FXR、MDR3在妊娠肝内胆汁淤积症胎盘胆汁酸转运作用机制的探讨

FXR、MDR3在妊娠肝内胆汁淤积症胎盘胆汁酸转运作用机制的探讨 重庆医科大学 硕士学位论文FXR、MDR3在妊娠肝内胆汁淤积症胎盘胆汁酸转运作用机制的探 讨 姓名:常林利 申请学位级别:硕士 专业:妇产科 指导教师:刘建 20060501 重庆医科大学 研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果(据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发或撰写过的研究成果，也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 学位论文作者签名:—蔓阻日期:,丛二,生』坦—一 学位论文版权使用授权书 本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定，即:研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属重庆医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅(学校可以公布学位论文的全部或部分(保密内容除外)，可以采用影印，缩印或其他手段保存论文。 垄 ， 论文作者签名: 指导教师签名: 日 期: 重庆医科大学硕士研究生学位论文 符号说明英文缩写 英文全称 中文对照,,, ,,,—,,,,,,, ;,,,,,,, 三磷酸腺苷结合盒,,,, ,,,, ,,,, ,,,,,, ,,,, 胆盐输出泵,, ,,,, ,,,, 碱基对,,,, ;,,,,,,,,,;,,,,; ,;,, 鹅脱氧胆酸,, ,,,,,;,,,,; ,;,, 脱氧胆;,,,,, ,;,, 胆酸,,, 酸,,, ,,,,,,,,,,,,,,,, 二氨基联苯胺,,,, ,,,,,,, ,,,,;,,,,,,,, 焦磷酸二乙酯,,, ,,,,,,,;,,,; ,;,, 脱氧核糖核酸,,,, ,,,,,,,;,,,,,,, ,,,,,,,,,,,, 脱氧核苷三磷酸,,, ,,,,,,,, ,,;,,,,, , 雌傲素,,受体,, ,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,一乙炔雌二醇,,, ,,,,,,,,, , ,,;,,,,, 法尼醇受体，,, ,,,,,,,,,,; ;,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,;, 妊娠期肝内胆汁淤积症，,, ,,,,,,,, ,,,,,,;,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,, 间隔一个核苷酸的反向 ,, , ,,,,,, ,,;,,,,,,, 重复序列,,, 石胆酸 ,,,,,;,,,,; ,;,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,;, ,,,,,,, , 多药抵抗性蛋白,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,;, 多药耐药基因,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,;, 多药耐药基因,,,, ,,，,,,,,,;,,,,,, ;,,,,,,,,,,,,, 钠离子,牛磺胆酸盐同向 ,,,,,,,,,,, 转运多肽,,,,, ,,,,,,; ,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,, 有机阴离子转运蛋白,,, ,,,,,; ;,,,,, ,,,,,,,,,,, 有机阴离子转运体 重庆医科大学硕士研究生学位论文,,, ,,,,,,;,,,, ;,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,;, 妊娠期胆道梗阻,, ,,,,;,, ,,,,,,, 光密度,,，,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,, 渐进陛家族性肝内胆汁 ;,,,,,,,,,, ,,,, , 淤积症,型,,，,, ,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,; 渐进性家族性肝内胆汁 ;,,,,,,,,,, ,,,, , 淤积症,型,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,, 磷酸盐缓冲液,, ,,,,,,,,, ,,,;,, ,，,一丙二醇,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,, 