螺旋藻对Cd的生理应答及活体藻细胞摄Cd能力研究

螺旋藻对Cd的生理应答及活体藻细胞摄Cd能力研究 摘 要 透明带(ZP)是包被在卵母细胞外的非细胞结构,是精子与卵细胞识别和 结合的部位。体外抗猪 ZP3(pZP3)血清能与人 ZP 发生交叉反应,因此 pZP3 被用于发展人用避孕疫苗的研究。pZP3 由 pZP3 α 和 pZP3 β 组成,其中 pZP3 α 具 有精子受体活性,在精卵识别中起重要作用,是发展避孕疫苗的一种有效抗原。 巴斯德毕赤酵母作为一种高效的真核蛋白表达体系,具有真核细胞翻译后加工和 修饰功能以及便于分离纯化等优点,ZP 抗原是一种糖蛋白,适当的糖基化修饰 作用可能会增加其免疫效能。为了制备 pZP3 α 蛋白及其抗体供发展避孕疫苗研 究,本研究将编码天然提取 pZP3 α 的 DNA 序列(446-1423)插入至分泌型表达 载体 pPICZ αA上,重组质粒 pPICZ αA-pZP3 α 线性化后通过电穿孔转入毕赤酵母 GS115,经抗生素 Zeocin筛选获得工程菌,在摇瓶中优化目的蛋白表达的 pH值 和甲醇浓度,发酵罐中优化表达时间。在 2L 发酵罐中,优化培养条件下用甲醇 诱导工程菌进行高密度发酵生产 rpZP3 α。分离浓缩发酵上清液,通过螯合铜离 子或镍离子的亲和柱纯化 rpZP3α,用 SDS-PAGE 和 Western blot 进行鉴定,以 Quantity One 软件对 rpZP3 α 进行定量并计算纯度和回收率。用 rpZP3α 免疫 家兔,以 ELISA法和间接免疫荧光法检测抗血清对 rpZP3α 和猪 ZP的抗体反应。 体外精卵结合试验检测抗 rpZP3α 抗体对猪、小鼠精卵结合的影响作用。rpZP3α 免疫小鼠,ELISA 法监测小鼠抗体滴度变化,在首次免疫后第 13 周解剖动物取 出双侧卵巢,制作石蜡切片,作卵巢组织病理学观察。获得了分泌表达 rpZP3α 的工程菌,其高密度发酵产物经分离纯化后获得能与抗 pZP3 抗体反应的 46kD 成分,命名为 rpZP3α,其平均产量为 8mg/L,纯度达 92%,回收率为 63%。 用 其免疫家兔获得抗 rpZP3α 抗血清,ELISA测定显示抗 rpZP3α 抗体与 rpZP3α 蛋 白以及天然 pZP3 蛋白两种抗原反应的强度和趋势基本一致。间接免疫荧光法分 析显示抗 rpZP3α 抗血清能与猪卵透明带反应,产生亮绿荧光。体外精卵结合试 验表明抗 rpZP3α 抗血清能抑制精卵结合,抑制效能呈剂量依赖关系。重组抗原 免疫小鼠的结果显示对小鼠卵巢没有影响,综合上述实验结果,rpZP3 α 在酵母 表达系统实现了分泌表达,该蛋白保留有天然 pZP3 的免疫活性,用其诱发的抗 rpZP3α 抗体在体外可识别猪卵透明带,并且能够抑制猪和小鼠的精卵结合;用 其免疫小鼠没有观察到对卵巢的结构影响。 关键词:重组 pZP3 α 蛋白,巴氏毕赤酵母,分泌表达,蛋白纯化,抗体, 精卵结合,免疫 IAbstract The zona pellucida ZP is a transparent extracellular matrix that surrounds the mammalian oocyte. It plays important roles in the species-specific gamete recognition and blockage of polyspermy during fertilization. Porcine ZP pZP has been used in the study for developing human contraceptive vaccine because its antibody cross-reacts with human ZP. The porcine zona pellucida 3 is composed of pZP3 α and pZP3 β, and the former has been implicated as the primary sperm receptor in porcine fertilization. pZP3 α was considered a potential antigen candidate for the contraceptive vaccine in early study. Pichia pastoris is an efficient eukaryotic expression system with great potentials, and has unexampled advantages in expressing the heterologous proteins and more wide application. To obtain the recombinant pZP3 α rpZP3 α protein and anti- rpZP3 α antibody for the further study of the contraceptive vaccine, the DNA sequence446-1423 encoding purified pZP3 α was inserted