碱性磷酸酶Km值测定

碱性磷酸酶Km值测定 实验七 碱性磷酸酶Km值测定 本实验为实验考核【需在15:00左右结束】 几个需要加以注意的地方:移液管的规范操作、721型分光光度计的规范操作、化学反应充分混匀的重要性。 Km为米氏常数(Michaelis-Constant)，是反应速度等于最大反应速度一半时底物的浓度【注意哟～Km是带单位的哟～，与浓度单位一致，即为: mol/L或mmol/L】 底物浓度与酶促反应速度的关系可用Michaelis-Menten方程式示。 V max[S] V= Km + [S] 底物浓度对反应速度的影响 Michaelis-Menten方程两边取倒数即得: 1 Km+[S] 1 K m 1 1 = 或 = ? + V Vmax[S] V V max [S] V max 此式为直线方程，以不同的底物浓度1,[S]为横坐标，以1,v为纵坐标，并将各点连成一直线，向纵轴方向延长，此线与横轴相交的负截距为–1,K m，由此可以正确求得该酶的Km值。 Lineweaver-Burk作图法 本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度的酶活性，再根据Lineweaver-Burk法作图计算其Km值。实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。 酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和反映了酶活性的大小，进而可以算出酶活性的大小。 【操作】 取8支试管，按下表依次加入试剂(用量:ml): 管 号 1 2 3 4 5 6 7 0.02mol/L底物液 0.05 0.10 0.20 0.40 0.60 0.80 0.00 pH10碳酸缓冲液 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 蒸馏水 0.95 0.90 0.80 0.60 0.40 0.20 1.00 处理 混合后37?水浴，预温5min左右 酶 液 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 处理 加入酶后立即混匀，37?水浴保温。从加入酶液起计时至 下一步加入碱性溶液停止反应，各管反应时间应准确一致，均 为15min 碱性溶液 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 4-氨基安替比林 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 铁氰化钾溶液 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 处理 混匀，室温放置10min后，以7号管为空白液，于510nm 比色，记录各管的光吸收值() A510 A比色结果 510 A510值一份登记到老师的专用实验考核登记表上，一份交老师签名用于撰写实验报告。 实验数据的处理 底物浓度mmol/L 0.50 1.0 2.0 4.0 6.0 8.0 0 1/[S] 2 1 0.5 0.25 0.167 0.125 0 1/A 510 【结果】以底物浓度的倒数1/[S]为横坐标，各管吸光值的倒数1/A510为纵坐标作图【坐标纸、铅笔作图】。根据-1/Km，计算出酶的Km值【带单位的哟～】。 【注意事项】1. 各试剂特别是底物液及酶量的取量要准确。2. 加入酶至加入碱性溶液的时间必须是准确的15min。 思考题:1、为什么不直接利用【S】-V(即底物浓度对反应速度的影响)曲线求Km呢 ? 2、试述km的意义及如何测定酶的Km。 3、反应温度、PH、时间对Km有影响吗, 4、碱性磷酸酶催化哪一类反应，针对不同的底物，其km值相同吗, 4、上网查阅别人做该实验时所得的结果。 5、碱性磷酸酶的临床意义。 6、国际酶学会将酶分成六大类，你认为碱性磷酸酶应划归为哪一类，为什么,