磷脂酰胆碱，卵磷脂,,, ,,,,,,, ,,,,, , 蛋白傲酶,,,, ,,,,,, , ,,;,,,,, 视黄醇,受体,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,;,,,,,,, ,,,,,,,,,, ;,,,, 逆转录聚合酶链反应 ,,,;,,,,,,, ,,,,,;,,,; ,;,, 核糖核酸,,,,, ,,,,,,;,,,,, ,,,酶,,,, ,,,,,,,,,,,,??,,,,,,??,,,,,,,,,,,,,,,,, 生物素(亲和素(过氧化 物酶复合物,,, ,,,,, ,,,, ,;,, 总胆酸,,,, ,,,,,,,,,;,,,,; ,,, 能脱氧胆酸 , 重庆医科大学硕士研究生学位论文 ,,,在妊娠肝内胆汁淤积症胎盘胆汁酸转运 作用机制的探讨 摘要 目的:本研究通过检测法尼醇受体(,,,,,,,,, , ,,;,,,,,，,,,)、多药耐药基因(,,,,)在胎盘上的表达，以及在雌傲素、鹅脱氧胆酸、熊脱氧胆酸作用下两者的变化，从而了解,,,的配体一胆酸在胎盘组织中如何调节,,,及,,,,的表达以及雌激素对,,,和,,,,表达的影响，从而明确,,,在胎盘胆汁酸转运的作用机制。 方法:,、选取单胎妊娠肝内胆汁淤积(,,,,,,,,,,,; ;,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,;,，，,,)患者的新鲜胎盘,,例，正常妊娠,,例作为对照。应用,,,,,,对胎盘,,,,及,,,,,,,表达进行。 ,、取正常妊娠,,—,,周剖宫产术后的无菌胎盘组织进行体外培养，加入不同浓度的鹅脱氧胆酸(,、,,、,,、,,、,,、,,,,,)、熊脱氧胆酸(,,,、,,,、,,,、,,,、,,,、,,,、,,,,,)培养,,小时，用,,,,,,检测,,,,及,,,,,,,表达的变化。 ,、取正常妊娠,,(,,周剖宫产术后的无菌胎盘组织进行体外培养，加入,,,,鹅脱氧胆酸培养不同时间(,、,、,、,,、,,、,,、,,,)，用,,,,,,检测,,,,及,,,,,,,表达的变化。 ,、取正常妊娠,,—,,周剖宫产术后的无菌胎盘组织进行体外培养，加入不同浓度的雌激素(,、,、,、,、,、,,、,,,,)培养,,小时，用 ’ 重庆医科大学硕士研究生学位论文,,,,,,检测,,,,及,,,,,,,的表达变化。 ,、取，,,剖宫产术后的无菌胎盘组织进行体外培养，加入不同浓度的熊脱氧胆酸(,,,、,,,、,,,、,,,、,,,、,,,、,,,,,)共同培养,,小时，用,,,,,,检测,,,,,,,,的表达变化。 结果:,，,,组,,,,,,,,的表达低于正常组，,,,,,,,的表达高于正常组(,,,(,,)。?在体外培养的绒毛组织中加入不同浓度的鹅脱氧胆酸(,,,,)，,,,,,,,的表达随,,,,剂量的增加而增加(,,,(,,);,,,,,,,,在,,,,达最大表达(,,,(,,)，,,,,,则有所降低(,,,(,,)。?在体外培养的绒毛组织中加入,,,,的,,,,，培养不同时间，,,,,,,,随时间的增加而增加;培养,,,时,,,,,,,,的表达达最高(,,,(,,)，,,,则稍下降(,,,(,,)。?在体外培养的绒毛组织中加入不同浓度的熊脱氧胆酸(,,,,)培养，,,,,,才激活,,,，,,,,,才傲活,,,,;随 着,,,,剂量的增加，,,,,,,,、,,,,,,,,逐渐增加(,,,(,,)?在体外培养的绒毛组织中加入不同浓度的雌激素，,,,,,,,没有明显变化;,,,,,,,,随,,剂量的增加而减低(,,,(,,)。?熊脱氧胆酸作用于，,,的体外培养的绒毛组织后，,,,,,,,,,时,,,,,,,,增加，并随,,,,剂量的增加而增加(,,,(,,)。 结论:(,)在胎盘,,,可调节,,,,的表达，并随鹅脱氧胆酸、熊脱氧胆酸的剂量和时间的改变而变化。(,)雌激素可抑制,,,,在胎盘的表达，但对,,,无明显作用。(,)胎盘上存在胆酸的主动转运过程，其转运可以逆浓度差进行，,,,、,,,,在胎盘上的表达异常而引起 , 重庆医科大学硕士研究生学位论文的胆酸转运异常可能是，,,发病机制之一，熊脱氧胆酸可能通过调节,,,,的表达而发挥治疗作用。 