血浆（1-3）-β-D-葡聚糖对深部真菌感染诊断的研究

血浆（1-3）-β-D-葡聚糖对深部真菌感染诊断的研究 血浆(1-3)-β-D-葡聚糖对深部真菌感染诊断的研究 血浆(1-3)-β-D-葡聚糖对深部真菌感染诊断的 研究摘要:目的:观察血浆(1-3)-β-D-葡聚糖对深部真菌感染诊断的作用。方法: 将2005年8月至2006年6月北京友谊医院患者145例(标本182份)分为深部真 菌感染组和无深部真菌感染组, 比较两组葡聚糖水平;使用ROC曲线确定最 佳临界值。结果:深部真菌感染组的葡聚糖水平64.7?86.0(25.5)pg/ml明显高 于对照组6. 3?21.0(0.0)pg/ml(P0.001);血浆葡聚糖用于诊断深部真菌感染的 ROC曲线下面积为0.887(95%的置信区间为0.795-0.979),使用临界值13.7pg/ml 诊断深部真菌感染的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为88.9%、 90.2%、50.0%和98.7%;Kappa值0.588(P0.05)。结论:血浆葡聚糖水平可用于诊 断深部真菌感染,本研究使用GKT-5M Set动态真菌检测试剂盒检测血浆葡聚糖水 平诊断深部真菌感染的最佳临界值为13.7pg/ml,使用此临界值对深部真菌感染 进行诊断的一致性较好。 关键词:深部真菌感染;诊断;1-3)-β-D-葡聚糖;ROC曲线 Evaluation about diagnosis of invasive fungal infection with 1-3-β-D-glucan ZHAO Yong, WANG Hong , REN Aimin , ZHANG Shuwen, ZHANG Lixia. Beijing Capital University of Medical Sciences Affiliated Beijing Friendship Hospital , Beijing 100050 , China Abstract: Objective: To evaluate the diagnosis of invasive fungal infection with 1-3-β-D-glucanBG. Methods: 145 patients from Beijing Friendship Hospital were divided into two groups according to whether or not diagnosed as invasive fungal infection. Level of 1-3-β-D-glucan of two groups were compared. Optimal cut-off value was established with ROC curve. Results: Patients diagnosed as invasive fungal infection have a higher level of BG than the control group. P value 0.001 Area under curveAUC was 0.887 95% confidence interval between 0.795 and 0.979 when level of BG was used to diagnose invasive fungal infection. The sensitivity, specificity, and positive and negative predictive values for BG were 88.9%、90.2%、50.0% and 98.7%, respectively, with Kappa value of 0.588. Conclusion: Level of BG could be used for diagnosis of invasive fungal infection. Optimal cut-off value of plasma BG with GKT-5M Set for diagnosis of invasive fungal infection should be 13.7 pg/ml and, with this cut-off value, agreement of evaluation of BG and criterion of invasive fungal infection for diagnosis of invasive fungal infection was good. Key words: invasive fungal infection; (1-3)-β-D-glucan; diagnosis; ROC curve 随着免疫抑制患者的增多,临床中发生深部真菌感染的机会也越来越 多。