into a vector??pPICZ αA. The recombinant plasmid pPICZ αA-pZP3 αwas linearized and then transformed into Pichia pastoris GS115 by electroporation. After screening with Zeocin, rpZP3 α expression of the engineering strains was optimized for pH and methanol concentration in shake flasks, and for inducing time in fermentation. Under these optimized conditions, the engineering strains were induced to produce rpZP3 α in high-density fermentation. The fermentative supernatants were separated and 2+ 2+ concentrated, and then rpZP3 α was purified by Cu or Ni metal affinity column chromatography. The purified rpZP3 α was identified by SDS-PAGE and Western blot, and the quantity, purity and rate of recovery of the rpZP3 α were analyzed by Quantity One software. One male rabbit was immunized with the Cu-NTA-purified rpZP3 αThe antibody responses against rpZP3 α and porcine ZP were detected by ELISA and the indirect immunofluorescent technique IIF. The effect of the anti-rpZP3 α antibody on sperm-egg binding was assayed in of the anti-rpZP3 α antibody in the mouse and porcine in vitro fertilization. Thirteen weeks after immunization with rpZP3α, the mice were killed and the paraffin slices of ovarian serial section was prepared and stained by H.E. Changes of ovarian morphology were observedIIEngineering strains expressing rpZP3 α in secretion was constructed. Under the optimized conditions pH6.0, 1% methanol concentration and 32h inducing time for culturing the engineering strains, a 46kD component named rpZP3 α which could react with anti-pZP3 antibody was purified and the average yield of purified rpZP3 α obtained from fermentative supernatants was 8mg/L. The purity and the rate of recovery were up to 92% and 63 % respectively. The anti-rpZP3 α antiserum was prepared by immunization of a male rabbit with rpZP3 α. This anti-rpZP3 α antiserum could react with rpZP3 α and purified pZP3 in ELISA and bind to porcine zona pellucida which produced bright green fluorescence in the indirect immunofluorescence. In vitro fertilization tests, the inhibiting effects on porcine/mouse sperm-egg binding were increasing with the antiserum concentrationThe result of immunization showed that rpZP3 α had no pathological influence on