关键词:妊娠，胆汁淤积，胎盘，法尼醇受体，胆汁酸 重庆医科大学硕士研究生学位论文,,, ,,,,,,，,, ,, ,;:,,,,,,，, , ,,,,,,,, ,,,,,,, ,, ,，,, ,,,, ,,,,,,,,, ， ,,,,,,,,,, ，,,,,,,,,,，, ,,,,,,,,, ,,, ,，, ,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,;,,,,:,, ,,,,,,, ,,, ,,,,;, ,, ,,,, ,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,;,,,, ,,,,,,,,,,,,,; ;,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,;,(，,,),, ,,,,;,,,, ,,, ,, ,,;,,,,“,,,),,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,, , ,,,,,,,, ,, ,,,;,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,,,,;,, ,, ,,,,,,,,,,;,,,,; ,;,,(,,,,),, ,,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,, ,,, ,,,,,,, ,, ,,,;,,,,( ,,,,,,,:,, ;,,, ,, ，,, ,,, ,, ;,,, ,, ,,,,,, ,,,,,,,;, ,,;,,,,,,, ,,,,, ,, ,,,,,,,,,, ;,,,,,,(,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,,,, ,, ,,,;,,,, ,,,, ,,,,;,,, ,, ,,,, ,,,,,, ,, ,,,,,,(,,,,,,,,,, ;,,,,,, ,,,;,,,, ,, ,,—,, ,,,,, ,,,,,,, ,, ;,,,,,,, ,,;,,,,,, ,,,,, ,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,, ,,(,，,，,，,，,，, ,，, ,,,)，,,,,(,，,,，,,，,,，,,，,,,,,)，,,,,(,,,，,,,，,,,，,,,，,,,，,,,，,,,,,),,, ,, ,,,,, ,,, ,,,, ,, ,, ,,,, ,,, ,，,，,，,,，,,，,, ,,,,,，,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,，,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,—,,,(,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,; ;,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,;, ,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,(, ,,，,,,，,,,，,,,，,,,，,,,，,,,,,),,, ,, ,,,,,，,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,，,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,( , 重庆医 科大学硕士研究生学位论文 ,,,,,,:(,),,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,, ,, ,,,;,,,, ,,, ,,,,,,,，,,,;, ,,, ,,,, ,, ，,, ,,,, ,, ,,,,,, ,,,, ,,,,,,,;,(,,,(,,)((,),,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,, ,, 穑欤幔悖澹睿簦?,,, ,,,, ,, ，,, ,,,, ,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,,;,(,,,(,,)((,),,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,(,,，(,,),,, ,，,，,,，,,，,,,，,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,, ,,,,;,,, ,, ,,,,,,(,,—,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,;,,,,, ,,,,,, ,,(,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,, , ,,,, ,,,,;,,,, (,,,(,,)，,,,;, ,,;,,,,,, ,,,,,,,, ,, ,,,(,,,(,,)((,),,,,, ,