一般来说,深部真菌感染通常发生于危重患者,对于这些患者的治疗是否成功 很大程度上取决于是否能快速的识别入侵的病原。近年来出现一些快速诊断技术: 如高分辨CT(HRCT)及象检测真菌抗原和核酸这样的非培养诊断技术。这些技术 与Prentice[1]提出的深部真菌感染危险分层相结合使得深部真菌感染早期诊 断和及时治疗成为可能。其中通过检测体液中真菌抗原或代谢物来诊断深部真菌 感染的研究很多[2],其中之一就是关于真菌的细胞壁成分??(1-3)-β-D-葡聚糖。本研究的目的是比较这种新的深部真菌感染检测方法与传统实验室的培养方法之间的关系,评价如何可以更准确的诊断深部真菌感染。 1、材料与方法 1.1 病例选择 北京友谊医院感染内科2005年8月至2006年6月住院肺炎患者以及感染内科会诊全院其他科室诊断为可能真菌感染的患者共145例(其中男88例,女57例),平均年龄65.1岁(17-85岁),其中诊断为真菌感染患者(真阳性)共14例,诊断按照欧洲肿瘤研究治疗组织(EORTC)深部真菌感染合作组(IFICG)和国家过敏及感染类疾病研究所(NIAID)真菌病研究组(MSG)对深部真菌感染的定义和分类进行判断[3],判断过程结合临床,病例出院后进行总结。按照Mennink-Kersten[4]的研究,只有确诊和高度疑似深部真菌感染才被认为真阳性,只有非深部真菌感染被认为真阴性,其中确诊和高度疑似深部真菌感染患者的一般信息详见表1。 1.2 标本采集 感染内科入选患者进行抗生素治疗一周后采血,分送血浆葡聚糖检和血真菌培养,同时送检痰、尿、便真菌培养及真菌涂片,特殊患者留取腹水和脑脊液真菌培养。取样过程监测保持尽量无菌原则以减少污染,样本由我院实验室标准真菌培养基接种,真菌的识别使用传统方法[9]。全院其他科室诊断可能深部真菌感染的患者立即采血及留取其他标本同前,视病情情况决定一周后是否再次留取标本。共留取用于检测血浆葡聚糖的标本182份,其中来自确诊病例和高度疑似病例(真阳性)共18份,其余为可能感染病例(18份)和无真菌感染病例(146份, 真阴性)。 1.3 仪器与试剂 MB-80微生物动态快速检测系统、T01智能恒温仪、冰浴槽以及GKT-5M Set动态真菌检测试剂盒,均由北京金山川科技发展公司提供。 1.4 血浆1,3-β-D葡聚糖检测方法 1,3-β-D葡聚糖可以被G因子检测出来,G因子是马蹄蟹的一种凝血因子。[5]本研究利用真菌β葡聚糖激活酶反应主剂中的相应因子后形成凝固蛋白,根据其浊度变化对真菌β葡聚糖浓度进行定量。具体步骤为:用无热原抗凝采血管采取静脉血2ml,3000转离心1分钟,取上清0.1ml,加入0.9ml的样品处理液D中,混匀后置于70?恒温10分钟,取出后立刻放入冰水浴中,为待测血浆样品。待测血浆样品0.2ml直接加入酶反应主剂A中,溶解后移液至标准玻璃反应管中,插入MB-80微生物快速动态检测系统中进行反应,1小时后自动计算待测血浆中真菌β葡聚糖含量。厂家提供的血浆中真菌β葡聚糖正常值为10pg/ml。 1.5 统计分析 应用统计软件包SPSS 11.0进行统计学描述及检验,深部真菌感染组与非深部真菌感染组的血浆葡聚糖水平为非正态分布,记录为(?S(中位数))形式,采用独立样本秩和检验(Mann-Whitney),取P0.05为具有统计学差异。另绘制利用血浆葡聚糖水平及培养真菌、涂片真菌是否阳性诊断深部真菌感染的ROC曲线,依敏感度和特异度需要,确定本方法检测血浆葡聚糖诊断深部真菌感染的最佳临界值,其后使用诊断实验的一致性检验Kappa值判断一致性满意度,取P0.05为具有统计学差异。 2、结果 深部真菌感染组的葡聚糖水平64.7?86.0(25.5)pg/ml明显高于无深部真菌感染组的葡聚糖水平6. 3?21.0(0.0)pg/ml (P0.001),差异有明显统计学意义。 血浆葡聚糖用于诊断深部真菌感染ROC曲线下面积为0.887(P0.05),95%的置信区间为0.795-0.979。