mice ovarianIn conclusion, rpZP3 α 46kD protein could be successfully expressed in the Pichia pastoris expression system in secretory way. This protein retained the immunogenic activity of natural pZP3. The anti- rpZP3 α could recognize porcine zona pellucida and inhibit porcine/mouse sperm-egg binding. Moreover, there was no abnormal structure observed from the ovarian of the mice immunized with rpZP3 αKey words: recombinant porcine zona pellucida glycoprotein-3 α rpZP3 α, Pichia pastoris, secretory expression, purification, antibody, sperm-egg binding, immunization III目 录 第一部分 前 言1 1.1 卵透明带概述1 1.1.1 卵透明带的生物学特征1 1.1.2 卵透明带避孕疫苗的避孕效能2 1.2 重组卵透明带抗原的研究概况..4 1.2.1 大肠杆菌表达系统..4 1.2.2 酵母表达系统.5 1.2.3 哺乳动物细胞和昆虫细胞表达系统.6 1.2.4 其他表达系统.6 1.3 嵌合肽疫苗和DNA疫苗..7 1.4 本研究的目的和意义9 1.5 本研究的技术路线..10 第二部分 材料与11 2.1 实验材料与仪器11 2.1.1 主要材料与试剂.11 2.1.2 主要仪器设备..13 2.2 重组真核表达质粒pPICZ αA-pZP3 α的构建..15 2.2.1 含有目的基因的pZ58 质粒和载体质粒pPICZ αA的获得16 2.2.2 引物与合成.16 2.2.3 基因扩增.17 2.2.4 构建重组质粒pPICZ αA- pZP3 α.17 2.2.5 重组质粒鉴定..18 2.3 重组质粒pPICZ αA- pZP3 α在毕赤酵母中的表达..20 2.3.1 酵母感受态的制备和转化20 2.3.2 酵母转化子的筛选鉴定.21 2.3.3 目的蛋白的诱导表达及酵母工程菌的筛选22 2.3.4 GS115-pZP3 α工程菌培养条件优化23 2.3.5 高密度发酵生产rpZP3 α抗原..24 2.4 rpZP3 α的分离纯化..24 2.5 纯化后目的蛋白纯度和回收率的计算25 2.6 兔抗rpZP3 α抗体的制备25 2.6.1 抗原乳剂的制备.25 2.6.2 免疫途径和方法.25 2.7 兔抗rpZP3 α抗体的活性鉴定.26 2.7.1 兔抗rpZP3 α抗体与rpZP3 α及天然pZP3 抗原的反应比较..26 2.7.2 间接免疫荧光法检测抗血清与猪卵透明带的反应26 2.8 兔抗rpZP3 α抗体对猪精卵结合的影响27 2.8.1 猪卵子的获取..27 2.8.2 猪精子的获取及处理..27 IV2.8.3 猪精卵结合的观察27 2.9 兔抗rpZP3 α抗体对小鼠精卵结合的影响..27 2.9.1 小鼠卵子的获取.27 2.9.2 小鼠精子的获取及处理.27 2.9.3 小鼠精卵的结合.28 2.10 rpZP3 α免疫对小鼠卵巢功能的影响..28 第三部分 实验结果29 3.1 PCR法获得目的基因片段29 3.2 重组质粒的构建及鉴定29 3.3 重组质粒的序列测定结果..30 3.4 酵母转化重组子的PCR鉴定..30 3.5 诱导表达产物的SDS-PAGE和Western blot分析.31 3.6 GS115-pZP3 α工程菌培养条件的优化.31 3.6.1 不同pH对pZP3 α表达的影响31 3.6.2 不同甲醇浓度对pZP3 α表达的影响.32 3.6.3 不同诱导时间对pZP3 α表达的影响.33 3.7 rpZP3 α的发酵制备和鉴定..34 3.8 纯化后rpZP3 α产量、纯度和回收率的计算.35 3.9 兔抗rpZP3 α抗体与rpZP3 α及天然pZP3 抗原的反应比较.35 3.10 间接免疫荧光法检测抗血清与猪卵透明带的反应36 3.11 兔抗rpZP3 α对猪和小鼠精卵结合的影响.37 3.12 rpZP3 α免疫小鼠对卵巢功能的影响..38 第四部分 讨 论.41 4.1 rpZP3 α抗原在毕赤酵母中的表达与分析..41 4.2 重组GS115- ZP3 α工程菌表达的影响因素分析.44 4.3 rpZP3 α及抗rpZP3 α抗体免疫活性的分析..46 4.4 结 论.47 4.5 工作展望48 References..49 附 录55 附录? 英文缩略词索引.74 在校期间发表的论文75 致 谢76 V 暨南大学硕士学位论文重组猪卵透明带抗原-3α在毕赤酵母中的分泌表达及活性鉴定 第一部分 前 言 根据人口理事会 2006 年发表的综述资料,在未来的半个世纪中,将有 260 亿对新夫妇需要避孕。