【doc】 提高类球红细菌5-氨基乙酰丙酸产率的措施

【doc】 提高类球红细菌5-氨基乙酰丙酸产率的措施 提高类球红细菌5-氨基乙酰丙酸产率的措 施 第35卷第4期 2005年12月 工业微生物 IndustrialMicrobiology V01.35No.4 Dec.2005 提高类球红细菌5一氨基乙酰丙酸产率的措施 谢秀祯一,黄循吟,韩向红 (1.华南理工大学生物科学与学院,广州510640;2.海南师范大学生物系,海口571158) 摘要5一氨基乙酰丙酸是四吡咯化合物生物合成的必需前体物,它作为一种无公害的绿色除 草剂,杀虫剂,植物生长促进剂以及治疗癌症的药物而受到广泛的关注.文章综述了类球红细茵 5一氨基乙酰丙酸的发酵生产现状以及提高其发酵产率的策略与措施. 关键词:5氨基乙酰丙酸;类球红细茵;产率;措施 5一氨基乙酰丙酸(5一aminolevulinicacid,ALA) 是四吡咯化合物,如卟啉,血红素,叶绿素和维生素 B,:生物合成的前体物质,是调节四吡咯生物合成的 关键中间物.ALA对人畜无毒性,在环境中容易被 生物降解而无残留,在农业,医药和生物技术上有广 阔的应用前景,因而受到国内外研究者和产业界的 广泛关注-lJ.然而,由于ALA的化学合成需要经过 多步复杂反应,因此直至最近,它的大量生产还非常 困难.来源少,成本高已成为ALA作为商品(特别 是作为农用化学品)广泛应用的制约因素. 日本广岛大学工学部Sa~ki教授领导的研究小 组,根据紫色非硫光合细菌富含维生素B类胡萝 卜素等生理活性物质的特点,率先进行了光合细菌 产ALA的研究.他们在高产菌株选育,底物选择, ALA脱水酶抑制剂和ALA发酵条件的优化等方面 作了详尽的研究.结果发现光合细菌可以大量合成 ALA并分泌到细胞外,其中类球红细菌 (Rhodobactersphaeroides)的ALA产量较高J.此 后,不少研究者陆续对不同菌株的ALA合成酶, ALA脱水酶抑制剂,ALA发酵条件以及代谢调控 进行了研究_3J.从目前的研究结果来看,在ALA 的工业化生产中,仍然存在产率低的问题.因此,如 何提高类球红细菌的ALA产率是实现其产业化必 须解决的关键问题. 基金项目:海南省教育厅高等学校科研资助项目(Hjkj200412) 作者简介谢秀祯(1960,),男,海南儋州人,教授,在读博士生. E—mail:xiexiuzhen@sina.tom 1利用类球红细菌生产5.氨基乙酰丙酸的 研究概况 1990年Sasaki等]首次利用废水厌氧消化器 的出水(含乙酸,丙酸,丁酸等有机酸)为原料,补充 甘氨酸作氮源,接种类球红细菌后,通过间歇地在培 养液中三次添加乙酰丙酸(LA),结果在厌氧光照 (5000Lux)的条件下,胞外ALA的产量达到4.2 mmol/L.后来,他们改用琥珀酸和甘氨酸作为底 物,通过添加LA,使类球红细菌的ALA积累量提高 到16mmol/L,这一ALA产率已经达到了可商业化 应用的水平J.除了利用有机酸作碳源外,Watan— abe等n.还利用葡萄糖为碳源,以类球红细菌突变 株CR520进行ALA的生产,结果也获得了较高的 产率(14.3mmol/L). 利用类球红细菌生产ALA不仅工艺简单,产率 高,而且能以廉价的有机废水为底物,具有工业化生 产潜力,但也存在一个明显的不足之处,就是需要光 照.光照培养不仅要求有一个特殊的生物反应器系 统,而且大规模生产的成本比较高.为了克服这个 不足,Tanaka等1]和Nishikawa等?先后开发出利 用类球红细菌突变菌株进行ALA好氧生产的工艺. 1998年Kamiyama等n终于利用好氧黑暗培养系 统实现了ALA的商业化生产,ALA的产率高达 27.5mmol/L. 在好氧培养条件下,氧是细胞生长(ATP形成) ?-—— 45?