其与单纯依靠各种标本真菌培养或真菌涂片是否阳性对深部真菌感染的提示作用相比如图1所示,后两者的ROC曲线位于葡聚糖的曲线下方,其曲线下面积分别为0.840(95%置信区间0.744-0.936)和0.833(95%置信区间0.738-0.927),提示血浆葡聚糖水平对深部真菌感染诊断的准确性好于单纯依靠各种标本真菌培养或真菌涂片是否阳性对深部真菌感染的判断。 不同血浆葡聚糖水平作为界值的敏感度和特异度详见表2。结合单纯依靠各种标本真菌培养是否阳性判断深部真菌感染的敏感度和特异度,本研究认为GKT-5M Set动态真菌检测试剂盒检测血浆葡聚糖水平诊断深部真菌感染的最佳临界值为13.7pg/ml。而以血浆葡聚糖水平13.7pg/ml为临界值对深部真菌感染的诊断敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确率分别为88.9%、90.2%、50.0%、98.7%和90.1%,一致性检验Kappa值为0.588(P0.05),提示其对深部真菌感染诊断的一致性较好。而涂片真菌阳性和培养真菌阳性对深部真菌感染诊断的Kappa值分别为0.397和0.449,提示单纯依靠涂片真菌阳性诊断深部真菌感染的一致性不理想,而培养真菌阳性的诊断作用亦不及血浆葡聚糖的作用,只能结合临床进行分析。 3、讨论 随着医疗技术的发展,危重患者的生存时间越来越长,广谱抗生素广泛 的用于危重患者感染的降阶梯抗炎治疗,免疫抑制剂的应用改善了器官移植患者的器官排异,但深部真菌感染(invasive fungal infection, IFI)亦较前更常见。尽管进行有力的抗真菌治疗,深部真菌感染的死亡率仍居高不下,原因之一就是深部真菌感染的早期诊断困难,从而造成抗真菌治疗的延迟。一部分深部真菌感染的诊断是在尸检时才确立的。抗真菌治疗的尽早进行对深部真菌感染的预后置关重要[6]。传统的诊断方法通常敏感性差,作为金标准的组织病理学和深部组织培养通常由于其有创性,在血小板减少和凝血功能异常以及其他类型的危重患者并不适用,在国内也时常为患者及家属拒绝,导致确诊病例很少[3]。本研究的真阳性病例16例中确诊病例仅1例,为腹水培养及连续5次血培养均为白色念珠菌,而且抗真菌治疗有效,从而明确诊断,全部病例中并无深部组织病理确诊病例,与既往文献的报道是一致的。其余15例均为高度疑似深部真菌感染,其中有2例微生物学并无阳性发现,但临床表现符合深部真菌感染,广谱抗生素抗炎无效,试用抗真菌治疗后病情好转,本研究中诊断为高度疑似深部真菌感染,对EORTC/IFICG和NIAID/MSG关于深部真菌感染的定义和分类中缺少抗真菌治疗反应进行补充,有待于进一步研究确定其合理性。 本实验为临床前瞻性实验,目的是分析血浆葡聚糖水平对深部真菌感染诊断实验的准确性,确定其是否可以用于早期诊断深部真菌感染。(1-3)-β-D-葡聚糖是一种多聚糖成分,特异的存在于除结合菌和隐球菌外的其他真菌[7]。原核生物、病毒和人类的细胞都没有葡聚糖,如果其出现在血和其他无菌体液中就提示深部真菌感染,常见的病原为曲霉菌和念珠菌,通过葡聚糖水平测定都可以检测出来,甚至有报道卡氏肺囊虫感染时葡聚糖水平也会出现升高,可能与其具有真菌的特征有关。[10]。而有研究表明[11]新型隐球菌产生葡聚糖少于念珠菌 和曲霉菌,而曲霉菌感染时葡聚糖上升的程度与宿主免疫力和病原的数量有关,只要霉菌被厚壁的纤维组织包绕,葡聚糖就不能进入血中。而本实验的病例尚未包括曲霉菌和隐球菌感染,可能与收集病例数量少有关,有待于扩大病例数量后进行观察。尽管有许多试剂盒可以检测葡聚糖,但在除日本外的其他国家经验有限,国内目前上市的葡聚糖检测手段有金山川公司的比浊法,一些国内的研究证明其可以有效的诊断深部真菌感染。本研究深部真菌感染组的血浆葡聚糖水平明显高于对照组,提示其对深部真菌感染的诊断有一定的可行性。加之其标本采取方法较严格的传统培养或病理标本采取方法更为方便,在临床中有很大的开发和研究价值。 Odabasi[8]按葡聚糖高于60pg/ml为阳性指标,对98例血液肿瘤患者进行每周两次的筛选。在所有证实深部真菌感染的患者中(6例念珠菌血症,1例镰刀霉感染,1例丝孢酵母菌感染)及高度疑似深部真菌感染的患者中以出现至少1例的样本阳性确定诊断,凭借葡聚糖先于临床诊断平均4天。对于确诊和高度疑似的感染,单次阳性的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为100%、82%、40%和100%。两次阳性的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为60%、93%、50%和95%。