虽然在发达国家和发展中国家都实现了避孕措施的稳步增 长,但避孕需求在大多数夫妇中仍没有得到满足,非妊娠的数量持续上升。 有必要在满足对现有避孕方法需求的同时发展那些具有使用简便、安全可逆和廉 [1] 价的避孕方法 。用免疫学方法控制人口增长有很多优点,避孕疫苗使用方法简 单,一次接种后避孕的时间长,副作用小,可大规模使用。避孕疫苗用于控制野 生动物的繁殖也有潜在的应用价值。发展避孕疫苗研究的关键是选择合适的靶 标,卵透明带在生殖过程所处的位置和生物学功能使它成为发展孕前型避孕疫苗 的理想靶抗原。猪卵透明带蛋白(pZP)是目前世界研究的昀广泛的卵透明带免 疫原,并且已经成功用于控制马和大象的生育力的研究。研究已经证明pZP包含 ZP1、ZP3α55kD和ZP3β55kD等糖蛋白组分,这些蛋白质的基因均已被克隆 [2-4] 。免疫研究表明猪ZP3α和ZP3 βpZP3αand pZP3 β 蛋白质的多克隆抗体都能在 [5-6] 体外阻断人的精卵结合 ,作为免疫避孕的潜在免疫原,它们一直受到科研人 员的普遍关注。由于用常规生化方法提取pZP3 α和pZP3 β蛋白质步骤繁杂、得率 低,且产物纯度难以保证,所以用基因工程技术表达重组ZP蛋白拓展pZP抗原的 来源极具吸引力。本研究选用毕赤酵母表达系统,研究重组猪卵透明带 -3 αrpZP3 α蛋白的分泌表达情况,为卵透明带避孕疫苗的研究提供重要的材料。 1.1卵透明带概述 1.1.1卵透明带的生物学特征 卵透明带Zona Pellucida是包被在哺乳动物卵子和着床前胚胎外面的细胞 外基质结构。其主要成分是酸性糖蛋白,是卵泡发育过程中由卵母细胞和颗粒细 胞分泌的。其主要功能与精卵的特异性识别有关。人和许多动物包括猪、鼠、兔 等在内的ZP都是由3~5种糖蛋白组成,称为ZPA (又称为ZP1、 ZP2或ZP4)、 ZPB又 称为ZP1或者ZP3α和ZPC(又称为ZP3或者ZP3β)等。这些糖蛋白家族在不同的 种属有不同的分子量,主要是因为糖基化程度不同造成的。ZPA的范围从80kD 到200kD,ZPB的范围从50kD到120kD,ZPC的范围从45kD到110kD。猪的这三 1 暨南大学硕士学位论文重组猪卵透明带抗原-3α在毕赤酵母中的分泌表达及活性鉴定 种糖蛋白称为ZP1/ZP2/ZP4,ZP3α和ZP3β。在ZP的组成上,不同动物之间差异很 大。对猪,糖和蛋白的比例为29%和7l%;小鼠则为70%和30%。研究证明ZP3 是一种O-连接和N-连接寡糖的糖蛋白,由两个在分子量,氨基酸结构和免疫学上 [7-8] 不同的含有乳糖氨基多糖的糖蛋白组成,分别称之为ZP3 α和ZP3β 。早期研究表 明鼠ZP3(mZP3)糖蛋白上O-连接的寡糖参与了精卵识别。Yonezawa等发现在 体外,去掉N-连接寡糖链的pZP3 α可以减少对精卵结合的抑制,而去掉O-连接寡 糖链的pZP3 α则不会减少抑制效应,这表明,与鼠不同,猪ZP3上N-连接的寡糖链 [9-13] 参与了精卵识别 。 由于糖基化的猪ZP3 α和ZP3β的分子量均为55kD,在电泳图谱上发生重叠, 因此未分离的pZP3 α和pZP3 β可统称为pZP3。其中pZP3 α是兔55kD的ZP蛋白的同 源物,具有精子受体活性。而pZP3 β与小鼠ZP3蛋白是同源的。pZP3 β不具精子受 体的功能,然而ZP3α与精子膜的结合可能需要可溶性的ZP3β的存在,ZP3 β对稳 [8] 定ZP3 α的结构可能发挥作用 。ZP的生物学功能涉及精卵识别和结合,顶体反 应acrosome reaction,AR以及防止多精受精等许多重要生殖事件,影响受精过 程的成败。在空间结构上,ZP2和ZP3,交互排列成锁状的异构二聚体,ZP1在其 二级结构上交叉连接,形成一种三维网状结构。功能上ZP3被认为是第一精子受 体,与顶体完整的精子结合,并诱发顶体反应,ZP2是第二精子受体与发生AR [14] 的精子结合,ZP1只起连接ZP2和ZP3的作用 。 1.1.2卵透明带避孕疫苗的避孕效能 由于卵透明带糖蛋白具有抗原性、组织特异性和部分的种间交叉反应性,它 是发展孕前型避孕疫苗的理想靶抗原。一种安全有效的、可逆的避孕疫苗应具有 以下优点:(1)高效性;(2)无副作用;(3)可以远程递送;(4)小剂量;(5) 至少持续 12月的活力并且(6)价格便宜。卵透明带抗原用于免疫避孕的研究始 于 70年代。早期研究中,人们用天然ZP蛋白直接免疫动物观察抗生育效果,并 发现pZP诱发产生的抗体能与其他多种哺乳动物的ZP发生交叉反应,在体外还可 [8] 以抑制仓鼠、小鼠以及大鼠等动物的精卵结合 。后来的研究中用部分纯化或纯 化的卵透明带抗原进行免疫避孕,如在啮齿动物、象、猫、兔、马、鹿、狗以及 [8,15-20] 非人的灵长类动物 等多种物种均获得良好的抗生育效果。但是也有一些研 究中用其他卵透明带抗原主动免疫或被动免疫雌性动物时,会导致暂时的不育, 2 暨南大学硕士学位论文重组猪卵透明带抗原-3α在毕赤酵母中的分泌表达及活性鉴定 如用热溶性ZP长期单一剂量免疫海豹时,对小海豹出生的控制率达 90%,平均 [21] 抗体滴度为 31%的海豹,不会生育,但是在繁殖季就会恢复生育力 。