-—— 第4期工业微生物第35卷 所必需的,然而氧会钝化ALA合成酶,因此氧的供 应对AL的生产影响极大.为了解决这个问题, Watanabe等.’建立了一种二段生产工艺,即好氧 (供细胞生长)和微氧(供AL生产)相结合的培养 系统.ALA好氧生产的典型发酵条件如下:类球红 细菌突变株CR520在好氧条件下(溶解氧为0.1, 7.50mg/L)培养48h后,转移到微氧条件下(氧化还 原电位控制在一30,0mV之间,通过通气和搅拌来 调节)培养.发酵96h后,ALA的产量超过 12mmol/L,而氧化还原电位控制在一17mV(平均 值)时,AL的产量达到最大值(14.3mmol/L).随 后,Kamiyama等u到利用这一工艺,用类球红细菌突 变株CR720实现了ALA的工业化生产. 除了类球红细菌突变株外,国外研究者还将代 谢工程和基因工程技术构建的工程菌株应用于 AL的生产,并已取得了初步成效.Mariet等u将 来自类球红细菌的hemA基因重组到pUC18/19载 体系统后,导人大肠杆菌中,获得重组菌株.用完整 的重组菌细胞进行发酵,可获得2.25mmol/LALA, 而用重组菌的提取物将琥珀酸,甘氨酸和ATP进行 转化,可获得高达22mmol/L的ALA.Choi等ll则 用来自大豆慢生根瘤菌Bradyrhizobiumjaponicunz 的hemA基因转化大肠杆菌,结果使得ALA合成酶 在大肠杆菌中实现了超量表达,培养14h后,培养液 中ALA的产量达到了20mmol/L. CH3 o-:-c--SCoA 乙酰辅酶A CH3 CH2 O=C—SCoA 丙酰辅酶A 2提高5.氨基乙酰丙酸产率的策略及措施 从目前的情况来看,ALA的工业化生产首先必 须解决产率低和成本高的问题,尤其是产率低的问 题.虽然在微生物中,R.sphaeroides的ALA产率 是较高的,但野生型的R.sphaeroides在琥珀酸和 甘氨酸培养基中培养,ALA产率也不超过2mmol/ L,即使采用添加L来抑制ALA脱水酶的活性, ALA的产率也只有4.2mmol/L.ALA作为除草剂 使用时,要求其有效浓度在3,5mmol/L左右,可见 发酵液要经过一定的浓缩才能使用;如果用作药物, 则必须对ALA进行分离纯化,而发酵液中AL浓 度过低,必然会造成分离提取的费用过高.要提高 AL的产率,必须根据其代谢途径和调控机理以及 生产菌株的生理特性,制订出相应的战略和措施. 类球红细菌主要是通过所谓的四碳途径(c-4 pathway,也称为Sheminpathway)来合成ALA.它 是在ALA合成酶的催化下由琥珀酰CoA和甘氨酸 缩合生成ALA.琥珀酰CoA由TCA循环提供,也 可由丙酰CoA通过甲基丙二酰CoA途径来合成. ALA合成酶(ALAS)催化琥珀酰CoA和甘氨酸的 缩合反应,它是四吡咯生物合成的限速酶.该酶的 合成经由hemA基因的反馈调节进行高度的自我调 节’(见图1). CH2NH2?Hf .. H2洲 :c?—:cN H1f吡咯环胆色素原 COOH乙南酸(LA)(PBG) 5-氨基乙酰丙酸I (ALA’l 原卟啉原?+—一粪卟啉原III+—一尿卟啉原III 甲基丙\M甲基丙二酰辅酶A’ 血红素叶绿素 (亚铁原卟啉) 粪卟啉钴胺素 (维生素B12) 图l类球红细菌5一氨基乙酰丙酸和四吡咯化合物生物合成途径及 其调控’] 在Rsphaeroides中5一氨基乙酰丙酸作为一种着生物的生长,发育和 繁殖.由于细胞对初级代谢 初级代谢产物,与其他初级代谢产物一样,直接支撑途径存在极大的 依赖性,为这些途径编码的基因大 一 46— 第4期谢秀祯,等:提高类球红细菌5一氨基乙酰丙酸产率的措施第 35卷 多属于”持家基因”(house—keepinggene)家族,因此 阻断甚至仅仅减缓原有途径的代谢流便会严重干扰 细胞正常的生理生化过程,直至产生致死效应.