本研究按葡聚糖高于13.7pg/ml为阳性指标单次阳性的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为88.9%、90.2%、50.0%、98.7%,与文献的报道相差不大,但临界值相差较大,考虑可能与试验方法不同有关,本文的临界值是由样本与G因子反应后通过比浊法测定并计算得出,是否可与其他文献的临界值进行比较或用于作为其他方法(如ELISA)得出的血浆葡聚糖水平的正常值有待于进一步在相同样本上测定比较后决定。本研究提示血浆葡聚糖水平对深部真菌感染诊断的准确性好于单纯依靠各种标本真菌培养或真菌涂片是否 阳性对深部真菌感染的判断,分析原因主要是后两者在阳性的情况下不能区分感 染和定植,而需要依赖于临床的评价;有研究提示[11],真菌在口腔、尿路、支气 管的定植并不会导致血浆葡聚糖升高到20pg/ml以上,从而在鉴别真菌感染和真 菌定植方面更少依赖临床的评价。 4、结论 血浆葡聚糖水平可用于诊断深部真菌感染,本研究使用GKT-5M Set动态 真菌检测试剂盒检测血浆葡聚糖水平诊断深部真菌感染的最佳临界值为 13.7pg/ml,使用此临界值对深部真菌感染进行诊断的一致性较好。 致谢 感谢北京友谊医院感染内科实验室文艳老师和王婧同学在实验室技术 方面提供的帮助,感谢金山川公司及时提供的试剂及技术支持。 参考文献 1 Prentice, H. G., C. C. Kibbler, and A. G. Prentice. 2000. Towards a targeted, risk-based, antifungal strategy in neutropenic patients. Br. J. Haematol. 110:273?284. 2 Hopwood V, Evans EGV. Serological tests in the diagnosis and prognosis of fungal infection in the compromised patient. In: Warnock DW, Richardson MD, eds. Fungal infection in the compromised patient. New York: John Wiley, 1991:311-53. 3 Ascioglu, S., J. H. Rex, B. de Pauw, et al. 2002. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clin. Infect. Dis. 34:7?14. 4 Mennink-Kersten, M. A. S. H., J. P. Donnelly, et al. 2004. Detection of circulating galactomannan for the diagnosis and management of invasive aspergillosis. Lancet Infect. Dis. 4:349?357. 5 Tamura,H., Arimoto,Y., Tanaka,S., et al. Automated kinetic assay for endotoxin and 1-3-β-D-glucan in human blood. Clin Chim Acta. 226:109-112 6 von Eiff, M., N. Roos, R. Schulten, et al. 1995. Pulmonary aspergillosis: early diagnosis improves survival. Respiration 62:341?347. 7 Miyazaki, T., S. Kohno, K. Mitsutake, et al. 1995. Plasma 133-beta-D-glucan and fungal antigenemia in patients with candidemia, aspergillosis, and cryptococcosis. J. Clin. Microbiol. 33:3115?3118. 