犬旋股下动脉侧支血管内皮细胞的体外培养

犬旋股下动脉侧支血管内皮细胞的体外培养 犬旋股下动脉侧支血管内皮细胞的体外培 养 z,/一,2卜/ 第2卷第4期沈阳医学院 2000年12月JOURNALOFSHENYANGMEDICALCOLLEGE VO1.2No.4 Dee.2OOO 犬旋股下动脉侧支血管内皮细胞的体外培养 / 蒋傻遮战杰王冬霞桀晓旭王川李铭忠 ——(抗阳医学院附属中心医院手外科研究所.沈阳110024) 摘要目的探索犬肢体血管内皮如胞简易培养方法,为在肢端复合蛆织体 外保存方法覆保存后组织知胞(血管内皮如胞)活性判定方面的研览莫定基础.方 法手术切取太建硬下动脉囊f支.采用血管外翻求,消化分离血管内皮细胞后体 外培养.用免疫组化法对增殖细胞分别进行?因子和CO”相关抗原的拉霸{.结果 分离的细胞存活率为99.3.培养24h多敷如胞已玷壁,至第3d,细胞开 培增 殖,可见细胞分鞋相;至第7d+亚细胞克隆组单十细胞分裂增殖,呈环片样生长I 扩增组细胞增殖旺盛.呈带路石样结构.?因子和CD相关抗原喜达阳性.结论 血管内皮细胞的分离采用血管外翻木后消化可燕理想的分离效果,谊方法简单易 抒,重复性好}体外培养的戈血管内皮如胞可以检测驯?因子和CD相关抗原. 关键词文}垒!内皮如胞}体外培养}”ill因子;cD 血管内皮细胞(endothelialcell,EC) 为血管衬里细胞肢端复合组织再植(移 植)恢复血流后血管EC的功能或活性往 往决定着整个再植(移植)组织功能的恢复 状况因此,在肢端复合组织体外保存方法 及保存后组织括性判定方面的研究上,血 管EC的体外培养就显得极为重要.目前 国内外在鼠猪,牛,兔和人等血管EC培 养上已有许多成功的报道,且已应用于基 础或临床研究中,但犬的血管EC培养国 内迄今尚未见报道经反复实验,本文总结 了一种即简单易行,重复性好,又适合于犬 血管EC生长的培养方法. 1和方法 1.1主要实验试剂M199培养基,胰蛋 白酶,NCS购置美国Gibco公司;s—P试剂 盒.?因子,CD3.抗体均购置福州迈新生物 技术开发公司. 乏3}一j3 1.2实验动物及取材手术切取成年健 康犬(中国人民解放军二零二医院动物室 提供)左(右)旋股下动脉侧支长3OO,350 mm,直径O.9,1.21xitm.放入盛有含20 NCS的M199培养基中,以CMF—PBS液 反复冲洗至无血迹后用5/0聚丙乙烯线将 血管外翻使内皮朝外,两端以缝合线封口 后移至经预温的0.2Trypsin—EDTA 液中,37?滚动消化1O,15rain,待液体 微混加入无Ca”,Mg冷Hank’s液终止 消化并复洗2,3次后以1000r/rain离 心,收集细胞,制成0.5ml细胞悬液. 1.3细胞的计数及活体染色将收集的 细胞悬液提取部分分别做细胞收获量的计 数和细胞的活体染色.细胞的计数及活体 染色均在血细胞计数板上进行.细胞活体 染色采用的生物染料为曲利苯兰.染威蓝 色的细胞为死细胞,不着色的细胞为活细 胞,以此来判定所收获细胞的存活率. - 241? 沈.阳医学院第2卷 1.4亚细胞克隆,扩增及密度依赖性实验 将细胞悬液稀释为7.22×l0’个/ml的 细胞悬液.分别提取该悬液i0l(约7.2X 1O个),i00(约7.2×i0个),500l (约3.6×i0’个),依次接种在96孔培养 板和24孔的聚苯乙烯培养皿中(此皿放入 盖玻片,细胞集中盖玻片上培养),加入适 量(终浓度分别约1.4×10个/cm,1.4× 1O’个/cm,7.0×l0个/cm)含有2O NCS的M199营养液,置37~C,5CO2培 养箱中静置培养并依次确定为亚细胞克 隆,细胞扩增和密度依赖3组. 1.5内皮细胞的鉴定 1.5.1形态学观察隔日在倒置相差显 微镜下观察细胞贴壁,细胞形态,细胞间的 融合,细胞克隆,细胞扩增,密度依赖性和 抑制现象并及时拍照 1.5.2免疫组化染色收集培养28,35 d的细胞分别进行HE染色,s—P法?因子 和CD相关抗原检测操作如下.?将经培 养有细胞的盖玻片从培养液中提取,经 Hank’s液冲洗后置入4多聚甲醛液中 固定2Omin(在冰箱内).?PBS洗5rain ×3次.?0.1~Tritonx—loo内浸2o rain.~pBs洗5rain×3次@3H2O2阻 断内源性过氧化物酶5rain.◎PBS洗5 rain×3次.?10羊血清阻断非特异性染 色15rain?s—P法检测细胞中的?因子, CD相关抗原 2结果 上述方法分离的血管EC,细胞活率为 99.3.细胞总收获量约为7.25×1ot个. Trypsin-EDTA消化后的细胞形态为圆, 椭圆形.细胞呈单个游离,培养24h后多 数细胞已贴壁至第3d,克隆组,扩增组细 胞已开始生长或增殖,可见细胞分裂相.克 隆组的单个细胞第7d已分裂增殖,呈环 ?242? 片样生长(图1).