细胞爬片的方法与心得

细胞爬片的与心得 多聚赖氨酸的浓度应该不严格，主要就是将贴壁能力弱的细胞固定上去，如0.1,(w/)，消毒可用紫外线照射。 园子里搜到的玻片的处理方法: 玻片泡酸，自来水冲洗数遍，去离子水冲洗，就像细胞培养瓶等的那种处理就可以。然后放在小饭盒或者玻璃皿里高压灭菌。再烤干备用。 将玻片用灭菌镊子放于培养皿中，加细胞。整个过程注意无菌操作就是了。也没啥难的。 要注意的是: 1.泡过酸的玻片特别脆。用镊子夹着过水。要冲得充分，和那些细胞培养用玻璃管，瓶等的原则一样。 2.如果你觉得玻璃片太大。可以在泡过酸，水冲洗过用磨石在玻璃片上划痕，掰开。我曾将一个玻璃片分成4个小片，在12孔，24孔板里放一两片那种。 3.有个问题我一直没有解决好:就是加上培养基后玻璃片拿动培养皿时，玻璃片会窜，常会压到长在皿底部的细胞。挺麻烦的。后来还发现在玻璃片上的细胞和长在皿底部的细胞形态有点不一样。现在我已经不做爬片了，直接在皿里做免化等也不错。 爬片的HE染色及注意事项: 要点: 标本的制备:细胞爬片的制作很关键，首先是细胞能够爬好，细胞分布均匀，密度适中;其次是不会在染色过程中脱片，细胞形态走形～相应的处理----要选择状态良好的细胞，一般要选择消化吹打均匀传代第二或三天的细胞，镜下的为细胞平铺为瓶底的80,左右为宜。细胞分布均匀，形态良好，吸取(标准是吸取而不是倾倒)培养基，加无血清培养基或PBS洗一遍，加1ml胰酶(大号瓶可加致2ml)，轻晃使胰酶分布到每个角落，考虑胰酶刚刚融化，加后可在火上过几下，因为在37度消化作用最好。一般消化2到3分钟(不同细胞不一样，)，镜下(金标准)见细胞回缩，边缘折光性改变，向圆形改变(经验:这时稍用力摇晃，镜下见一些圆形细胞随胰酶漂移即可)，即倒掉胰酶，加培养基或血清(体会:加培养基即可，而且吹打时不易形成泡沫)吹打，感觉象流沙一样最好，但绝对不可消化过头～～消化后要多吹打几次，尽量形成单细胞悬液，离心后调整细胞接种密度(摸索本细胞系体会:2,5×104/ml合适)。 玻片的制备:盖玻片泡清洁液24小时，自来水洗10遍，1蒸洗3遍，煮沸20分钟，2蒸洗3遍，煮沸20分钟;放入80,(须进一步明确)酒精2,4个小时，用绸布搽拭凉干。放入瓶皿高压灭菌待用。(本实验未用多聚赖氨酸涂片，具体过程可见DXY) 加细胞时，先在每个孔里滴几滴培养基，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。接种后6小时细胞即可贴壁，可去上清加含药培养基，等作用时间到，取玻片。 固定:细胞爬片后用4,的多聚甲醛固定20分钟后，PBS洗2遍后进行染色; 染色:玻片用中性树胶把无细胞面和载玻片固定，便于染色。过程(此过程适合细胞爬片，石蜡切片等不尽相同，须查相关文献和专著)——苏木素中1,1.5分钟;自来水洗数遍，加氨水(少量，起泛蓝的作用);放入分化液(配方为盐酸酒精，比例未记～作用时间，有文献介绍2,7秒，具体须自己摸索;作用是溶解蓝色的苏木素，尤其是胞浆的蓝色)片刻;放入伊红1,2分钟;80,酒精2,3分钟;95,酒精?2,3分钟;95,酒精?5分钟; 100,酒精?5分钟;100,酒精?10分钟;二甲苯?10分钟;二甲苯?10分钟;将玻片细胞面和载玻片用中性树胶封片。 细胞爬片的保存: A:只需要用95,酒精或者4,多聚甲醛固定10,15分钟，用吹风机吹干后放在,20?保存就可以了，而且可以长期放置，以后可以根据实验需要进行HE染色，免疫组化，细胞化学 等染色。 B:对于一般的细胞免疫组化，我的做法是:细胞爬片用冰的纯丙酮固定20MIN，再在通风柜将丙酮吹干，—-20度保存，用丙酮固定作用是沉淀蛋白质和糖，穿透性很强，保存抗原的免疫活性好。所以丙酮常用做细胞细胞爬片的固定剂。 当然还是要根据你的实验目的决定用那种固定剂。 如:1。多聚甲醛(常用4%):可用于免疫电镜;也可用于免疫荧光染色。 主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等 2(乙醇。优点:穿透性强、抗原性保存较好。缺点:但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解;染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度 3(甲醛(福尔马林)应用最广 优点:形态结构保存好，且穿透性强， 缺点: 甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色; 分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。 