三角帆蚌瘟病组织病理学动态变化

三角帆蚌瘟病组织病理学动态变化 三角帆蚌瘟病组织病理学动态变化 第35卷第4期 2009年8月 湖南农业大学(自然科学版)Vl01.35NO.4 JournalofHunanAgriculturalUniversity(NaturalSciences)Aug.2009 文章编号:1007.1032(2009)04.0406.06 三角帆蚌瘟病组织病理学动态变化 刘巧林,许宝红,钟蕾,葛熹凯,肖调义' (湖南农业大学动物科学技术学院,湖南长沙410128) 摘要:在人工感染三角帆蚌瘟病病料组织后第3,5,7,9,11天,运用光学显微镜和电子显微镜分别观察了 三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)外套膜,鳃和斧足的病理变化特征.结果明,三角帆蚌瘟病病毒对3种器官组 织有不同程度的破坏作用,外套膜和鳃的病变比较严重,斧足稍轻.光镜下,前5d内各组织结构变化不大;从 第7天开始,出现上皮组织细胞肿胀,排列紊乱,部分脱落甚至完全坏死等显着的病理变化.电镜下,前5d细 胞结构无明显病理变化,只出现了少量的病毒粒子;从第7天开始,病毒粒子数量增加,线粒体,内质网,核糖 体等细胞器解体,细胞空泡化,但斧足的超微结构变化不明显. 关键词:三角帆蚌;三角帆蚌瘟病病毒;外套膜;鳃;斧足;组织病理学 中图分类号:$944.2+21.1文献标识码:A HistopathologicalondynamiccharacteristicsofHyriopsiscumingiiplague LIUQiao-lin,XUbao-hong,ZHONGLei,GEXi-kai,XIAOTiao—yi' (CollegeofAnimalScienceandTechnology,HNAU,Changsha410128,China) Abstract:Thepathologicalchangesofmantle,gillandaxefootwereobservedbyopticalmicro scopeandelectron microscopeatthe3rd,5th,7th,9thandllthdayafterartificialinfectionofHyriops&cumingiiwiththepathological tissueliquid.TheresultsshowedthattheH.cumingiiplaguevirusdamagedthestructureofthethreeorgansinvarying degrees.Thegillandthemantleweredamagedmoreseriouslythanaxefoot.Underopticalmicroscope,thestructureof tissueshadnoobviouschangeswithin5daysofinfection.Fromthe7thday,theepithelialcellswereswellingand arrangedindisorder,evensomeofthemshedorcompletelynecrose.Underelectronmicroscope,thecellshadno significantpathologicalchangesinthefirst5days,buttherehadbeenasmallnumberofvirusparticles.Virusparticles increasedfrom也e7也 day,theorganellessuchasmitochondria,endoplasmicreticulumandribosomedisintegrated,cells wereofvacuolization.Buttheaxefoothadnosignificantchangesintheultra-structure. Keywords:Hyriopsiscumingii:Hyriopsiscumingiiplaguevirus;mantle:gill:axefoot:histopathology 三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)为中国特有淡水 育珠双壳贝类….