大肠杆菌检测[指南]

大肠杆菌检测[指南] 大肠杆菌的检测:大肠菌群测定的操作细则 大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。 食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)示。 1 设备和 1.1 温箱:36?1?。 1.2 冰箱:0,4?。 1.3 恒温水浴 :44.5?0.5?。 1.4 天平。 1.5 显微镜。1.6 均质器或乳钵。 1.7 平皿:直径为90mm。 1.8 试管。 1.9 吸管。 1.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。 1.11 玻璃珠:直径约5mm。 1.12 载玻片。 1.13 酒精灯。 1.14 试管架。 2 培养基和试剂 2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。 2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。 2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。 2.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。 2.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中3.22规定。 2.6 生理盐水。 2.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。 3.1 检样稀释 3.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。 3.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。 3.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。 3.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。 3.2 乳糖发酵试验 将待检样品接种于乳糖 胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管,置36?1? 温箱内,培养24?2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。 3.3 分离培养 将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36?1? 温箱内,培养18-24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。 3.4 证实试验 在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置 36?1?温箱内培养24?2h,观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。 3.5 报告 根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。 4 粪大肠菌群(faecal coliform) 4.1 用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物(见3.2条)转种于EC肉汤管内,置44.5?0.2?水浴箱内(水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面),培养24?2h,经培养后,如所有EC肉汤管均不产气,则可报告为阴性;如有产气者,则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上,置 培养18-24h,凡平板上有典型菌落者,则证实为粪大肠菌群阳性。 4.2 结果报告 根据证实为粪大肠菌群的阳性管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)粪大肠菌群的MPN值 乳酸菌的检测: 一 概述 乳酸菌是指一群能分解葡萄糖或乳糖产生乳酸，需氧和兼性厌氧，多数无动力，过氧化氢酶阴性，革兰氏阳性的无芽胞杆菌和球菌。这类细菌在自然界分布广泛，可栖居在人和各种动物的口腔、肠道等器官内，在土壤、食品、饲料、水及一些临床标本中都有乳酸菌的存在。乳酸菌在工业、农业和医药等与人类生活密切相关的领域应用价值很高，相当多的乳酸菌对人、畜的健康起着有益的作用，但个别菌种能对人畜致病，乳酸菌主要包括23个属的细菌。 二 样本采集 检样主要为含乳酸菌活菌的饮料和微生态制剂，样本应放入冰箱保存，心快检验。 三 检验方法(中华人民共和国国家标准 乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物学检验GB,T 16347-1996) 乳酸菌菌总数的测定:乳酸菌菌落总数是指标样在一定条件下培养后，所得1ml检样中所含乳酸菌菌落的总数。 (一)检验程序 乳酸菌菌落总数检验程序如下: (二)培养基和试剂 改良TJA培养基(改良番茄汁琼脂培养基);改良MC培养基(modified Chalmers培养基);0.1,亚甲蓝牛乳培养基;6.5,氯化钠肉汤参照;pH9.6葡萄糖肉汤;40,胆汁肉汤;淀粉水解培养基;精氨酸水解培养基;乳酸杆菌糖发酵管;七叶苷培养基;革兰氏染色液;3,过氧化氢溶液;蛋白胨水、靛基质试剂;明胶培养基;硝酸盐培养基、硝酸盐试剂;生理盐水:定量分装于三角瓶和试管内灭菌。 (三)操作步骤 1(以无菌操作将经过充分摇匀的检样25ml(或25g)放入含有225ml灭菌生理盐水的来菌广口瓶内做成1:10的均匀稀释液。 2(用1ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1m，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内(注意吸管尖端不要触及管内稀释液)。 3(另取1ml灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍增稀释液，如此每递增一次，即换用1支1ml灭菌吸管。 4(选择2,3个以上适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。 5(稀释液移入平皿后，应及时将冷至50?的乳酸菌计数培养基(改良TJA或改良MC)注入平皿约15ml，并转动平皿使混合均匀。同时将乳酸菌计数培养基倾入加有1ml稀释液检样用的灭菌生理盐水的灭菌平皿内作空白对照，以上整个操作自培养物加入培养皿开始至接种结束须在20min内完成。 6(待琼脂凝固后，翻转平板，置36??1?温箱内培养72h?3h取出，观察乳酸菌菌特征，选取菌落数在30,300之间的平板进行计数。计算后，随机挑取5个菌落数进行革兰氏染色，显微镜检查并做过氧氢酶试验。革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性，无芽胞的球菌或杆菌可定为乳酸菌。根据证实为乳酸菌菌落计算出皿内的乳酸菌数，然后乘其稀释倍数即得每亳升样品中乳酸菌数。例如，检样10,4的稀释液在改良TJA琼脂平板上，生成的可疑菌落为35个，取5个鉴定，证实的乳酸菌的4个，则1ml检样中乳酸菌数为: 35×4,5×104,2.8×105 7(乳酸菌在改良TJA和改良MC培养基上菌落生长形态特征。 (四)乳酸菌的鉴定 对上述分离到的乳酸菌需进行菌种鉴定时，则作以下试验。 1(菌种制备 自平板上挑取菌落，接种于改良TJA或改良MC琼脂斜面，于36??1?，24,48h培养，刮取菌苔，分别进行下列试验。 2(乳酸杆菌鉴定试验 极少见还原硝酸盐，不液化明胶，不产生靛基质和硫化氢。 3(常见乳杆菌属内种的碳水化合物反应。 4(产酸乳的链球菌的鉴别试验。 IMViC试验 IMViC试验 细菌的生化反应用于鉴别细菌，尤其对形态、革兰染色反应和培养特性相同或相似的细菌更为重要。吲哚(I)、甲基红(M)、VP(V)、枸橼酸盐利用(C)四种试验常用于鉴定肠道杆菌，合称为IMViC试验。例如大肠埃希菌对这四种试验的结果是“++--”，产气肠杆菌则为“--++”。 吲哚试验:某些细菌有色氨酸酶，能分解色氨酸形成吲哚;将对二甲基氨基苯甲醛加入细菌蛋白胨水培养液中，吲哚与试剂中的对二甲基氨基苯甲醛结合，呈红色反应，形成玫瑰吲哚，为吲哚试验阳性。不出现红色则为阴性。 甲基红试验:产气肠杆菌使丙酮酸脱羧后形成中性产物，培养液PH〉5.4。甲基红指示剂呈橘黄色，为甲基红试验阴性，大肠埃希菌分解葡萄糖产生丙酮酸，培养液呈酸性PH〈5.4，指示剂甲基红呈红色，称甲基红试验阳性。 V-P试验:大肠埃希菌与产气肠杆菌分解葡萄糖，产酸产气，为区分两菌可采用V-P试验及甲基红试验。产气肠杆菌能使丙酮酸脱羧，氧化(在碱性溶液中)生成二乙酰，后者可与含胍基的化合物反应，生成红色化合物，称V-P试验阳性;大肠埃希菌分解葡萄糖产生丙酮酸，V-P试验阴性。 枸橼酸盐利用试验:能利用枸橼酸盐作为唯一碳源的细菌如产气肠杆菌，分解枸橼酸盐生成碳酸盐，同时分解培养基的铵盐生成氨，使培养基呈碱性是，使指示剂溴麝香草酚蓝(BTB)由淡绿转为深蓝，此为枸橼酸盐利用试验阳性。 MUG+ 靛基质 + IMVIC MUG- 靛基质- IMVIC MUG+ 靛基质- EMB琼脂平板 IMVIC++-- MUG - 靛基质+ EMB琼脂平板 IMVIC++-- 靛基质(Indole)试验: 某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。 试验方法:将待试纯培养物小量接种于试验培养基管，于36?1C培养24h时后，取约2ml培养液，加入Kovacs氏试剂2~3滴，轻摇试管，呈红色为阳性，或先加少量乙醚或二甲苯，摇动试管以提取和浓缩靛基质，待其浮于培养液表面后，再沿试管壁徐缓加入Kovacs氏试剂数滴，在接触面呈红色，即为阳性。 实验证明靛基质试剂可与17种不的靛基质化合物作用而产生阳性反应，若先用二甲苯或乙醚等进行提取，再加试剂，则只有靛基质或5-甲基靛基质在溶剂中呈现红色，因而结果更为可靠。 细菌实验培养时间:30-35? 2天 霉菌实验培养时间:25-28? 3天 逐日观察并记录结果。 TCL制备 1 CMC配制 1000克水:5CMC 2 硅胶与CMC水夜的配制100ML:30克硅胶 3 然后超声，一直超到没有小气泡，边超边搅拌，