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,, ,,,,(,，,,，,,，,,，,,，,,,,,),,, ,,,(,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,, ,, ,,—,,,(,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,, ,,,,;,,,,, ,,,, ,,,,(, ,,,,;,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,, (,,,(,,)，,,,;, ,,;,,,,,, ,,,,,,,, ,, ,,,,,(,,,(,,)((,),,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,, ,,,, ,,,,(,，, ,,，,,,，,,,，,,,，,,,，,,,，,,,,,),,, ,,,，,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,;,,, ,, ,,,,,,(,,—,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,;,,,,, ,,,, ,,,,,，,,, ,,—,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,;,,,,, ,,,, ,,,,,(,,,(,,)((,),,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,, ,,,,,,(,，,，,，,，,，,,，,,,,),,, ,,,，,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,;,,, ,, ,,—,,,(,,,,—,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,;,,,,, ,,,, ,,,(,,,(,,)，,,, ,, ,,,,,,,;,,, ,,,,;, ,,, ,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,(,,,(,,)((,),,,,, ,,,,,,,,,,, ,,，,, ,,,, ,,,,,,, ,,,, ,,,,(, ,,，,,,，,,,，,,,，,,,，,,,，,,,,,),,, ,,,， , 重庆医科大学硕士研究生学位论文,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,, ,,, ,,,,;,,, ,, ,,—,,,(,,。,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,, ,,,,,,, ,,,,;,,,,, ,,,, ,,,,,(,,,(, ,) ,,,;,,,,,,:(,),,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,, ,,, ,,,,,,,, ,,,,,;,,,, ,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,, ;,,,,,, ,, ,,,, ,;,, ,,, ,, ,,, ,, ,,,,,;,,,,,,, ,, ，,,((,),,,, ,,,, ,,, ,,,,,,,;,,,,, ,,,,;,, ,, ,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,, ,, ,,,,—,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,((,),,, ,,,,,,, ,,,, ,,, ,,,,;,, ,, ,,,, ,, ,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,((,),,,, ,,,, ,,, ,,,,,,,;,,,,, ,,,,;,, ,, ,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,, ,, ,,,,—,,,,,,,,, ,,,,,,,,((,),,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,, ,,,,,,,, ,, ,,,;,,,, , ,,,,,,,,,,,,;,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,, ,, , ,;,, ,,,,, ,, ,,, ,, ,,, ,,;,,,,,, ,, ，,, ,,,, ;,,,,,,,,, ,,, ,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,; ;,,,,,,,,,,，,,,;, ,, ,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,( ,,, ,,,,:,,,,,,,;,，;,,,,,,,,,,，,,,;,,,,，,,,,,,,, , ,,;,,,,,，,,,,,;,, , 