尿酸酶

尿酸酶 尿酸是鸟类、爬行类和包括人在内的灵长类动物体内嘌呤代谢的终产物，因为在这些动物体内缺乏以分子氧为受体催化尿酸进一步分解为尿囊素、CO和2HO的尿酸酶。尿酸作为人体嘌呤代谢的终产物经肾脏排泄，当尿酸生成超过22 肾脏排泄时，例如富嘌呤食物摄入过多以及白血病和淋巴瘤及其化疗过程所引起的嘌呤代谢剧增;或者当肾脏处于病理状态时使正常产生的尿酸排泄受阻，这两种状况都会造成血浆尿酸显著升高，形成高尿酸血症。由于尿酸及其盐类在血液中的低溶解度和易沉积性就使得高尿酸血症会引发或加剧很多疾病，例如:持续高尿酸血症时尿酸结晶沉积在外周关节、滑膜引起的急性炎症和疼痛是痛风的主 [1-2]要病因;尿酸可刺激血管平滑肌细胞增殖，导致内皮细胞功能障碍;血浆高 [3-5]尿酸也是动脉粥样硬化等心血管疾病的重要危险因素;尿酸沉积在肾组织， [6-7]是引发急性肾衰、肾小管损伤、Ig A肾炎的主要因素。因此，血清尿酸水平的测定对于上述疾病的实验诊段具有重要意义，而当前血尿酸水平的测定普遍采用基于尿酸酶配制的试剂盒进行，所以对尿酸酶的需求量很大;另一方面治疗上述疾病，降低血尿酸水平也是关键所在，经典的降尿酸是用别嘌呤醇等黄嘌呤氧化酶抑制剂类药物降低尿酸生成，或用丙磺舒、苯溴马龙等药物促进尿酸排泄。黄嘌呤的水溶性低于尿酸，其积累有潜在的危险，黄嘌呤氧化酶抑制剂在初始尿酸浓度太高时疗效很差，还能引发超敏综合征，表现为发热、毒性上皮细胞坏死溶解、肝炎和嗜酸细胞增高，死亡率达20%，另外这类药和丙磺舒、苯溴马龙等促尿酸排泄类药都有明显肝肾毒性。因此，经典的降尿酸治疗策略不够安全而且疗效也不够理想。尿囊素的优良水溶性和肾脏对尿囊素的高效排泄能力使尿酸酶成为治疗高尿酸血症及其继发症的理想药物:临床研究表明尿酸酶可快速高效降低血清尿酸，且几乎没有毒副作用;在治疗肿瘤裂解综合征时，尿酸酶比别嘌呤醇更安全有效;用于治疗痛风，能快速分解关节处沉积的尿酸从而消除引发的炎症和皮肤损伤。 尿酸酶是一种新型的降尿酸药物，它以促进尿酸分解为药物特征。因此从药物生产来说，对尿酸酶的需要量也很大。由此可知，尿酸酶实在是一种很重要的医药用酶，做好相关产品的开发，具有较高的社会经济效益。 由于天然提取的尿酸酶量少不能满足需求，人们运用基因手段对其进行大量生产。目前国外已有多种来源的尿酸酶基因得到克隆表达并商品化，广泛用于诊断试剂盒的配制，其中一种重组黄曲霉尿酸酶(商品名:拉布立酶)被欧美批准用于临床预防治疗肿瘤溶解综合征。但是尿酸酶又是一种外源蛋白，直接或重复使用易引发抗体降低疗效，而且易过敏，需静脉注射，仅适于短期使用以降低尿酸(如使用拉布立酶治疗时间不能超过一个月)。所以对于长期治疗，显然需要长效且无免疫原性的尿酸酶制剂，PEG化尿酸酶能够解决应用天然酶时遇到的 这些问，国外这方面的研究也进行了很多，最引人注目的是美国杜克大学和山景制药公司合作研制的PEG-重组类猪尿酸酶结合物，其二期临床试验取得十分可喜的结果，现已进入三期临床试验阶段，预计能够成为治疗高尿酸血症及其继发症的特效药物。当前国内的尿酸酶相关研究比较落后，虽然也有相关尿酸酶基 [8-12]因克隆高效表达的报道，但商品化程度远不如国外，还是要大量进口国外产品以满足临床需求;另一方面作为尿酸酶产品开发较高层次的PEG化尿酸酶药物的研制在我国更是罕见报道，这固然有国外专利保护限制的原因，但我国尿酸酶国产化商品化程度低下也是一个重要的制约因素。面对我国受高尿酸血症及其继发症侵害的人群日益增大的事实，加快我国同类药物的研发尤为迫切。所以一方面要以低成本进行尿酸酶大规模生产促进其国产化商品化，另一方面要抓紧进行深层次的研究开发。 本文研究了重组Candida utilis尿酸酶的原核表达条件优化，包括IPTG诱导条件的优化和乳糖替代IPTG诱导的条件优化;重组尿酸酶的分离纯化以及用(mPEG)-Lys-NHS(M.W 20kDa)对其进行修饰前后的酶学性质比较。希望通过以2 上研究，能够为低成本大规模生产重组尿酸酶和PEG化尿酸酶药物开发提供一些有用的实验基础。下面在各章节中分别对这几个部分做较为详细地探讨。