8 Odabasi Z, Mattiuzzi G, Ostrosky-Zeichner L, et al. Detection of 1,3-b-Dglucan BG in the serum of leukaemia patients with invasive fungal infections [abstract M-902]. In Proceedings of the 42nd Intersciences Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy American Society of Microbiology; 27-30 September 2002; San Diego, California, USA p. 396. 9 Barnett,J., Payne,R., Yarrow,D., Yeasts: Characteristics and Identification Cambridge: Cambridge University Press. 10 Edman JC, Kovacs JA, Masur H, et al. Ribosomal RNA sequence shows Pneumocystis carinii to be a member of the fungi. Nature 1988; 334: 519-22. 11 Obayashi, T, Yoshida, M. Plasma 1-3-beta-D-glucan measurement in diagnosis of invasive deep mycosis and fungal febrile episodes. Lancet 1995; 345:17-20 表1 深部真菌感染患者病例情况 编号 年龄 性别 原发病诊断 广谱抗生素 使用激素 免疫抑制剂 影像学 标本来源 微生物证据 有否真菌感染 转归 葡聚糖 pg/ml 1 81 男 AHP、MODS、肺炎 是 否 否 左肺斑片影、双侧胸水 咽拭子 白色念珠菌 probable 好转 28.830 2 76 男 SBE 是 否 否 无改变 痰、尿、CSF 白色念珠菌、热带念珠菌 probable 好转 23.950 3 71 男 肺炎、ARF、上消出血 是 否 否 左肺斑片影、双侧胸水 痰 白色念珠菌 probable 死亡 0.000 4 85 女 胆管癌、肝转移、双肺炎、DIC 是 否 否 右肺斑片影、双侧胸水 痰 白色念珠菌 probable 死亡 0.000 5 77 男 肺梗塞、双肺炎 是 否 否 双肺斑片影 痰 热带念珠菌 probable 死亡 26.970 6 78 男 肺炎、肺癌? 是 否 否 双肺斑片影、胸水、右下肺空洞 痰 热带念珠菌、克柔念珠菌 probable 好转 51.870 7 64 男 慢支、肺炎、胸膜炎 是 否 否 左下斑片影 痰 白色念珠菌、其他念珠菌 probable 好转 23.780 8 64 男 肺炎、脑梗塞 是 是 否 右下肺实变 痰、支气管灌洗液 白 色念珠菌 probable 好转 118.500 9 72 男 肺炎、显微镜下多血管炎 是 是 否 左下肺斑片影 痰 其他念珠菌 probable 好转 13.830 10 69 女 泌感、房颤、脑梗塞 是 否 否 左下肺斑片影 痰、尿 热带念珠菌 probable 好转 58.370 11 75 男 肺炎、风心病、呼衰 是 否 否 右肺斑片影 痰 热带念珠菌 probable 死亡 217.100 12 74 男 胃癌、食道转移、膀胱癌 是 否 否 右肺斑片影、双侧胸水 痰 其他念珠菌 probable 死亡 18.130 13 74 女 腹膜炎、尿毒症 是 否 否 无改变 无 无 probable 好转 18.180 14 49 男 肺炎 是 是 否 左肺斑片影 无 无 probable 好转 18.830 15 62 男 肺炎、MODS 是 是 否 双肺斑片影 痰 白色念珠菌 probable 死亡 44.610 16 75 女 尿毒症(血透)、腹膜炎 是 否 否 双肺斑片影 腹水、血 白色念珠菌 proven 好转 315.200 AHP:急性出血坏死性胰腺炎;SBE:亚急性心内膜炎;MODS:多脏器功能不全综合征;ARF:急性肾功能不全 表2 不同血浆葡聚糖水平作为界值与其他诊断标准的敏感度和特异度比较 血葡聚糖(pg/ml) 培养阳性 涂片阳性 13.7 17.3 17.9 28.7 113.4 157.3 敏感度 88.9% 83.3% 77.8% 44% 22.2% 16.7% 88.9% 88.9% 特异度 90.2% 92.1% 92.7% 93.9% 98.8% 100% 79.1% 77.6%