兔 55kD [22] 蛋白与精子受体pZP3 α是同源物,Miller等 用天然猪卵透明带疫苗(pZP)和三 种重组兔卵透明带疫苗(RC55,RC55-RC75a和RC75a-RC75b)同时免疫白尾鹿, 发现既能达到良好的抗生育效果,又不会影响生育能力,只是pZP的免疫避孕效 果更好,说明这三个肽段上包含有避孕的抗原决定簇。Vande等用重组兔 55kD蛋 [23,24] 白免疫猕猴获得的抗体,在体外可抑制精卵集合,而且不会改变卵巢的功能 。 在一些研究中,卵透明带抗原免疫一些非人灵长类动物有时会引起卵巢功能紊乱 等一些不良反应,目前对这些不良反应的看法各一,用ZP作为免疫原引起不良 反应的机制还没有完全清楚,如动物种类,动物个体差异性,佐剂或抗原分子本 身的问等。 Sacco和Yurewicz合作分离得到含精子受体蛋白的ZP3 和其去糖基组 分pZP3 α及pZP3 β。用pZP3 免疫猴抗生育效果明显,但对卵巢功能有一定影响,去 [10] 糖基后用pZP3 α、pZP3 β免疫,已发现对卵巢无影响 。Bagavant等已用ZP3 将之 [25] 引入hCG β,对恒河猴进行实验,完全消除了对卵巢的影响 。以上研究表明 pZP3 α、pZP3 β既可作为异种载体蛋白,同时又有生殖活性,诱发产生的抗体能阻 断精卵结合,在精卵结合期起抗生育作用。 受精过程需要经历精卵之间一系列复杂的相互作用:精子首先必须识别和结 合 中的受体,然后穿透 ,同卵子质膜融合。完整精子进入卵细胞浆后,精 ZP ZP 核DNA被解聚,与卵母细胞组蛋白一起被重新包装后形成雄原核。现今的研究 [26] 亦表明卵透明带蛋白是高度保守性的 。但是,已有研究发现三种 糖蛋白都 pZP 可能引起许多种哺乳动物免疫避孕。ZP具体的作用机制至今还不是很清楚,但 是对免疫避孕,主要的目标是阻断ZP蛋白糖基的多精子受精。就小鼠ZP2和ZP3 而言,它们被局部脱糖或水,失去精子受体和诱导功能,同时由于蛋白基团变化, 引起ZP3 溶解性和空间立体结构变化,从而阻止了其余精子的钻附和穿透,ZP3 [27] 成为阻挡多精子受精的屏障 。免疫避孕造成的不育是一种或多种不同机制的结 果。多克隆抗pZP抗体可与卵子表面的精子受体表位直接结合,或与精子受体附 [28] 近的位点结合,因而通过空间阻碍阻断了精卵结合 。这种机制的解释据说可以 [29] 追溯到 早期 。抗 抗体可能是通过阻断诱导精子发生顶体反应。如果 1970s pZP 顶体反应的位点全部被特异IgG占据的话通过空间阻碍,那么就不能诱发顶体 3 暨南大学硕士学位论文重组猪卵透明带抗原-3α在毕赤酵母中的分泌表达及活性鉴定 反应。在生育中对这一步的阻断,造成没有穿透卵透明带的酶释放,进而导致精 子不能结合。此外,有些研究中卵透明带抗原免疫引起卵巢的不良反应,也可能 是导致不孕的一个原因。1.2重组卵透明带抗原的研究概况 目前,用于免疫动物观察抗生育效果的pZP3,大多从天然卵巢提取获得, 其缺点一方面是卵巢来源有限,不能满足大量制备抗原的需要;另一方面从卵巢 分离纯化难以获得高纯度的抗原成分,所以研究重组ZP抗原成为必然。已经用 于表达重组卵透明带抗原研究的表达系统主要有细菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动 [30-31] [32-33] 物细胞 和病毒 等。包括重组兔 55kD 蛋白、猴ZP1、猴ZP2、猴ZP3、 [34] 人ZP1、人ZP2、人ZP3、猪ZP3 等 多种重组ZP蛋白组分已用于实验动物免疫 研究,评价其抗生育作用。 1.2.1大肠杆菌表达系统 通过原核系统直接表达ZP蛋白组分,并研究其抗生育效果。与其他表达系 统相比,大肠杆菌系统具有遗传背景清楚,操作方便,易于大规模发酵生产等优 点。有多种重组卵透明带蛋白已在大肠杆菌系统中获得成功表达。其中,徐万祥 等曾在大肠杆菌中分泌表达pZP3 α,获得能与抗pZP抗体发生特异反应的61kD组 [35] 分,该组分比pZP3 α核心蛋白的理论值(37kD)大 。Gahlay等克隆了bonnet猴 的去除信号肽和跨膜区序列的bmZPA,bmZPB,bmZPC,在大肠杆菌中表达了这些 重组蛋白。用2mol/L尿素和高pHpH12从包涵体中纯化出重组蛋白,再用氧化的 谷胱甘肽使其复性,间接免疫荧光检测重组ZP蛋白和bonnet猴精子的结合情况, [36] 发现三种重组蛋白分别能够与精子的不同部位结合 。其他在大肠杆菌系统获得 [37] [38] [39] [40] 表达的ZP蛋白还有pZP3 β ,pZP4 ,人ZP3a和b片段 ,狗 ZP3 等。长期 以来,大肠杆菌一直被用作表达外源基因的宿主菌,而且已经成功表达了多种外 源蛋白。但是这一系统本身也存在着若干缺陷:? 缺少真核生物的蛋白翻译后 修饰和加工,如剪切、糖基化和形成二硫键等;? 表达的蛋白多以包涵体形式 存在,需要经过复杂的复性才能恢复构象和活性。? 背景杂蛋白很多,纯化比 较麻烦;? 表达量一般不是很高。为了克服大肠杆菌表达系统的缺陷,需进一 步从表达量、表达活性、实验步骤的简化和成本控制4个方面深入研究。 4 暨南大学硕士学位论文重组猪卵透明带抗原-3α在毕赤酵母中的分泌表达及活性鉴定 1.2.2酵母表达系统 为了克服大肠杆菌表达系统的缺陷,1979年人们发展了酵母细胞表达系统。 