胰蛋白酶活性测定

实验一  胰蛋白酶活性测定 实验目的：掌握测定胰蛋白酶浓度、活性、比活的原理与方法。 实验原理：胰蛋白酶相对分子量23.7 KD，主要水解肽链中碱性氨基酸与其它氨基酸相连接的肽键，此外还能水解碱性氨基酸形成的酯键， 如把人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（N-benzuyl-L-argine ethyl ester, BAEE）水解为H-苯甲酰-L-精氨酸（BA）。 胰蛋白酶所催化的上述反应中，产物BA对253 nm 的光吸收远大于BAEE，因此可以在实验起始点把253 nm 的消光值调为零，然后记录反应体系对253 nm 的消光值的增量，并把这个增量作为测定胰蛋白酶的活性指标。 酶活单位定义：在底物BAEE浓度1m mol/L，光程1 cm，波长253nm，温度25 0C，测量体积3mL,.条件下吸光值每分钟递增0.001（A/min=0.001）为1个BAEE酶活单位。 胰蛋白酶制剂中蛋白质浓度含义 ： 胰蛋白酶含量一般E1%表达。这个值的含义是：浓度为1% 酶蛋白，在1cm光径下，对紫外280nm的消光值。不同厂家、不同产品的E1%值有很大差别。E1% 值越高，表明酶制剂中酶蛋白含量越高。 由于酶制剂中蛋白质含量各不相同，所以用酶制剂配制E1%的蛋白质溶液时，按照厂家对产品的E1% 的测定值配制溶液。 在本实验中，胰蛋白酶酶蛋白样品采用SIGMA 公司生产的产品,生产公司对展品的描述是对280nm紫外吸收值15.3， 配制胰蛋白酶溶液可根据厂家的这个说明。 器材以试剂：器材，电子天平，紫外分光光度计，微量加样器。试剂： 标准胰蛋白酶，N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯，HCI, Tris。 1．胰蛋白酶活性测定： 1）配制E1% 的胰蛋白酶溶液 每组取E1%=15.3的 胰蛋白酶样品10mg 放到1ml去离子水中，充分溶解后，放入冰中保存。 2)按照表1 的要求配制试验体系所需其它各种溶液. 3)按照表1的顺序进行测定标准胰蛋白酶的活性。 表1 胰蛋白酶活性测定加样顺序 试剂                            步骤1：空白调零          步骤2：样品测定 0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液,pH 8.0 ,        1.5 mL                1.5 mL 2.0 m mol/L BAEE                       1.5 mL                  1.5 mL 250C预热5min          250C预热5min 胰蛋白酶: 10mg/mL                      0 L                    10 L 蒸馏水                                10 L                     0 L           充分摇匀                  充分摇匀                  步骤1：A253 nm/min                      调0                    ----------- 步骤2：A253-nm/min                            --------------                  记录                              在步骤2样品测定中，加入酶液后立即盖上盖迅速混匀计时，每半分钟读数一次，共读3～4min。测得的结果要使△A253nm/min控制在0.05～0.100之间为宜，若偏离此范围则要适当增减酶量（5 L -20 L之间，空白试验相应增减等体积水）后重新测定，一直到△A253nm/min值落在0.05～0.100之间为止。 3分别求算： 1)标准胰蛋白酶溶液（浓度10mg/mL）的酶活和比活： 计算方法： i)胰蛋白酶活性单位数计算： ii)胰蛋白酶比活计算: (用BAEE单位数/mg胰蛋白酶表示比活) 实验二 胰蛋白酶动力学测定 实验目的：初步掌握以下几个酶动力学参数测定与求算方法：米氏常数Km,最大反应速度Vmax,转换数cat,特异性常数cat,/Km。 实验原理：已知胰蛋白酶遵守米氏方程，可以通过测定底物浓度与反应速度间的关系测定与求算这个酶的诸动力学参数。胰蛋白酶可以水解碱性氨基酸的羧基所生成的肽键、酰胺建和酯键。在本实验中，利用胰蛋白酶水解酰胺键活性的性质，以苯甲酰-L-精氨酰-对硝基苯胺（BAPA）作底物测定这个酶的动力学参数，反应式如下： 反应最适pH8.1,最适温度25 0C。反应产物之一：对硝基苯胺 (p-Nitroaniline，4 -NA)呈黄色，对405nm波长光的摩尔吸光系数为9870，但底物BAPA 和另一个产物BA对405nm波长的光基本不吸收， 因此本实验测定光波的波长设在405nm上，把起始反应的吸光值调为0，记录消光值的变化。 L-BAPA最大浓度低于5104mol/L时这个酶促反应符合米氏方程，可用Hanes作图法求动力学参数。