多年来,三角帆蚌瘟病一直影响 着淡水珍珠产业的健康发展,加剧了水体污染,导 致优质淡水贝类资源的锐减【2.20世纪80年代以 来,针对三角帆蚌瘟病的病原,组织病理及防治方 法等开展了许多研究与探讨[5{】,但一直未能在该病 的有效防治上取得突破,而且在病原的认识上一直 存在病毒与细菌的2种说法.2005年9月,本课题组 在三角帆蚌瘟病流行病学调查中采集到典型症状 收稿日期:2009.03.07 基金项目:湖南省科学技术厅攻关项Et(06NK3049); 湖南省教育厅重点项目(07A012);湖南农业大学青年基金项 目(QN0702) 作者简介:刘巧林(1985一),女,湖南宁乡人,硕士研究 生;通讯作者,tyxl128@yahoo.corn.cn. 的病蚌,根据邵健忠等的病毒分离方法获得病料 组织悬浮液,利用分离所得的悬浮液人工感染健康 三角帆蚌,探讨该病对三角帆蚌外套膜,鳃和斧足 的影响,现将结果报道如下. 1材料与方法 1.1材料 病料组织:从湖南省常德市三角帆蚌养殖场吊 养的已呈明显发病状况且濒死的三角帆蚌取得肝 脏,内脏团(包括胃,肠,肾,心房和心室等),外 套膜,斧足,鳃,放人50%的甘油磷酸盐缓冲液中, 于一2O?低温保存. 健康三角帆蚌:取自湖南常德市三角帆蚌养殖 基地,暂养于湖南农业大学水产基地.三角帆蚌壳 第35卷第4期刘巧林等三角帆蚌瘟病组织病理学动态变化407 长6.8,l9_3cm,壳高4.2,1O.8cm,壳宽1.7,5.2 cm.蚌两壳紧闭,缩足迅速,出水管喷水力强,体 色发白,体质健壮. 1.2方法 1.2.1组织液的制备 取50%甘油磷酸盐缓冲液保存的病料,用生理 盐水冲洗3次,置于消毒研钵内(冰上),加入pH值 7.2的PBS缓冲液1:10稀释匀浆,4?3000r/min 离心30min,取上清液,加双抗(青霉素,链霉素) 各5000IU/mL,4?作用16h.经无菌检查后备用. 1.2.2人工感染 对照组注射灭菌PBS缓冲液(0.5mL/只);试验 组注射上述病料组织液(0.5mL/只),注射部位均为 斧足.注射后置23,28?水中饲养.观察记录. 1.2.3病蚌组织的采集与切片制作 分别于人工感染后第3,5,7,9,11天采集 三角帆蚌外套膜(包括边缘膜和中央膜,本试验以边 缘膜为研究对象),鳃和斧足组织,以健康蚌的相应 部位组织作为对照样品.采集的样品及时用Bouin ,6I.tm)),H.E 氏液固定,石蜡包埋切片(切片厚度4 染色,Moticl300显微镜下观察,拍照.用同样方 法采集样品,经2.5%戊二醛前固定,常规清洗,1% 锇酸后固定,常规梯度丙酮脱水,环氧树脂Epon 8l2包埋,超薄切片,醋酸双氧铀.柠檬酸铅双重染 色,JEM一1230电镜80kV条件下透射拍照观察. 2结果 2.1光镜下外套膜的显微病理变化 光镜下标尺为200nm),边缘膜表皮层有皱褶, 肌肉层的厚度不一,越靠近边缘肌肉层越厚,中间层 分布着血管.边缘膜两侧的结构不x,-t~,即表皮层皱 褶突起和肌肉层在两侧的厚度不一致,靠近贝壳一侧 的外表皮皱褶少,与内脏团接近的—侧的内表皮皱褶 多,构成表皮的柱状细胞游离面有纤毛(图1.1).感染 病毒第3天,外套膜的肌肉层发生细微变化,肌纤维 排列不,其他结构完整(图1—2);第5天结构破坏 不明显,但结缔组织中出现许多嗜酸I生颗粒,并形成 了空白区域(图1—3);第7天分布在结缔组织中的血管 结构清晰,结缔组织断裂形成空白区域(图1-4);第9 天内表皮细胞排列不规则,有的破裂脱落,结缔组织 高度空泡化(图1—5);第11天表皮细胞脱落,肌纤维断 裂,结缔组织中形成空泡(图l一6). 2.2光镜下鳃的病理变化 三角帆蚌的鳃由内外鳃构成,左右对称,外鳃 较内鳃小.鳃瓣由两片鳃小瓣构成,鳃小瓣间空腔 由瓣间隔形成鳃内腔(鳃小管),鳃小瓣由鳃丝间隔 相互连接的鳃丝组成,鳃丝排列整齐,其表面是一 层带纤毛的柱状细胞排列成半椭圆形.