重庆医科大学硕士研究生学位论文,,,、,,,,在，,,胎盘胆酸转运中的作用机制研究 前言 妊娠肝内胆汁淤积症(,,,,,,,,,,,; ;,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,;,，，,,)是一种特发于妊娠期的胆汁淤积，多发生在妊娠中晚期。临床上主要以皮肤瘙痒、黄疸、血清胆汁酸水平升高，转氨酶轻度升高，产后症状迅速消失为特征。其对母体无严重影响，但可引起胎儿窘迫，早产，死胎，死产，增加围产儿发病率和死亡率，增加，,,患者的剖宫产率。 由于，,,对胎儿可产生严重危害，而其病因及发病机制尚不清楚，促使许多研究者多年来致力于其病因、发病机制及治疗的研究。目前认为其发病可能与雌激素，遗传，免疫及环境等因素有关。但这些学说大都单纯从母体角度解释胆汁淤积的发生机理，而很少从母胎之间的重要代谢器官一胎盘，对胆酸代谢的影响进行探索。胆汁酸的转运是胆汁形成的重要驱动力，参与胆汁酸代谢所有分子都可能成为，,,的病因。如,,,,、,,,、,,,,及,,,,均可影响胆酸代谢。所有这些分子的变化都可能成为改变币常月日酸代谢及在妊娠傲素影响下出现胆汁淤积的理由。近年来，有学者认为，,,应是一种有关母体、胎儿的胆酸通过胎盘转运发生异常导致的胎儿,母体疾病。故胆酸在胎儿一胎盘单位的代谢紊乱可能是，,,的发病机制，”。 ,,,是一种孤儿核受体，是核受体超家族成员之一，为配体依赖的转录因子。核受体需要与相应配体结合后才能活化或抑制靶基因的表达。近年发现它是内源性胆汁酸的感应器，生理浓度的鹅脱氡胆酸(;,,,,,,,,,;,,,; ,;,,，,,,,)、石胆酸(,,,,;,,,,; ,;,,，,,,)、脱氧胆酸(,,,,,;,,,; ,;,,，,,,)都能激活,,,，其中鹅脱氧胆酸为最有力的激后体。研究表明,,,主要在肝、肾、肠、肾 上腺表达。正常妊娠时胎盘上存在着,,,的阳性表达，这些表达出现在滋养细胞的顶侧面，即滋养层细胞膜的母面，可能参与了胆酸从胎儿向母体侧的转运过程。,,,与视黄醇,受体(,,,,,,; , ,,;,,,,,，,,,)结合成异源二聚体，再结合到相应的,,,反应元件(,,,,,,,, ,,,,,,，，,(,)，该反应元件(，,(,)是以一个核苷酸为间隔的反 , 重庆医科大学硕士研究生学位论文向重复序列，从而调节靶基因的表达,,,。但,,,在胎盘胆汁酸转运中的作用机制尚不清楚。 ,,,,(又名,,,,,)为多药耐药基因，位于,号染色体长臂,区,号带，主要存在于肝细胞胆管膜上，人的正常胎盘亦上有表达，在妊娠晚期,,,,表达上调为妊娠早期的四倍〔,,,,】。由,,,,基因编码翻译的,,,,一,糖蛋白(,—,,,;,,,,,,,,，,—,,)充当,,,依赖的磷脂弹跳酶，将磷脂酰胆碱(,,,,,,,,,,,,;,,,,,,，,,)从肝小叶胆管膜内转运到膜外【,,】。胆汁中的卵磷脂有助于胆固醇的溶解，防止疏水的胆固醇分子在胆道内形成胆固醇性结石;胆盐是一种天然的离子型去垢剂，卵磷脂可灭活其去垢活性，防止其对肝脏及胆道上皮细胞的损伤【,,】。人类的,,,,与小鼠的,,,,基因具有高度同源性，两者编码的,(,,氨基酸序列,,,相同，,”。,,,,敲除的鼠,,的分泌减少，改变了胆汁酸的吸收、,,,转运体的合成及对胆管膜的调控，这些作用对肝脏的结构和功能产生继发性影响，导致胆汁淤积【, ,,。,,,,的表达除了受激素，细胞间的压力及一些外源性物质的影响外，,,,也能调节,,,,的表达，,,,,,,,,可结合到,,,,启动子远端高度重复的保守序列上，从而傲活,,,,启动子【阍。如肝脏,,,减少，,,,,则表达下调，就可能出现胆汁淤积。究竟,,,及,,,,在胎盘的胆汁酸转运中起什么作用，,,,的配体一胆酸，在胎盘组织中如何调节,,,及,,,,的表达，目前尚未见国内外报道。 大量研究表明，雌傲素(,,,,,,,,,,,,,,，,,)在，,,的发病过程中起到重要作用。它通过?降低,,，,,，,,,,酶的活性，使胆汁流量降低，胆盐转运受到阻碍:?降低细胞膜的液态流动性，使胆盐通过发生障碍;?增加胆管的渗透性，使胆汁逆向扩散;?通过肝雌激素受体介导使胆酸载体数量及活性改变，使胆盐排泄下降;同时，雌傲素代谢产物的增加，使胆酸载体竞争性抑制物增多而导致胆酸的淤积。