关于细胞的打孔: 如果做免疫组化，是否需要打孔应该根据你的抗原所在的位置来决定，如果是跨膜蛋白，就不需要打孔了，如果是胞内蛋白和核内蛋白则需要打孔，其余步骤与普通免疫组化一样，但是只需要从蒸馏水开始，而不需要进行脱蜡和酒精下行的步骤。 别一种打孔方法:可以通过用1%triton X-100或者在洗液中加入0.2%的triton X-100PBS。补充多聚赖氨酸的涂片: 园子里可以搜到:谢谢各位，受益匪浅。 细胞爬片的保存和抗原修复问题 1. 细胞爬片可以用 含 叠氮钠PBS液保存.但不知道具体浓度,请告知.多谢!! 加在液体中作为防腐剂的叠氮钠浓度一般为0.04--0.08%。但是我建议对于细胞爬片，还是尽量快的进行处理，以防不必要的问题! 2. louischen wrote:但我的细胞爬片经过4%多聚甲醛固定，PBS冲洗后直接就放在了-20度，还能用于免疫组化吗?! 应该没有问题，但是还是现作先染好些，以防抗原的丢失 3. mRNA原位杂交经4%多聚甲醛固定,固定液需加DEPC水。其它建议用甲醇固定。-20度保存 4. 如果是4%多聚甲醛固定，然后放在PBS中保存，在4度冰箱里保存两周没问题。时间再长就没试过了。 5. 丙酮中固定5-10分钟，然后风干，放置4度保存过夜应该是没有问题。不要固定过夜，蛋白质固定过度，会影响抗原的暴露，影响免疫组化结果。如果是胞浆或胞核抗原出现 假阴性结果，可考虑应用0.5%的triton-100孵育30分钟，渗透细胞膜。如果玻片没有经过特殊处理，不要用其他抗原修复的方法，会造成掉片，我曾有过这方面的体会 6. 丙酮固定后，PBS洗涤3次，即可保存至4度冰箱备用。 7. (1)细胞爬片先用TBS洗3次，每次5分钟 多聚甲醛固定，室温，20分钟 -80%-90%-95%-100%梯度酒精脱水，通风橱内干燥，-80度保存。2周没有 月都有信号，不过还是保存时间短一点的好 问题的，我保存过2个 8. 我的心肌细胞爬片用不同浓度的乙醇依次脱水后,就放在室温中,因为是要拍电镜,但是学校电镜坏了,呵呵,所以放了一个月后去拍,还是很好 9. 细胞爬片用4%多聚甲醛或冷丙酮等固定，用PBS冲洗后，晾干，放在-20度保存一个月没有问题的。 10. 细胞爬片，有机溶剂如4%多聚甲醛或冷丙酮等固定后，轻轻摇动玻片或培养皿等，静置2min左右，弃去固定液，不用PBS洗而是采用空气干燥，干燥后的标本可于-70?长期保存。解冻时要小心抗原破坏，应先将标本转移于干冰预冷的固定液，然后再将混合液转移至室温下，固定液到达室温时取出标本，再用PBS冲洗，在做以后的步鄹 11. 我也做过细胞爬片的组化染色，不过没有遇到类似的问题。细胞培养好后用PBS洗一遍，然后4%多聚甲醛4度固定15分钟，自然风干。室温保存几周内都可以用的。我想这可能与抗原的类型有关，有的对氧化等损伤比较敏感，有的差一些。最好避光保存在4度，同时尽量隔绝空气。免疫荧光与普通DAB显色差别只再二抗的标记，样品的保存应该是没有多大差别的。 12. 细胞爬片丙酮固定后-20度保存，现在要再做免疫荧光，将保存的爬片拿出37度复温然后常规操作就可以了 13. 爬片做免疫组化的优势在于抗原新鲜，细胞形态保存较好。若爬片需长期保存并出现你这样的问题，原因可能是:1)试验步骤有误，建议重复并加阳性对照片。2)加一抗前处理同石蜡切片，可进行抗原修复，如胰酶消化或热修复。3)因为抗原抗体反应在液相中进行，故对已极度干燥的爬片充分水化很重要。建议试验前用PBS浸泡过夜。如不能解决你的问题请QQ联系:81825645。本人在湖南省肿瘤医院病理科(长沙市)做免疫组化。 14. 4%多聚甲醛或冷丙酮固定都可以，也有用无水酒精的，固定好后放-20度，2-3个月是没有问题的。 15. 对于一般的细胞免疫组化，我的做法是:细胞爬片用冰的纯丙酮固定20MIN，再在通风柜将丙酮吹干，—-20度保存，用丙酮固定作用是沉淀蛋白质和糖，穿透性很强，保存抗原的免疫活性好。所以丙酮常用做细胞细胞爬片的固定剂。当然还是要根据你的实验目的决定用那种固定剂。 如:1.多聚甲醛(常用4%):可用于免疫电镜;也可用于免疫荧光染色。 主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等 乙醇。优点:穿透性强、抗原性保存较好。缺点:但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解;染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度 甲醛(福尔马林)应用最广 优点:形态结构保存好，且穿透性强， 缺点: 甲醛放置 过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色; 分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。 