鳃内腔的表 皮也是由带顶端纤毛的短柱状细胞构成,在两层之 问由结缔组织连接,血管分布其中(图1.7);感染病 毒后,鳃的病理变化不大,前期鳃结构完整,瓣间 隔,丝间隔和鳃小孔清晰可见,后期鳃丝肿大,排 列不整齐,纤毛不同程度受到破坏,甚至脱落;攻 毒第3天鳃丝和鳃内腔结构无明显变化(图l一8);攻 毒第5天鳃丝表皮细胞肿大,鳃丝排列不整齐,分 布在结缔组织中的血管上皮细胞轻度肿大(图1-9); 攻毒第7天血管无明显变化,结缔组织断裂,鳃丝 排列不整齐(图l一10);攻毒第9天鳃丝结构破坏严 重,表皮细胞脱落,血管细胞肿大,甚至破裂(图 l一11);攻毒第11天鳃丝肿大,结缔组织细胞破裂 形成空白区域,整体结构破坏程度近似第9天的病 变(图1.12). 2.3光镜下斧足的病理变化 在纵切面的组织切片中,斧足主要是由肌肉组 织构成,表面覆盖一层由柱状细胞组成的表皮,并 形成许多的皱褶,表皮下面有一层比较薄的环肌, 中央都是由纵横交错的肌束组成,形成三维的网状 结构,由结缔组织相互连接,具有丰富的血管(图 l一13);攻毒后,斧足的病理变化缓慢,攻毒第3天 肌纤维排列规则,结构完整,无病变(图1.14);攻 毒第5天褶皱排列整齐的表皮下环形肌肉层稍有炎 症表现,整个斧足结构完整,无明显病理变化(图 1.15);攻毒第7天组织结构出现明显变化,肌纤维 断裂形成空白区域(图1.16);攻毒第9天上皮细胞 肿大甚至破裂,嗜碱性颗粒增多,并扩散到肌纤维 中,分布其中的血管变形,甚至与周围的组织脱落 (图1.17);攻毒第1l天病变严重,肌纤维明显断裂, 结构紊乱,形成许多空白区域(图1—18). 第35卷第4期刘巧林等三角帆蚌瘟病组织病理学动态变化409 2.4电镜下外套膜的病理变化 电镜下(标尺为500nm),外套膜中细胞核呈多 面体,核质浅淡,细胞核双膜清晰,核内周围电子 密度深,核酸主要集中在核膜周围.核周围有丰富 的滑面内质网,细胞器不均匀分布在胞质中(图 2.11;攻毒第3天细胞病变不明显,细胞中出现单 l8 l健康蚌外套膜;2攻毒第3天外套膜;3攻毒第5天外套膜;4攻毒第7天外套膜;5攻毒第9天外套膜;6攻毒第11天外套膜;7健 康蚌鳃;8攻毒第3天鳃;9攻毒第5天鳃;10攻毒第7天鳃;ll攻毒第9天鳃;12攻毒第11天鳃;13健康蚌斧足;14攻毒第3天斧 足;l5攻毒第5天斧足;16攻毒第7天斧足;l7攻毒第9天斧足;l8攻毒第11天斧足 cb.细胞核;ER.内质网;VP.病毒粒子;Va.空泡;MF.肌纤维;CT.结缔组织 图2电镜下三角帆蚌外套膜,鳃,斧足的病理变化 Fig?2Pathologicalchangesofmantle,gillandaxefootinHcumingiitheelectronmicroscope , 410湖南农业大学(自然科学版)2009年8月 个病毒(图2.2);攻毒第5天细胞内出现多个病毒粒 子,周围的细胞结构不清晰(图2—3);攻毒第7天细 胞电子密度均匀,无明显病变,细胞内出现单个病 毒粒子(图2.4);攻毒第9天,病毒粒子多,且病毒 粒子周围的细胞结构紊乱,电子密度深(图2—5);攻 毒第11天病毒粒子从细胞中释放,线粒体已经严重 病变,细胞溶解,空泡化(图2.6). 2.5电镜下鳃的病理变化 电镜下健康三角帆蚌鳃的细胞核核孑L明显,核 仁大,核仁周围电子密度大,核外板层状的内质网 排列整齐(图2.7);攻毒第3天细胞核完整,核周围 分布着细胞器,细胞轻度变小,电子密度变小,细 胞质内出现少量的病毒粒子(图2—8);攻毒第5天细 胞肿大,细胞内出现许多空泡,且空泡间分布有病 毒粒子(图2.9);攻毒第7天内质网膨胀断裂,核糖 体脱落,散落于胞质中(图2—10);攻毒第9天细胞 核体积膨大变形,染色质破坏严重,集聚成团弥散 于核内或凝聚于核膜内侧,细胞核内形成许多空白 区域,核周围内质网断裂形成空泡(图2.11);攻毒 第11天胞质内结构紊乱,分布有多个病毒粒子, 且出现大小不一的空泡(图2.12). 