雌激素会否因改变了,,,、,,,,的表达，而导致胆汁淤积呢, ，,,的药物冶疗中熊脱氧胆酸(,,,,,,,,,;,,,; ,;,,，,,,,)是唯一既能使患者症状减轻，又能改善肝功能及胎儿预后的药物，它能通过;,,，和,,,(蛋白激酶,)依赖性途径傲活胆管细胞的胞吐作用，同时增加,,,,(多药耐药相关蛋白)在胆管细胞膜上表达的密度，从而促进胆汁的分泌,?,。但其作用机制至今尚不完全清楚。它能否通过调节胎盘处,,,、,,,,的表达来发挥治疗作用呢, ,, 重庆医科大学硕士研究生学位论文 因此，本研究将,,、,,,,及,,,,作用于体外培养的绒毛组织，以了解,,,在胎盘处与,,,,的关系，以及,,、,,,,及,,,,对,,,及,,,,的调节。从胎盘角度研究,,,、,,,,在，,,发病机制中的作用及,,,,发挥治疗作用的机制。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 第一部分 ,,，,,,,,,,在正常孕妇及妊娠肝内胆汁淤积患者 胎盘中的表达及意义,材料与方法,(,研究对象 选择,,,,年,月,,,,,年,,月在重庆医科大学第二临 床学院住院分娩的产妇，共,,例。分为两组进行研究: 【,】正常妊娠组:正常孕妇,,例，为随机抽取正常晚期妊娠住院，均为单胎无妊高征，乙肝，糖尿病及其他内科疾病，无皮肤瘙瘁及黄痘，肝肾功能正常。 【,】，,,组:,,例，参照,,,,,诊断【,,:?妊娠中晚期出现皮肤瘙瘁;?肝功能显示转氨酶,,,、,,,轻、中度升高，可达正常值的,,,,倍，血清胆汁酸浓度显著升高，可达正常值的,,,倍;?黄疸者，血清总胆红素及直接胆红素升高，总胆红素波动在, ,,, ,,,,,,左右，如超过,, ,,,,,,则可除外，,,;?妊娠是皮肤瘙痒、黄疸及生化指标异常的唯一原因;?无呕吐、严重食欲不振、衰弱、出血及肾功能衰竭;?所自症状及生化异常在产后,,,周内恢复正常。 【,】两组产妇的年龄、胎次、产次及胎儿出生时孕周比较(见表,(,)表,,, ,,,组与正常组—觳情况比较(,,，,,) 组剐 例数 母亲年龄 胎次 胎儿孕周，,,组 ,, ,, ,,:,:?,,, , ,,，,(,,, ,, ,,，,(,,,正常组 ,, ,, ,,,,:, ,,, , ,,:,:, ,,,, ,:， ,,,” ?与，,,组比较,,,(,,,(,材料 取两组剖宫,, ,,, 产分娩时的胎盘，约,(,,,(,,,(,;,,，用锡箔纸包裹，放入液氮中保存。,(,主要试剂 ,, 重庆医科大学硕士研究生学位论文 ,,,,,,, ,,,,,,,:成都天泰一上海华舜 ,,,,,,试剂盒(,,,,,,) ,,, ,,,,,,:,,,,,,为,,,,,,公司产品 ,,,,:北方同正生物技术发展公司 异丙醇(,,,,,,,,,,,)(美国,,,,,公司) 氯仿(;,,,,,,,,,)(美国,,,,,公司) 琼脂糖(大连宝生物) 溴化乙锭(,,)(重医附二院肝炎所) 引物:由成都天泰生命科技有限公司合成。,(,主要仪器设备 ,,,,,，,, ,,,,,,,电子天平:上海精密科学仪器有限公司 微量加样枪:,,,,,,,,,,,‖,,叫,,,“,门,,,一(德国) 低温离心机:,,,,; ,,,,，日本,，,,,,， ,,,紫外光栅分光光度计:上海第三分析仪器厂 ,,,仪:,，,—,,, ,,,, ,,;,,,,, 电泳仪:,,,,，,,,(,,,，美国 数字化凝胶成像分析仪:,,,(,,, ,,; ,,, ,,,,，美国 超净工作台:苏州 超纯净水产生系统:,,,,,,,,,,,,, ,,,，美国 ,,,,,,,,,,,担矗埃恚胂 竟 阂陨 ?光学显微镜:,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,(,实验方法 用,,,,,,检测正常组及，,,组胎盘,,,和,,,,,,,,,(,(,组织,,,抽提和,,,,,,, , ,(,实验材料的处理 【,】所有耗材以含, ,,焦碳酸二乙酯(,,,,)的水浸危,,,，然后高压灭菌除去残留的,,,,，烤干; 【,】无,,,酶纯水以,(,,,,,,处理,,,，然后高压灭菌除去残留的,,,,: ,, 重庆医科大学硕士研究生学位论文 【,】实验时戴口罩，勤换一次性手套。 【,】主要试剂配制 , ,,,,,,缓冲液(用,,,试剂盒中附带的) , ,×〕,,,样缓冲液 甘曲 ,,, , ,,,,,, ,,, ,,,,,, ,,, 溴酚蓝, ,, 二甲笨青, ,, ,,(, 至,,,, 溶解后，分成,,,的小份，保存于(,,? , ,,,,,,,溴化乙锭 溴化乙锭,, ,, ,,,,, 溶解后，装于棕色瓶内并用锡纸包裹，保存于,”,。 , ,,,,,, ”，,, ,,,, , ,,,,,,(,,, ,, ,,,, 醋酸 ,,(,,, ,,(, ,,,, 溶解后，将,,值调节至,(,，加 ,(,(,定容至,,,,,，室温保存。,(,(,(,总,,,提取.