Hanes作图法是单倒数作图法，把米氏方程变形为： 在实验中设定一系列底物浓度[Si]，测定每一个底物浓度条件下的反应速度i,然后用[Si]/i 对[Si]作图，可以得到一条线段，线段在y轴的截距是Km/Vmax, 线段的延长线在x轴的截距是-Km，据此可以得到Km和 Vmax值；cat=Vmax / [Et]。[Et]是酶的初始浓度，已在实验设定为已知,因此cat可以得出；特异性常数Km/ cat可根据上述已知数计算出来。 器材与试剂： 器材：756紫外-可见分光光度计，恒温水浴锅，分析天平，秒表，容量瓶，移液器。 试剂： 1．0.1mol/L pH8.1的Tris-HCI缓冲液（含0.4%CaCl2）：取 0.2mol/L Tris（Mr=121.14）100mL与0.2mol/L HCI 52.4mL混匀，加入0.8gCaCl2,蒸馏水定容到200mL（pH值需用计pH校正）。 2．1mmol/L DL-BAPA（Mr=434.9）水溶液：称取43.49mg BAPA，蒸馏水溶解并加热到80 0C以上，完全溶解后置冰水中冷却，定容到100mL。 这个浓度为1mmol/L的DL-BAPA溶液命名为第六组母液，按照逐步稀释原则配制下列溶液浓度系列：0.8m mol/L （第五组母液，25mL）； 0.6m mol/L （25mL，第四组母液）；0.4m mol/L （25mL，第三组母液）；0.2 m mol/L （10 mL，第二组母液）；0.1 m mol/L （10mL，第一组母液）。 3．60%（V/V）乙酸溶液 4．胰蛋白酶溶液，该酶的比活1.0104 BAEE 单位/mg蛋白 实验步骤： 1． 计算胰蛋白酶加样体积：在本实验中加入胰蛋白酶的量是60g，实验1 已经测到胰蛋白酶的比活和浓度（g/L），根据这些值计算加入体系的酶液体积的L数。 2． 实验溶液系统：本实验有6组实验组成。实验顺序按照表2的加样程序执行。 离曲线ianIMEI ____________________________________________________________________________________________________________________表2. 测定Km 和Vmax值加样表 组 BAPA 母液浓度 （m mol/L） 加入BAPA母液 （mL） 加入 Tris-HCI （mL） 加入 胰蛋白酶 （L） 加入 60%乙酸 （mL） 反应体系底物 BAPA浓度 （m mol/L） A405 1. 0.1 样品1,  2.0 对照 1,  2.0 1.5 1.6 n 0 0.4 0.4 [S1]0.05 2 0.2 样品2,  2.0 对照2,   2.0 1.5 1.6 n 0 0.4 0.4 [S2]0.1 3 0.4 样品3,  2.0 对照3,  2.0 1.5 1.6 n 0 0.4 0.4 [S3] 0.2 4 0. 6 样品4,  2.0 对照4,  2.0 1.5 1.6 n 0 0.4 0.4 [S4]0.3 5 0.8 样品5,  2.0 对照5,  2.0 1.5 1.6 n 0 0.4 0.4 [S5]0.4 6 1 .0 样品6,  2.0 对照6,  2.0 1.5 1.6 n 0 0.4 0.4 [S6]0.5 25 0C 保温5 min后，摇匀，秒表计时，准确反应2min后加入0.4mL 60%的乙酸溶液，摇匀终止反应。反应溶液总量应达到4mL,不足部分可加蒸馏水补足。对照试管不加入胰蛋白酶，只加入0.4mL 60%的乙酸溶液。最后分别记录样品和对照的A405 值，每组种两者的差值 A405 代入下式即可得到对应于[Si]的i 表2列出的是6个实验，鉴于目前实验室尚没有12个枪头的加样，所以每一个实验都可独立进行。 [需要特别注意： 1）比活大于1.0104 BAEE u/mg protein的胰蛋白酶制剂，纯度范围是90%-100%，一般可达到95%-97%。在计算动力学参数时，如无特殊精确要求，可按照胰蛋白酶100%的近似值计算。在本试验中，可根据浓度胰蛋白酶浓度10mg/ml， 纯度100%, 每个试管要求加入质量数60g，计算出每个试管加入的胰蛋白酶溶液微升数。 2）在进行动力学参数计算时，要进行胰蛋白酶质量-摩尔数转换，如无特殊要求，也可以把胰蛋白酶纯度近似为100%. 3）如果有求精确, 但产品说明没有给出胰蛋白酶在固形物中的百分含量，就需配制一定浓度的固形物溶液，首先测定蛋白质浓度，通过求算蛋白质总量，得到蛋白质在酶制剂中的重量比。然后通过双向电泳，图像扫描，把扫描结果输入计算软件，按照软件步骤，求算胰蛋白酶在全部蛋白样品中的百分比。 把实验设定的每一个[Si]和测定到的对应的Vi换算成[Si/Vi]后,填入表3，作图求Km，Vmax 表3.  Hanes 作图的数据 [ Si]/ I :  [S1]/1  [S2]/2  [S3]/3  [S4]/4  [S5]/5  [S6]/6  [Si] :        [S1]      [S2]      [S3]  [S4]      [S5]      [S6] 用[S]/ 对[S]作图可得到一条线段，线段与轴的截距是Km/Vmax，线段延长线与x轴的截距是-Km, 根据方程 可以得到Km,Vmax 根据cat=Vmax/[Et]， 求算cat 和Km/ cat 注意：上式的酶浓度单位是mol/L， 已知酶浓度是10mg/ml,需要根据胰蛋白酶相对分子量23,7 KD ，纯度100%进行换算。 实验完成后报告胰蛋白酶的动力参数：Km, Vmax，cat, Km/ cat