例 如AL是四吡咯化合物,如卟啉,血红素,叶绿素和 维生素B,:生物合成的前体物质,是调节四吡咯生物 合成的关键中间物,如果想通过阻断ALA的进一 代谢来提高ALA的产量,必然会影响到卟啉,细菌 叶绿素和维生素B:的合成,从而导致有氧培养条件 下能量代谢受阻或光照培养条件下光合作用受阻或 其他代谢紊乱,最终必然导致细胞生长不良甚至死 亡.这一特征就决定了提高ALA产率的途径,不管 是育种还是发酵工艺的优化,都必须采用尽量”开 源”,适当”节流”战略,尽可能避免实施途径阻断和 基因敲除的”减法战略”操作. 2.1高产菌株的选育 优良菌种是微生物发酵工业之本,而获得优良 菌种的最基本途径是从自然界中分离筛选.但从自 然界筛选到的野生型菌株,由于长时间生长在非最 适条件下,大多产率都比较低;另外,这些菌种的生 产性能如原料利用率,需氧量,抗噬菌体能力,代谢 产物的组成配比等一般也是不理想的,因此必须经 过改良才能用于工业生产.就ALA产生菌的选育 和改良来说,目前主要采用人工诱变技术和基因工 程(代谢工程)技术. 2.1.1诱变育种 根据ALA的代谢途径及其调控机理,可利用人 工诱变技术对野生型R.sphaeroides菌株进行改 良,其目标是: (1)提高ALA合成酶的活性,降低ALA脱水酶 的活性.由于在四碳途径中,5一ALA合成酶 (ALAS)是ALA合成的限速酶,它的合成受原卟啉 和铁卟啉的反馈调节.通过诱变选育对原卟啉和铁 卟啉脱敏的突变株,将有利于提高ALA的产量.另 外,ALA脱水酶是ALA进一步代谢的第一个酶,筛 选该酶的渗漏突变株,既可保障四吡咯化合物的本 底合成,又能解除原卟啉和铁卟啉对ALA合成酶的 反馈抑制,同时也减少ALA的消耗,从而能最大程 度地提高ALA的产量. (2)提高菌种对丙酸的利用率.在四碳途径中, ALA合成的底物之一是琥珀酰辅酶A,它有两条来 源,一是由TCA循环提供,二是由丙酰CoA通过甲 基丙二酰CoA途径来合成.前人的研究已经证 明_8’m’J,R.sphaeroides可以利用葡萄糖,乙酸,丙 酸,丁酸作为碳源高产地合成ALA,这说明在R. sphaeroid.es中,同时具有这两条来源.由于从TCA 循环分流琥珀酰辅酶A将影响到细胞的产能效率, 而丙酸是有机废水厌氧消化后的主要产物之一,另 外,丙酸还是一种良好的ALA脱水酶抑制剂,因此 选育对丙酸利用率高的菌株,可望利用廉价的有机 废水生产ALA,同时减少LA等抑制剂的使用量,有 利于降低ALA的生产成本. (3)选育能在有氧黑暗条件下高产ALA的菌 株.尽管R.sphaeroides能调节自身的代谢途径来 适应各种不同的环境条件,它在厌氧光照条件下和 有氧黑暗条件下都能生长,但ALA的生产要求必须 有光照,而光反应器运行成本高,需要有特殊的系统 来实现有效的照射.另外,在光照条件下进行高密 度培养也不容易】引.因此,选育有氧黑暗条件下的 ALA高产菌株,将意味着能降低发酵工艺的成本. 这对于大规模的工业化生产来说,无疑具有很大的 吸引力. (4)选育能在微酸性条件下生长的ALA高产菌 株.R.sphaeroides的最适生长的pH为7.0,8.5, 当pH低于6.5时,其生长会受到强烈的抑制,这样 一 种严格的pH控制系统在ALA的实际生产中是 难以做到的.但另一方面ALA在碱性环境中很不 稳定,例如在pH7.5的条件下再多培养48h,细胞产 生的ALA将有60%消失(这包括化学分解),而在 pH6.5的条件下,ALA的消失不足20%.如果选育 到能在pH6.5以下正常生长的ALA高产菌株,则 这一矛盾就迎刃而解. 在诱变育种方面,Kamiyama等.的工作最为 突出.他们以野生型R.sphaeroides作为出发菌 株,用甲基硝基亚硝基胍进行诱变,在加有酵母提取 物,内含ALA营养缺陷型大肠杆菌的低熔点琼脂糖 凝胶上筛选ALA产生菌,然后在96孔微量滴定板 上用Ehrlich反应测定ALA的含量.