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)因具有繁殖速度快,能高密度发酵,可以 进行蛋白翻译后的修饰,加工等优点而成为昀初发展起来的酵母表达系统;但此 系统也有其局限性,如缺乏强有力的启动子,分泌效率差,表达菌株不够稳定, 表达质粒易于丢失等。鉴于此,人们又发展了新一代的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统。目前毕赤酵母表达系统在国内外已有非常广泛的应用,许 多难于用其他系统表达的蛋白在这一系统中得到成功表达,且能获得较高的表达 量。巴斯德毕赤酵母表达系统是一类能唯一用甲醇作为碳源和能量来源的酵母 菌。和其他真核、原核表达系统相比,它理论上具有几个独特的优点: ? 高表 达。它生长速度极快,而且能利用强有力的乙醇氧化酶AOX1基因启动子,严 格调控外源蛋白的表达,其表达产量约为细菌、昆虫或哺乳动物细胞等表达系统 产量的l0~100倍。 ? 高稳定。该系统的载体为整合型载体,它携带的外源目的 基因随着染色体的复制而复制,进行整合型表达,所以一般不会出现外源基因随 生长繁殖而丢失的现象。 ? 高分泌。它可利用多种信号引导外源基因分泌。 ? 表 达蛋白的后加工。毕赤酵母采用胞外分泌表达方式时,可对外源蛋白进行翻译后 加工,使表达的蛋白更接近于天然蛋白的构象和活性。 ? 高密度发酵培养。毕 赤酵母在甲醇诱导下连续发酵培养表达水平稳定,易于放大培养,且培养成本低。 ? 产物易纯化。毕赤酵母自身分泌的蛋白非常少,十分有利于纯化。? 糖基化 [41] 程度低。毕赤酵母中加到翻译蛋白上的糖链长度与酿酒酵母相比短得多 。 Harris等人比较了人重组ZP蛋白在大肠杆菌,毕赤酵母,昆虫细胞和中国仓 鼠细胞(CHO细胞)中的表达。仅在CHO细胞中表达出可溶性透明带蛋白外,在 其他三种系统中,卵透明带蛋白积累在细胞内,且通过破碎细胞获得的透明带蛋白 [30] 只能溶于 6mol/L尿素溶液中,这给分离纯化带来很大的困难 。近年本实验室 另一研究小组通过改进引物设计和实验技术,在巴氏毕赤酵母成功表达出了可分 [42-43] 泌并溶于培养液的人重组ZP3蛋白,所得蛋白能与兔抗猪ZP3 抗体反应 。鼠 [44] ZP3 也在毕赤酵母中实现了分泌表达 。但重组猪卵透明带蛋白ZP3 α在酵母系 统的表达还未见报道。由于毕赤酵母含有如信号肽的加工,蛋白质折叠,二硫键 的形成和O-及N-型糖基化等典型的高等真核生物的翻译后修饰功能,用于表达重 5 暨南大学硕士学位论文重组猪卵透明带抗原-3α在毕赤酵母中的分泌表达及活性鉴定 组卵透明带抗原可能会增强抗原的免疫效能,因此它可能是表达重组卵透明带抗 原的一个有用的真核表达体系。 1.2.3哺乳动物细胞和昆虫细胞表达系统哺乳动物细胞是表达具有天然活性蛋白的昀佳宿主。其优势在于能正确有 效地识别真核蛋白的合成、加工和分泌的信号,识别和去除基因中的内含子,再 经剪切加工成为成熟的mRNA,能准确地完成糖基化、磷酸化,形成链内和链间 二硫键以及蛋白水解等翻译后加工过程。哺乳动物细胞易被重组的DNA转染, 经过筛选可得到转化的细胞,具有遗传稳定性和可重复性,表达的产物分泌到培 [45] 养基中易于纯化 。 Duin首先在中国仓鼠卵巢细胞CHO中表达了人ZP3(rhZP3) 蛋白,获得了55-60kD大小的rhZP3,在体外可诱发精子顶体反应,促进人精子和 [46] 卵细胞的结合 。用在CHO细胞中表达的rhZP3免疫猕猴,初次免疫产生1:10000 [47] 的抗体滴度水平,一些猴强化免疫后滴度达1:100000 。Tsubamoto等在293T, CHO-K1和LLC-PK1三种哺乳动物细胞中同时表达了猪ZP1(pZP1),产生了高 度糖基化的重组蛋白,但单独的pZP1只在细胞的胞质中表达。随后,他们将pZP1 [31] 的cDNA同IgG1重链连接,生产出一种能够分泌表达的融合蛋白 。其他在哺乳 动物细胞中表达的卵透明带蛋白有Cynomolgus猴ZPA、ZPB、ZPC,以及狒狒的 [48] ZPB基因 等。 昆虫细胞表达系统一般使用病毒作为载体感染昆虫细胞,使外源蛋白得以表 达。昆虫细胞系统有许多哺乳动物细胞表达系统的优点,且具有良好的翻译后加 工体系,许多在大肠杆菌中得不到活性表达的蛋白,在该系统中得到了活性表达, [49] 且产量明显高于哺乳动物细胞 。目前在昆虫细胞中表达的卵透明带蛋白不多, 除人ZP外,Yonezawa等在杆状病毒Sf9昆虫细胞表达系统中分泌表达了猪ZP,结 果发现,表达的重组pZPB不能和猪精子结合,却能和牛精子进行弱的结合,推 [50] 测可能是表达的蛋白糖基化形式不同所造成的 。 在哺乳动物细胞和昆虫细胞表达系统虽可获得分泌性表达的重组蛋白,但细胞 培养系统对培养环境十分敏感,如营养、供氧、病毒感染、毒性代谢物的积累等, 培养成本较高。 1.2.4其他表达系统 Mackenzie等在重组粘液瘤病毒中表达了兔ZP2、ZP3,发现此重组病毒表达 6 暨南大学硕士学位论文重组猪卵透明带抗原-3α在毕赤酵母中的分泌表达及活性鉴定 的兔ZP2能够免疫兔产生抗体,但它对兔的生育能力和卵巢生理都没有影响,而 表达的重组兔ZP3可使70%的兔不育,而其生育力与抗体滴度变化没有明显联 [51] 系,只是伴随一个短暂的炎症反应期 。