ,因为蛋 Science in China , 1997 ; in p ress 白质间水桥的增多进一步稳定了晶体里分子的 Frey M . Water st ruct ure associated wit h p roteins and 7 it s role in crystallizatio n. Acta Cryst ,1994 ; D50 : 663 有序排列 。考虑到溶剂含量高的磷脂酶 A2 晶 ,666