边缘细胞的外缘部呈半 圆状,胞核清晰可见,并可见分裂细胞.扩 增组细胞至第3d,可见多处三五成群细胞 聚集在一起,偶见分裂时相.至第7,14d, 随处可见增殖旺盛的细胞岛,细胞间融合 成片,呈铺路石样结构(图2),细胞核可 见.密度依赖(接触抑制)组细胞培养至第 3d后,重叠或未贴壁细胞逐渐退化,细胞 胞体增大,胞核模糊,融解,细胞死亡;其余 细胞培养至第21d,仍未窥见增殖细胞,细 胞处于相对静止状态.扩增组活悻细胞经 HE染色后,胞浆染成粉红色,胞核染成蓝 色,可见分裂细胞及衰老退化之细胞.CD. 和?因子相关抗原达阳性,证实培养的 细胞为血管EC. 围1亚克隆组单个细瞳,-殖情况 亚克睦组单十细胞培养至第7d. 分裂增殖8,16个,呈环片样生长 (倒置相差显馓镜×640) 田2扩组细电增殪情况 扩增组细胞培养至第14d.增殖融 台成单层片献.似铺瞎石献结构 (倒置相差显散镜×640) 第4期蒋俊等.犬旋殷下动脉侧支血管内皮细胞的体外培养 3讨论 细胞在体外生存与繁殖的关键在于细 胞所处的外界环境是否符合它的生存条 件.分化相对较低的细胞,如血管EC在体 外存活的最主要标志应是能否分裂繁殖. 要达到这个目的,除基本生存条件外,还取 决以下因素.首先,细胞分离的质量极为重 要.分离的细胞纯度和活性高,细胞收获量 大,则细胞增殖的量就多,否则反之.其次. 接种细胞的数量也不能忽视.接种的数量 少则不易尽快形成(增殖)一定的规模为之 所用{相反接种的数量过多,则细胞间易产 生密度依赖性抑制.不利于细胞的增殖.所 以,接种细胞的数量要依实验的目的适当 的加以选择本文认为,亚细胞克隆以1.4 ×10’个/cm,细胞扩增以1.4×10个/ c:m.左右为宜,本实验再次证明.细胞间存 在高度密度依赖抑制,实验中应引起高度 重视. 胶原酶,胰蛋白酶消化法分离组织细 胞,可以说是一种人们常用的经典方 法_1].国内外分离血管EC,特别是分离较 细血管EC大部分采用这一方法.虽然胰 蛋白酶相对于胶原酶价格便宜,但它与胶 原酶一样常因产地,批号的不同.导致酶的 最佳活性点及作用时间不易掌握,浓度过 低则达不到消化目的,过高则可破坏细胞 结构,甚至造成细胞死亡.所以,适宜地选 用胰蛋白酶的浓度是分离细胞成功与否的 关键.较细血管(直径<1mm)EC的分离 往往较为困难,采用血管外翻技术,在 0.2Trypsin—EDTA作用下便可成功地 分离犬的血管EC.该方法细胞收获量及活 率均较高,且简单易行,重复性好,适合于 常规培养.可为今后寻求肢端复合组织体 外保存方法以及保存后组织活性的判定 (以细胞体外培养方法)奠定一定的基础. ?因子和CD为血管EC相关抗原哪.国 内在EC鉴定上多采用?因子相关抗原的 检测.而应用1厦因子和c.抗原来鉴定犬 血管EC至今尚未见报道.目前,除猪体外 培养的EC未检测到?因子相关抗原外, 多数哺乳动物EC均可检测到?因子相关 抗原.本实验证实,体外培养的犬血管 EC可以检测到?因子和CD相关抗原. 体外培养的活体细胞与病理常规标本 失活的细胞在膜的通透性上存在一定的差 异,活体细胞膜一般相对较差.该差异给活 体细胞染色带来了一定困难.本实验应用 Triton—x—100弱乳化荆作用活体细胞膜, 增加了细胞膜的通透性,缩小了两者之间 在膜通透性上的差异[s],从而大大提高了 该活体细胞染色的效果,为体外培养的活 体细胞染色提供了经验. (本实验研究承蒙我院病理科王翠芳主任动精宴 验室张炎老师的鼎力相助,在此一井馥谢) 参考文献 1MacEachernKESmithGL,NolanAM.Methods fortheisolaton.cultureandcharacterisadon0fe. qulnepulmonaryarteryendothelialcells.ResVet Sci,1997’62(2):147 2SehutzM,FfiedlP.I~olationandcultivationofel卜 dothelialcellsderivedfromhum*npl?.enta.EurJ CellBiol,1996I71(4)’395 3FolkmanJ.Haudensehildcc.7~tterBR?Long— termcultureofcapillaryendothelialcells.proeNd Acadsci,1979l76(10’5217 4盛民立.血管内皮细臆与痰病.上海;上海医科大 学出版社.1993I120 5沈明,蒋雌鹰.T血.n—x一100在培养细囊免疫组 化染色中的应用.临床与宴验龠曩杂志,1998|14 (2)197 (2000-03—24收蓿) (下转第251页) ?243? 第4期闫中政等.AMI后急性下肢静脉血栓形成2倒 胀完垒消退. 讨论急性下肢静脉血栓形成常发生千老 年术后或重症长期卧睐病倒.