而Hardy等用牛痘病毒-哺乳动物细胞 表达系统表达的鼠ZP3vmZP3或用杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达的鼠ZP3 bmZP3,配合弗氏佐剂免疫小鼠,大多数小鼠产生的抗体与mZP3抗原反应, vmZP3免疫的小鼠的生育力和产仔数减少至对照的25%和10%,而bmZP3免疫的 [32] 小鼠的生育力和产仔数不变 。把表达小鼠ZP3基因的小鼠巨细胞病毒cytome- [33] -galovirus接种于田间野鼠进行免疫避孕几乎导致小鼠完全不育 。病毒表达系 统,或以病毒为载体的细胞表达系统具有高效表达外源基因的能力,但存在的一 些问题如病毒的基因组学研究相对薄弱,有关病毒晚期基因的高表达和调控机制 等还不十分清楚,表达产物的纯化比较困难,多元表达等方面的技术还不够成熟 [52] 等,均有待进一步解决 。 1.3嵌合肽疫苗和 DNA疫苗 大量研究表明,无论用天然ZP蛋白还是重组ZP蛋白,ZP糖蛋白还是ZP蛋白 免疫动物都产生了较好的抗生育作用。有很多学者针对小鼠模型中出现的自身免 疫性疾病提出卵巢功能紊乱的产生可能与体内激发的CTL免疫反应有关,当用同 源性较大的ZP免疫时,在免疫原上存在着一些表位,被抗原提呈细胞提呈后, 引起了针对动物体自身的T细胞反应而发生了自身免疫性疾病,从而造成卵巢功 能紊乱。有研究表明,用卵透明带抗原B细胞表位和通用的外源T细胞表位构成 [53] 的嵌合肽免疫小鼠对卵巢的结构和功能则无影响 。基于这种思路,目前很多研 究都集中在分析ZP相关B细胞表位的分布上,在这个基础上设计去除卵巢源的T 细胞表位的合成多肽抗生育疫苗。人们一直在致力于寻找ZP永久性的表位包括 [54] 用合成的多肽或重组蛋白和用单克隆抗体作分子探针等 。 Yurewicz等报道猪的 [55] 合成多肽ZP3α残基 8-18的抗体可以阻断精子与ZP的结合 。 Hall等合成了ZP3 α 的 5种多肽,其中 272-283和 319-330这两种多肽产生的抗体可以有效地阻断精子 与ZP的相互作用,而且这两种抗血清与人卵子有交叉反应,提示猪的ZP3是一种 [56] 有效的抗生育靶位点 。Bagavant等设计了一种嵌合多肽,由一个已知的疟原虫 孢子蛋白的辅助T细胞表位和一个天然的人ZP3 的细胞表位相联,用这种嵌合蛋 白免疫恒河猴诱发产生抗ZP3的抗体,未检测到针对hZP3 的T细胞应答。抗血清 7 暨南大学硕士学位论文重组猪卵透明带抗原-3α在毕赤酵母中的分泌表达及活性鉴定 [57] 与人及恒河猴的ZP都有反应,可以抑制精子与卵的结合 。Sun等研究也表明单 靠抗ZP抗体不能引起卵巢自身免疫疾病,它需要一个针对ZP抗原的T细胞应答, 一个安全的ZP疫苗既能产生抗ZP抗体,又不引发抗ZP的T细胞应答。所以将一个 去除了T细胞表位保留B细胞表位的ZP多肽与异源的细胞表位相联后者是为了 刺激T细胞应答来帮助B细胞产生抗ZP抗体,这样可以避免自身卵巢免疫疾病的 [58] 产生 。 20世纪90年代DNA疫苗问世,ZP3 DNA疫苗的研究很快成为热点。DNA疫 苗是把一段外源编码基因插入质粒或病毒的合适位点,然后把重组质粒或病毒注 入机体,使插入的外源基因能够在机体内表达,从而同时诱发机体的体液免疫和 细胞免疫反应。由于重组质粒在机体内利用宿主的酶系进行转录和翻译,因此所 产生的蛋白与自然条件下的蛋白在构型和翻译后修饰、加工等方面昀为接近。 Jackson等将小鼠ZP3 cDNA(30-1294)克隆到Ectromelia病毒中,后者是一种能 在小鼠体内致瘤的病毒。二者重组构建成的重组病毒感染雌性Bal B/C小鼠后,可 以激起小鼠体内高滴度的抗体反应,产生的抗体与小鼠卵巢ZP3结合,使小鼠生 [59] 育力下降。但同时出现了卵巢功能的损害 。董志炜等制备口服pVAX1-pZP3 α 壳聚糖纳米微粒免疫小鼠能诱发生殖道黏膜免疫反应,发挥抗生育作用,对卵巢 [60] 组织结构没有影响 。DNA疫苗通过黏膜免疫的途径免疫小鼠,可能既会减少 免疫对卵巢功能的影响,又会达到避孕效果。黏膜免疫是克服卵透明带抗原免疫 引起卵巢功能紊乱的一种值得深入研究的方法。 8 暨南大学硕士学位论文重组猪卵透明带抗原-3α在毕赤酵母中的分泌表达及活性鉴定 1.4本研究的目的和意义 卵透明带(zona pellucida,ZP)是包被在卵母细胞外的非细胞结构,其主要 功能与精卵的特异性识别有关。由于卵透明带糖蛋白具有抗原性和组织特异性, [34] 进而成为发展孕前型避孕疫苗的理想靶抗原 。研究工作证明抗猪卵透明带蛋白 [61] pZP3 血清能与人卵透明带发生交叉反应 ,因此猪卵透明带蛋白pZP3 被用于发 展人用避孕疫苗的研究。pZP3 由pZP3 α和pZP3 β组成,其中pZP3 α具有精子受体 [7] 活性,在精卵识别中起重要作用,是发展避孕疫苗的一种有效抗原 。 进一步 的研究和将来的应用都需要获得大量的pZP3 α抗原,而从卵巢分离纯化难以获得 大量高纯度抗原成分。基因重组抗原的表达是一种解决的办法。