经过连续六轮 诱变.筛选后,得到一株稳定,优良的工业菌株,该菌 株在有氧黑暗条件下,在含有甘氨酸,乙酰丙酸,葡 萄糖和酵母提取物的培养基中培养,ALA产量高达 .?—— 47.?—— 第4期工业微生物第35卷 27.5mmol/L.可见诱变育种是提高ALA产量的一 条有效途径. 2.1.2代谢工程的应用 由于ALA生物合成的代谢途径及其调节的分 子机理已经弄清,ALA合成酶和ALA脱水酶的基 因已被克隆并测序,再加上从E.coli和R.sphae— Foides中分离到许多ALA营养缺陷型突变株,从而 为ALA产生菌的基因工程改良和代谢工程奠定了 基础. 在四碳途径中,ALA合成酶(ALAS)催化的反 应,是四吡咯乃至四吡咯化合物生物合成的关键步 骤,从代谢工程的角度来看,这是一个关键的节点. 该酶是整条合成途径的限速酶,因此通过基因工程 技术,将其基因克隆到受体菌中,有望扩增代谢流, 最终达到提高ALA产量的目的.Mariet等和 Choi等n的研究成果已证明了这一点.尽管跟R. sphaeroides突变株相比,重组E.coli的ALA积累 量仍然比较低,但由于它的培养时间只有14h,而 R.sphaeroides突变株则需要96h,因此利用重组 E.coli进行ALA的大规模生产不久将成为一个很 有效的生产工艺.由此可见,应用基因工程方法以 及代谢工程技术,获得高产率菌株将是今后的研究 方向. 2.2发酵工艺优化 要实现ALA的高效率发酵生产,除了选育高产 菌株外,优化发酵工艺也是重要途径之一.在液体 发酵过程中,影响AL产量的因素较多,包括培养 基组成(氮源和碳源的种类与浓度以及碳氮比),培 养基的起始pH值,种龄及接种量,溶氧量(氧化还 原电位),温度,ALA脱水酶抑制剂等,因此要想获 得最短周期,最高产量,最好质量,最低消耗,必须对 菌种做大量试验,取得重复性好的准确数据后,模拟 发酵代谢曲线,预测放大值,才能合理地最佳工 艺条件. 光照条件和ALA脱水酶抑制剂是影响R. sphaeroidesALA产量的两个主要因素.由于光照 对于大规模工业化生产不利,故现在一般采用有氧 黑暗的培养工艺.适当抑制AL脱水酶的活性有 利于ALA的积累,但又不能完全阻断代谢途径,否 则会导致细胞的死亡.因此使用底物或产物结构类 似物作为竞争性抑制剂是最佳的选择.使用最为广 泛的是底物类似物乙酰丙酸(LA).实验证明’” 添加L后,ALA的产量提高2,3倍.由于L对 菌体生长有抑制作用,因此要掌握好添加的时间和 方式.Sasaki等通过间歇地在培养液中三次添加 LA,取得了良好的效果.在培养的起始阶段加人 30mmol/LL会明显地抑制细胞生长,并导致AL 产量下降,而在对数生长后期加人LA,可使ALA的 产量达到最高(18.3mmol/L)n.除了底物或产物 类似物外,Dae—Hee_1’报道了他们通过添加lOmmo1] LD一葡萄糖,能显着地抑制ALA脱水酶的活性 (85%抑制),从而获得最高产量的胞外ALA (29mmol/L).他们据此认为,这一方面是因为葡萄 糖跟底物产生竞争性抑制作用,另一方面是因为葡 萄糖对酶蛋白产生钝化作用.由于葡萄糖比较便宜 且没有毒性,因此用它作为AL脱水酶的抑制剂对 于ALA的工业化生产具有重要的应用价值. 在好氧培养条件下,氧的供应对ALA的生产影 响极大.这是因为R.sphaeroides的ALA合成酶 对氧很敏感,但氧又是细胞生长(ATP形成)所必需 的.Watanabe等?叫发现,在正常的溶解氧条件下 (氧化还原电位为0,105mV),由于ALA合成酶被 钝化,AL的产量较低,而氧化还原电位控制在非 常低的水平(低于一31mV)时,细胞的生长和呼吸也 会受到抑制,ALA的生产也会因能量供应的限制而 受到抑制.