据报道AMI后1O , 14天下肢静脉血栓发生率为34,38,而疑 为AMI而后否定诊断的.下肢静脉血栓发生率仅 为7,l0口】血栓形成与局部血管内皮损害, 血禳高凝状态,血流流变学变化及卧睐,心衰等弓I 起的静脉磷血回流缓慢等动力学改变等因素有 关.形成的血栓脱落可引起动脉栓塞].有报道 肺动脉栓塞在肺血管病变中占首位],应引起足 皓重视. 本文2倒老年男患,大面积AM’i合并重度心 衰且均于心梗后10日(停用低分子肝索后3日)发 生急性下肢静脉血栓形成,由于及时采取了尿激 酶静脉溶栓.抬高患肢促进回流,制动防止血栓脱 落等治疗措施,分别于血桂形成后3日,2同后下肢 肿胀消退,说明溶栓有效,血栓溶解,阻塞静脉再 通,均未发生肢体破溃,感染及肺栓塞等并发症. 本报道提示,对疑为下肢静脉血栓形成的高 危病例,治疗上应采用积极抗凝疗法,配合被动运 动,以促进静脉回流.预防血栓形成.如发生急 性血栓形成,可采用尿激酶静脉溶栓,并采取措诱 (上接第243页) 防止血栓脱落]. 参考文献 1AmbetJJ.Be删enDR,C憎力Rc0nJM.tta1.AM1 drugevalutionannua1.USAAmMedAssoc.1994j 763,764 2Wheel~HG.AndersonFA.Dhsnosficmethodsfor deepveinthrombosis.Heamostasis.1995}6,26 3汪钟.释植基主缠.现代血栓病学.北京r北京医科 大学.中国协和医科大学联台出舨社,1997l340 2 4汪忠精.王仕华.肺栓毫一下肢静脉戎病与肺栓塞. 中国循环杂志,1999’14(2)F65 5冯周辈主编.实用血栓病学.郑州河南科学技术出 版杜.1995}58,64 6吴清玉-吴永赦.郭步先.等.慢性肺动脉栓辜的外科 治疗.中华心血管杂志.1999}4(2):118 7程显声.努力硪步肺栓塞的谖诊罱谚.中华内科杂 志.1993l32(4)l219 8常家立.捌昌挺.只有经胂动咏造影才能确谚肺栓塞 吗?中国危重急救医学.1992j4(2)F112 (2000—03?21收穑) Co]turedofEndothelia】CelIsfromBranchVesseIofCanine, CircumflexLateralisFemora】inVitro Jiang,run,TianLijie,ZhanJie,etal (DepartmentofHandSurgery,AffiliatedCentralHospitalt0ShenyangMedk alCollege—Shenyang110024) AbstractObjectiveToexptoreapracticalmethodoncultureofcaninevascularendothelialceil (EC)inordertolaythefoundationonconservatirerftedthodofArco--eombirmdontissueinvLtroand judgetheactivityofconservedtissularcells(vascularEC).MethodsCaninearteriacircumflexIater. atisfemoralwasgotbytheoperations.V~scularECwasdigestedandseparetedbyeversionofblood vesse1.thenculturedinvitro.TheantigenCDandthefaetor? werecheckedbyS-Pimmunohis- tochemicalstsin/ng.ResultsThesurvivalrateofseparetedceUswas99.3N.After24hoursthecells begantOgrow~dhesively.Andafter3daythecellspxollferatedandappearednuclearfission.After7 dayswecouldfindthesinglecellofsubc~llcolondgroupproliferatedlikeacycleandthecellsofexpand groupgrowlikespreadingstone.ConclusionExpressionoffactor? andCDispositive.Wecanget effectiveisolationofECwitho.20Typsin-EDTA.Factor? andantenCDa.areexaminedinco1. turedendothellalcellsofcaninevesse1. Keywordsca~ne;vascularendothelialcell;culturedinvitrotfactor?1CDu ?251?