目前对pZP3 α表 达系统的研究,仅徐万祥等曾在大肠杆菌表达系统中表达pZP3 α,得到非糖基化 [35] [62] pZP3 α ,而有研究表明非糖基化的猪ZP3比天然蛋白的免疫能力低 。卵透明 带蛋白是一种糖蛋白,适当的糖基化作用可能会增加卵透明带抗原的免疫效能, 毕赤酵母表达系统作为一种高效的真核蛋白表达体系,能够对外源蛋白进行适当 的糖基化,而且毕赤酵母在诱导阶段自身分泌蛋白少,在分离纯化方面具有很强 的优势。本研究中选用分泌型表达载体pPICZ αA构建重组pZP3 α真核表达质粒, 利用毕赤酵母这一简单、快速、经济的表达系统来大量生产重组pZP3 α蛋白 (rpZP3α),并免疫家兔获得抗rpZP3α抗体,为深入进行避孕疫苗研究和将来实 际应用提供了重要的材料来源。本研究的主要内容有三个方面:? 构建rpZP3α 高表达酵母工程菌;? 探讨重组GS115-pZP3 α工程菌高密度发酵的优化表达条 件;? 检测酵母体系发酵制备的rpZP3α及其抗体的免疫学活性。 9 暨南大学硕士学位论文重组猪卵透明带抗原-3α在毕赤酵母中的分泌表达及活性鉴定 1.5本研究的技术路线 引物的设计 目的基因片段 pZP3 α(bp446-1423)的获得 重组质粒 pPICZ αA-pZP3 α 的构建 转化毕赤酵母 GS115 抗生素筛选高表达稳定工程菌 工程菌表达 pZP3 α 条件的优化 高密度发酵生产目的蛋白 pZP3 α 发酵上清超滤浓缩 亲和层析柱分离纯化 pZP3 α 免疫小鼠 免疫新西兰白兔制备抗 rpZP3 α抗体 抗体反应检测间接免疫荧光法检测抗 rpZP3 α抗体活性 卵巢结构变化观察 抗体对猪、小鼠体外精卵结合的影响10 暨南大学硕士学位论文重组猪卵透明带抗原-3α在毕赤酵母中的分泌表达及活性鉴定 第二部分 材料与方法 2.1实验材料与仪器 2.1.1主要材料与试剂 1.主要材料 (1)质粒与细胞 目的基因质粒 pZ58由美国 Zonagen公司 Jeffrey D. Harris 博士馈赠; 大肠杆菌 Top10由本实验室保存; 载体 pPICZ αA和菌种 GS115购自 Invitrogen公司; 猪精子购自广州市良种厂; 新鲜猪卵巢从广州市肉联厂采集。 (2)实验动物 新西兰雄兔,购自中山医学院实验动物中心,年龄 6个月,体重 2-3公斤; 昆明系小白鼠,购自南方医科大学实验动物中心,年龄 6-8周,体重 22-25g。 (3)蛋白纯化系统 G25 脱盐柱和Chelating Sepharose Fast Flow柱为GE公司产品,后者由本实 2+ 2+ 验室用Cu 或Ni 螯合。11 暨南大学硕士学位论文重组猪卵透明带抗原-3α在毕赤酵母中的分泌表达及活性鉴定 2.主要试剂 Premix TaqDNA聚合酶大连宝生物工程有限公司 限制性内切酶 EcoR I、 Sal I 和 Sac I 大连宝生物工程有限公司 T4 DNA连接酶大连宝生物工程有限公司 1Kb DNA marker北京鼎国生物技术有限公司 氨苄青霉素Amplicillin北京鼎国生物技术有限公司 DNA凝胶回收纯化试剂盒 上海博亚生物技术有限公司 Fastagen质粒快速提取试剂盒 上海博亚生物技术有限公司 Yeast extract、Peptone和Tryptone OXID产品 YNB Sigma 产品 BiotinFARCO ZeocinInvitrogen公司 丙烯酰胺、亚甲基双丙烯酰胺 Bio-Rad公司SDS SERVA公司 过硫酸铵、TEMEDBio-Rad 公司 琼脂粉 广州化学试剂玻璃仪器厂 硝酸纤维素膜Bio-Rad 公司 Protein Maker 上海生物化学研究所产品 BSA 北京鼎国生物技术有限公司 DABSigma 产品 辣根过氧化物酶标记的 A 蛋白HRPSigma 产品 邻苯二胺(OPD) Sigma 产品 异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔IgG 北京鼎国生物技术有限公司 Freund’s 完全佐剂/不完全佐剂 北京鼎国生物技术有限公司 透明质酸酶 Sigma 产品 孕马血清性腺激素(PMSG) 暨南大学华侨医院 绒毛膜促性腺激素(hCG)暨南大学华侨医院 兔抗猪 ZP3蛋白抗血清和猪 ZP3蛋白由本实验室制备 其余试剂均为分析纯和优级纯。 12 暨南大学硕士学位论文重组猪卵透明带抗原-3α在毕赤酵母中的分泌表达及活性鉴定 2.1.2主要仪器设备 2197 POWER 电泳仪LKB Bromma 凝胶成像分析仪 BIO-RAD 3000Xi 型电泳仪 BIO-RAD QBT 干浴器Grant InstrumentsCambridge Ltd 2 TGL-16B高速台式离心机 上海安亭科学仪器厂 Centrifuge5415D Effendorf Sorvall RC-5B冷冻超速离心机Dupont Instruments 3K-30 台式高速冷冻离心机 Sigma Microfuge Lite Centrifuge BECKMAN 320 pH Meter METTLER TOLEDO 液相蛋白纯化系统(AKTA FPLC) Am ersham Pharmacia Biotech 2023 MINICOLDLAB层析柜 LKB Bromma ELx 800 Universal Microplat