2.6电镜下斧足的病理变化 斧足主要由肌纤维组成,由网状疏松结缔组织 连接.电镜下观察到肌纤维纵横交错,电子密度大, 肌纤维之间的结缔组织电子密度小(图2.13);攻毒 第3天电子密度均匀,结构无明显变化,但细胞内 出现空泡(图2—14);攻毒第5天细胞内出现少量病 毒粒子,周围有不规则的空泡(图2—15);攻毒第7 天肌纤维电子密度大,结缔组织稀疏,间隙增大, 并伴有空泡(图2.16);攻毒第9天细胞核双膜清晰, 内质网破裂,溶解,分散在细胞核周围(图2—17); 攻毒第ll天无明显结构变化,未观察到病毒粒子, 但有空泡(图2.18). 3讨论 三角帆蚌瘟病病毒对以肌肉组织构成的外套 膜和斧足有一定程度的破坏.外套膜具有分泌形 成贝壳以及帮助完成呼吸,摄食,排泄等多种功 能10-11】,并能形成珍珠12-13].万夕和等?,付崇罗 等[J5】,艾海新等?以及刘英杰等分别对文蛤 (Meretrixmeretrix),栉孔扇贝(Chlamysfarreri)等外 套膜的病理变化进行了研究,但未见三角帆蚌外套 膜病理变化的报道.笔者对三角帆蚌外套膜的研究 结果与任素莲等【l8J报道的海湾扇贝rgopectens irridians)感染球形病毒后的变化基本相同,不同之处 是不会形成髓样结构,而是形成空泡.贺桂珍等【I9j 报道,急性病毒性坏死症病毒感染栉孔扇贝后外套 膜的病变最严重,与笔者研究的3种器官中外套膜 病变最严重的结果一致.外套膜结构的病变,主要 会影响珍珠囊的形成和珍珠质的分泌,降低其经济 价值.同时,外套膜的内表皮直接与水接触,在贝 类的摄食,排出进人外套腔的异物及防御等方面都 有非常重要的作用【】,2.】,外套膜的破坏会降低其防 御功能. 斧足是三角帆蚌的运动器官.陈志胜等【2l】报道 杂色鲍(Haliotisdiversicolor)患溃疡病后斧足出现 了上皮细胞肿胀并逐渐脱落,肌纤维萎缩变细,染 色变浅,排列杂乱无章,严重时肌纤维断裂形成空 洞等症状.任素莲等【22J报道文蛤"红肉病"导致斧 足上皮排列紊乱,黏液细胞增多,肌纤维溶解等.三 角帆蚌感染病毒后斧足也出现了类似的病变:表皮 中嗜碱JI生颗粒增多,血管变形或脱落,纤维断裂形 成空白区域,这是三角帆蚌感染瘟病病毒后独有的 变化,而肌纤维断裂与病蚌缩足缓慢无力现象相 符.电镜下,.感病第5天才出现少量病毒,病毒增 殖很慢,第9天内质网等细胞器破裂甚至溶解,但 到第11天时病蚌斧足无明显变化,表明该病毒对 斧足的破坏程度有限,也不排除采样个体对病源病 毒的免疫能力较强等原因. 目前,关于瓣鳃类软体动物鳃组织病理学的研 究报道较少,林晓凤等,文祝友等分别在扇贝 (Placopectamagellanicus)和三角帆蚌研究中提到鳃 的变化,Wen等?和Boussaid等分别报道了蛤 (MeretrixlusoriaRoding)和牡蛎(Crassostreagigas Oyster)鳃的病理变化.林晓凤等【26J报道海湾扇贝和 栉孔扇贝病变鳃中发现大量的黄褐色颗粒.任素莲 等..报道海湾扇贝感染一种球形病毒后鳃细胞结 构破坏严重,细胞核,内质网和线粒体等细胞器肿 胀,变形,数量减少.本研究结果表明,三角帆蚌 第35卷第4期刘巧林等三角帆蚌瘟病组织病理学动态变化41l 瘟病病毒的破坏性强,不但使宿主细胞器肿胀变 形,而且随着病程的发展,细胞核等细胞器断裂溶 解,最后形成空泡.以上结果表明鳃对该病毒有一 定的敏感度,病毒能在鳃细胞中缓慢增殖,破坏细 胞结构,导致鳃的呼吸功能和滤食功能下降,从而 加速蚌的死亡. 参考文献: 【1]刘凌云,郑光美.普通动物学[M】.3版.北京:高等 教育出版社,1997:220.221. 【2】吴小平,梁彦龄,王洪铸,等.长江中下游湖泊淡水 贝类的分布及物种多样性[J].湖泊科学,2000,12(2): l1l一1l8 【3]刘建钢,朱方枝.发展洞庭湖区水生农业研究【J].湖 南农业大学:社会科学版,2001,21(21:41.43. 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