16. 4度是不能保存这么长时间(1个月)的，如果抗原已被分解，再修复也没用! 17. 弃去固定液，不用PBS洗而是采用空气干燥，干燥后的标本可于-70?长期保存。 18. 爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒钟，然后在4%多聚甲醛中固定15分钟，然后再用37度去离子水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。同时操作过程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。 将做好的爬片置于滤纸上晾干，然后用中性树胶粘在载玻片上。注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了 做好的细胞爬片可以放在-20保存备用，具体能保存多长时间不太清楚，当然尽量早用。 19. 固定后放点PBS，然后放在4度冰箱中保存，我最长保存两个月的，然后再做免疫组化，应该没有太大的问题的。 20. 固定后4度可以存放一周，-20度存放半年，我现在也要做这个，实验室老师教的。 21. 四度放1周应该没问题的，你最好放在-20度，我在-20度放一个月都还出结果的.很多人作的片子很多，不可能一次作完，一个月没问题. 22. 最佳的固定及保存方法: 中性缓冲福尔马林(不必调pH): 福尔马林(40%甲醛，用时加入过量碱式MgCO3中和) 10.0ml 加0.85 %NaCl溶液溶解，定容至100ml。 细胞固定:待细胞接近长成单层时，用镊子取出盖玻片，迅速于37?PBS中漂洗2次，每次3-5秒，以清除血清。 将盖玻片投入中性缓冲福尔马林溶液中室温固定30min。 用镊子取出盖玻片，PBS漂洗2次，每次3-5秒，晾干保存于-20?备用。可长期保存，做实验时，取出片子，入PBS湿润后即可进行你的实验。 可以用于做免疫细胞化学(H.E.)或免疫荧光。(本帖没有加分) 23. 细胞爬片固定以后要放在-20度的冰箱.1个月内可以用. 24. skywalkerzz wrote:过氧化氢处理这一步，用三蒸水稀释商品浓度为30%的过氧化氢，然后室温下玻片放在其中浸泡10min，是不是过氧化氢导致细胞严重脱片? 爬片应该用甲醇/双氧水，你的细胞极可能是过氧化氢导致严重脱片 25. 本人比较喜欢用4%得多聚甲醛，20分钟很好用的。保存的时候注意片子最好晾干，不要挤压，防止粘片和碎裂。 26. 细胞爬片固定好以后，如果要保存，我们的做法是倒掉固定液，PBS漂洗后干片保存在4度，最长半年没问题。 27. 1、用新鲜配制的预冷的4%多聚甲醛缓冲液室温固定15 min，PBS (0.01 mol/l, pH7.4)洗涤3遍后是否就可以进行免疫细胞化学染色了 、爬片PBS (0.01 mol/l, pH7.4)洗涤3遍后是否能保存，怎样保存? 、洗过就可以做免疫组化了。 、固定过后自然干燥，不要洗，-20度保存。做之前再洗。 28. 细胞固定最好用丙酮或酒精，不要用4%多聚甲醛，以免抗原交联，这样组化时不用再抗原修复。细胞固定后可室温保存在丙酮中，不使之干燥。 29. 如果是检测膜上的物质,好象不能用酒精, 30. 适当密度后取出固定(丙酮-20固定10,20min)，再进行免疫染色。 31. 一批细胞爬片,如果细胞爬片是在玻璃上，冷丙酮固定15-20分钟，然后放-20度，没有问题。 如果细胞爬片是在24孔板或6孔板里进行，冷丙酮会腐蚀板子，最好4%多聚甲醛。 32. 细胞爬片用纯丙酮固定10分钟，取出干燥后用锡纸包裹，-70度保存。 33. 4%多聚甲醛固定后PBS水洗，自然干燥后用锡纸包裹，-20度冻存不超过1月。 34. 如果细胞贴壁困难，可将片子先用纯血清挂一层，凉干后再养细胞。 35. 可以买NUNC公司的专用细胞培养用盖玻片，商品名Thermanox? Coverslips。高分子材料，耐高温灭菌，经过特殊表面处理，细胞容易贴附。可以用剪刀任意裁剪，使用效果好。 上海生工有现货，不用国外定货。我使用后，觉得效果比玻璃盖玻片效果好很多。 36. 我们通常是把细胞玻片固定好后，用PBS冲洗干净，然后用酒精脱水(80%，90%，100%，100%酒精各一次，每次10分钟左右)，然后放在烘箱里烘干，这是就相当于石蜡切片了，可以保存一定的时间。 这个方法我们试过的，保持一段时间后做，效果还是可以的。