细胞工程动物组织和细胞培养

细胞动物组织和细胞培养 三 培养细胞的生物学特征 洋蔥的皮細胞 (一)体外培养细胞的分型 1 贴附型: 大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞. 有机体的绝大多数细胞必须粘附于一固相表面才能生存和生 长 按照培养细胞的主要形态，可分为几大类型 1)成纤维细胞型: 胞体呈梭型或不三角形，中央有卵 圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。 例 心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮 成纤维细胞 2)上皮细胞: 细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形 核，细胞彼此紧密相连成单层膜。 如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、 肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。 上皮型细胞 3、游走细胞型: 呈散在生长，一般不连成片，呈活跃游走或变形运动， 方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区 别。如单核细胞 、嗜酸性粒细胞 4、多型细胞型: ? 有一些细胞，如神经细胞难以确定其规 律和稳定的形态，可统归于此类。 2 悬浮型: 见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞 及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上， 呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。 (二)培养细胞的生长和增殖过程 1 培养细胞生命期(Life Span of Culture Cells) 所谓培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长 的时间。 1(原代培养(Primary Culture)期: 也称初代培养，即从体内取出组织接种培养 到第一次传代阶段，一般持续1一4周。此期细胞 呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。 ?初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能 活动上相似性大。细胞相互依存性强。 2(传代期: ?初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系 (Cell Line)。 ?在全生命期中此期的持续时间最长。 ?在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能 维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体 细胞系(Diploid Cell Line)。 ?为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期 或传代后早期冻存。 ?当前世界上常用细胞均在不出十代内冻存。 ?一般情况下当传代10,50次左右，细胞增殖逐 渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。 3( 衰 退 期 : ?此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖;细胞形 态轮廓增强，最后衰退凋亡。 ?在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何 一点(多发生在传代末或衰退期)，由于某种因素的 影响，细胞可能发生自发转化(Spontaneous Transformation)。 ?转化的标志之一是细胞可能获得永生性 (Immortality)。 ?细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能 力，这样的细胞群体称无限细胞系(Infinite Cell Line)，也称连续细胞系(Continuous Cell Line)。 ?无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三 期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体 (Heteroploid)。 ?细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也 可能永生性. Transformation 1020 培养细胞生命期 Primary Culture Finite Cell Line Continuous Cell Line 1018 1016 原代培养期1st Subculture 2nd Subculture 1014 1012 Senescence and Cell Death 传代期 衰退期 1010 Subculture Interval Cumulative Cell Number108 Serial Passage 106 0 2 4 6 8 10 12 14 100 Explanation Weeks in Culture 2 组织培养细胞一 代 生 存 期 所谓细胞“一代”一词，系仅指从细胞 接种到分离再培养时的一段时间，如某一 细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传 代153次。它与细胞倍增〔Doubling)不同; 在细胞一代中，细胞能倍增3,6次。细胞 传一代后，一般要经过以下三个阶段: 1(潜伏期(Latent Phase): ?细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状 态的悬浮期。 ?此时细胞胞质回缩，接着是细胞附着或贴附于底物 表面上，称贴壁，悬浮期结束。 ?各种细胞贴附速度不同，这与细胞的种类、培养基 成分和底物的理化性质等密切相关。 ?初代培养细胞贴附慢，可长达10,24小时或更多; 连续细胞系和恶性细胞系快，10,30分钟即可贴附。 ?支持物能影响细胞的贴附;底物表面不洁不利贴 附，底物表面带有阳性电荷利于贴附。 ?另外在贴附过程中，有一些特殊物质如纤维连接 素(Fibronectin)，细胞表面蛋白(Cell Surface Protein:CSP)等也参与贴附过程。 ?细胞接种密度大时潜伏期短。 细胞贴附 2(指数增生期(Logarithmic growth Phase): ?这是细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。 ?一般以细胞分裂指数(Mitotic Index:MI)表示， 即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。 ?一般细胞的分裂指数介于0.1%,0.5%，初代细胞 分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达 3%,5%。 指 数 增 生 期 会 发 生: A 接触抑制:在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续 3,5天后，随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最 后细胞相互接触汇合成片。细胞相互接触后，如培养的是 正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种 现象称接触抑制(Contact Inhibition)。 B 密度抑制:细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要 营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍 在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减 少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响， 则发生密度抑制(Density Inhibition)，导致细胞分裂停止。 3(停滞期(Stagnate Phase): 细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞 期。此时细胞数量不再增加，故也称平台期(Plateau)。 停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液 中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH降低。 此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形 态改变，重则从底物脱落死亡，故传代应越早越好。 当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞 和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程 叫传代(Passage或Subculture)。 三、体外培养细胞的种类 (一)初代培养 初代培养又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组 织和器官进行的第一次的培养物。 一旦已进行传代培养(Subculture)的细胞，便不再称 为初代培养，而改称为细胞系。 (二)细胞系 初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞 系。 如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系(Finite Cell Line);已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连 续细胞系或无限细胞系(Infinite Cell Line)。 无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可 能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。 (三)细胞株 从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培 养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群， 称细胞株。 (四)肿瘤细胞系或株 这是现有细胞系中最多的一类，我国已建细胞系主 要为这类细胞。肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮 型细胞，常已传几十代或百代以上，并具有不死性和异 体接种致瘤性。 细胞系或细胞株的命名 HeLa:为供体患者的姓名(来源于宫颈癌) CHO:中国地鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary) 宫-743:宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立 细胞系或株的鉴定、管理和使用 ATCC入库细胞要求项目如下: 培养简历:组织来源日期、物种、组织起源、性别、年龄、 供体正常或异常健康状态、细胞已传代数等 冻 存 液:培养基和防冻液名称 细胞活力:融解前后细胞接种存活率和生长特性 培 养 液:培养基种类和名称(一般要求不含抗生素)、血 清来源和含量