为了解决这个问题,Watanabe等建立了 一 种二段生产工艺,即好氧(供细胞生长,IX)为0.1 -- 7.5mg/L)和微氧(供ALA生产,ORP为一30, 0mV)相结合的培养系统,并成功地应用于工业化生 产. 培养基的起始pH值也是影响R.sphaeroides ALA生产的一个重要因素.尽管已有报道-J认为 R.sphaeroides和重组E.coli在中性pH时,ALA 的产量最高,但考虑到ALA在碱性条件下是不稳定 的,因此ALA的发酵生产最好在微酸性pH条件下 进行-2,不过这又需要解决微酸性条件下R.spha. eT’oides生长不良的问题.除了可以通过菌种筛选, 选择能在微酸性条件下生长良好的生产菌株外,还 可以采用二段生产工艺来解决这个问题,即先在好 氧中性或微碱性条件培养细胞,然后转人微氧微酸 --—— 48--—— 第4期谢秀祯,等:提高类球红细菌5一氨基乙酰丙酸产率的措施第 35卷 性条件下进行A的转化生产. 在ALA的四碳合成途径中,琥珀酸和甘氨酸都 是ALA合成的底物,但刘秀艳等人l1引认为甘氨酸 是必需底物,而琥珀酸不是必需底物.Sasaki等 也认为甘氨酸在ALA合成中起到关键的作用.但 加入过量的甘氨酸会抑制细胞的生长,这是甘氨酸 本身以及甘氨酸代谢产生的氨所使然.至于琥珀酸 是不是必需底物,还有待进一步验证.这里也许有 一 个碳氮比的优化问题.另外,生产所用的碳源,除 了琥珀酸外,还可以用葡萄糖和脂肪酸(包括有机废 水消化后产生的混合脂肪酸). 3展望 A在农业和医学领域已有许多应用.在农 业上,ALA不仅可用作绿色除草剂,杀虫剂,除草加 速剂,植物生长促进剂和增产剂,还可用来提高作物 的耐盐性和耐寒性,提高蔬菜的品质等;在医药上, AL不仅作为光动力学治疗剂用于治疗癌症(如肺 癌,皮肤癌,口腔癌,食道癌,结肠癌,膀胱癌等),治 疗类风湿关节炎,真菌病,而且可用来诊断重金属中 毒症,卟啉症,脑肿瘤,另外还可用于头发再生和防 止脱发;在生物技术上,ALA不仅可以用于含卟啉 酶,卟啉,维生素B:的生产,还可以应用于动植物细 胞培养以及基因工程菌的培养.其中ALA在癌症 治疗中的作用尤其值得关注.例如光动力学疗法已 用于治疗血管瘤和其他类型肿瘤.而在农业领域, 提高植物对环境胁迫的耐受性的新方法也正在试验 中.由于ALA是血红素和叶绿素合成的重要要素, 而它们又分别是动物细胞和植物细胞代谢所必需 的.因此,可望进一步开发出新的,更加有价值的应 用领域. A生产的一个难题是它的生产成本.通过 菌种的选育和优化发酵工艺来提高产率,同时利用 廉价原料(如有机废水)进行生产,应该是降低生产 成本的有效途径.但是进一步的遗传操作不能提高 R.sphaeroides突变株的ALA产量.Elrod等?尝 试用真菌的ALA合成酶基因在丝状真菌中超量生 产ALA.另外,由于从琥珀酰辅酶A和甘氨酸合成 ALA只是一步反应,因此如果能解决琥珀酸在细胞 内转变为琥珀酰辅酶A所需能量问题,那么用高密 度重组E.coli(能超量表达ALA合成酶)或固定化 重组E.coli进行生物转化生产ALA,也是值得探 讨的一条途径. 参考文献 [1]SasakiK,WatanabiM,TanakaTeta1.Biosynthesis,biotechn— ologicalproductionandapplicationsof5一aminolevulinicacid[J]. 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Keywordsacid—stablexylanase;production;purification;properties;structuralbasis 一 50—