人胰腺导管上皮细胞的原代和传代培养

人胰腺导管上皮细胞的原代和传代培养 解剖学报 2000年第2期第0卷 短篇报道 作者：侯敏　陈元方　柯杨　孔燕国　陆国钧 单位：侯敏　陈元方　孔燕国　陆国钧（中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院消化内科，北京 100730）；柯杨（北京医科大学北京市肿瘤医院，北京 100034） 关键词：原代培养；传代培养；人胰腺导管上皮细胞   【摘要】　目的　完成胰腺导管上皮细胞的原代及传代培养，建立能够体外长期培养的胰腺导管上皮细胞系。　方法　用含有胶原酶IA型的消化液消化分离胎儿胰腺组织为细小、均匀的细胞团进行接种，接种的细胞团用含10%胎牛血清、4.0mmol/L谷氨酰胺、0.01%大豆胰酶抑制剂、0.02%牛血清白蛋白、5.0mg/L牛脑垂体提取物、2.5×10-3mg/L皮生长因子、25.0×10-2mg/L霍乱毒素、5.0mg/L胰岛素、10.0mg/L转铁蛋白、1.0mg/L地塞米松、50mg/L庆大霉素的完全培养基培养24h后，换含2%胎牛血清的完全培养基继续培养，在细胞团达到80%～90%的细胞汇合时，1∶2传代培养。　结果　获得的原代培养细胞不含有淀粉酶，表达细胞角蛋白，可初步认定为胰腺导管上皮细胞。原代培养的胰腺导管上皮细胞已传代培养到第3代。　结论　我们的原代培养和传代培养的方法、条件适宜于胰腺导管上皮体外细胞培养。完成胰腺导管上皮细胞的原代及传代培养，建立能够体外长期培养的胰腺导管上皮细胞系。　方法　用含有胶原酶IA型的消化液消化分离胎儿胰腺组织为细小、均匀的细胞团进行接种，接种的细胞团用含10%胎牛血清、4.0mmol/L谷氨酰胺、0.01%大豆胰酶抑制剂、0.02%牛血清白蛋白、5.0mg/L牛脑垂体提取物、2.5×10-3mg/L表皮生长因子、25.0×10-2mg/L霍乱毒素、5.0mg/L胰岛素、10.0mg/L转铁蛋白、1.0mg/L地塞米松、50mg/L庆大霉素的完全培养基培养24h后，换含2%胎牛血清的完全培养基继续培养，在细胞团达到80%～90%的细胞汇合时，1∶2传代培养。　结果　获得的原代培养细胞不含有淀粉酶，表达细胞角蛋白，可初步认定为胰腺导管上皮细胞。原代培养的胰腺导管上皮细胞已传代培养到第3代。　结论　我们的原代培养和传代培养的方法、条件适宜于胰腺导管上皮体外细胞培养。   【中图分类号】　R322.4+91;R329.2【文献标识码】　A   【文章编号】　0529-1356(2000)02-180 PRIMARY CULTURE AND SUBCULTURE OF HUMAN   PANCREATIC DUCTAL CELLS HOU Min,CHEN Yuan-fang,KONG Yan-guo, LU Guo-jun   （Chinese Academy of Medical Sciences,Peking Union Medical College,PUMC Hospital,Department of Gastroenterology,Beijing 100730；）   KE Yang   （Beijing Medical University,Beijing Institute for Cancer Research,Bijing 100034,China）   【Abstract】　Objective To establish a normal pancreatic ductal epithelial cell line for further study.Methods The human fetal pancreas was dispersed with the solution containing collagenase type IA. Then cells were maintained in a complete media consisting of 10% fetal bovine serum(FBS), 4.0mmol/L glutamine, 0.01% soybean trypsin inhibitor, 0.02% bovine serum albumin, 5.0mg/L bovine pituitary extract, 2.5×10-3mg/L epithelial growth factor, 25.0×10-2mg/L cholera toxin, 5.0mg/L insulin, 10.0mg/L transferrin, 1.0mg/L dexamethasone, and 50mg/L gentamycin. Twenty-four hours later, they were cultured successively in a complete media of 2% FBS. When the cultured cells reached 80%-90% confluence, they were subcultured in 1∶2.Results Expression of cytokeratin and absence in amylase proved that the cultures were pancreatic ductal cells. These pancreatic ductal cells had been subcultured for three generations.Conclusion Our culture methods and conditions used in the experiments are suitable for the primaryculture and subculture of human pancreatic ductal cells.   【Key words】 Primary culture; Subculture; Human pancreatic ductal cell   正常人上皮细胞的培养较困难，传代培养更不易。我们在对人胚胰腺导管上皮细胞的原代和传代培养的工作中获得了一些经验和体会，现总结如下。   材料和方法   1. 细胞分离及培养所需液体   基础培养基：DMEM/Ham F-12(1:1, Gibco)，按要求加入NaHCO3， 调节pH值至7.2，过滤除菌，分装备用。   消化液：Hanks平衡液中加入胶原酶IA型(Sigma)0.5g/L，大豆胰酶抑制剂(Sigma)使其终浓度为0.01%，过滤除菌，分装备用。   完全培养基：基础培养基中加入其他辅助成分：胎牛血清(FBS)，10%或2%(V/V)；谷氨酰胺，4.0mmol/L；大豆胰酶抑制剂，0.01%(W/V)；牛血清白蛋白(BSA)，0.02%(W/V)；牛脑垂体提取物，5.0mg/L；表皮生长因子(EGF)，2.5×10-3mg/L;霍乱毒素，25.0×10-2mg/L;胰岛素，5.0mg/L;转铁蛋白，10.0mg/L；地塞米松，1.0mg/L；庆大霉素，50mg/L。   低浓度胰酶消化液：PBS缓冲液中加入胰蛋白酶(Sigma)、EDTA，使终浓度分别为0.025%和0.002%，过滤除菌，分装备用。   冻存液：胎牛血清中加入10%DMSO(Sigma)，分装备用。   2. 人胚胰腺导管上皮细胞的分离、原代及传代培养   取因故中止妊娠20～30周胎儿胰腺组织，剔除其表面的纤维组织和血管，Hanks液清洗，将其装入50ml离心管中并加适量消化液37℃水浴振摇消化2h。用吸管取出大、小组织块，装入不同的离心管中，加入新消化液，分别继续消化1～2h。最后用吸管反复吹打，使消化组织呈细小均匀的细胞团，4℃、120g，离心5min，沉淀细胞团中加入含10%FBS的完全培养基，以10～20个细胞团/每1中倍视野(×200)的密度接种至培养瓶(Nunc公司产品)，置孵箱中(5%CO2，37℃)培养24h后换2%FBS的完全培养基继续培养。当细胞汇合达80%～90%时(3～4d)，用低浓度胰酶消化，一瓶细胞传代为两瓶(1∶2)，用2%FBS的完全培养基继续培养。细胞汇合后(6～7d)，1∶2传代(第3代)。   3.原代培养细胞的鉴定   将消化分离的胰腺细胞团接种至鼠尾胶原包被的盖玻片上，待盖玻片上长满细胞后取出，95%乙醇固定，常规HE染色。   淀粉酶检测：应用Pharmacia公司出品的淀粉酶检测系统对原代培养的胰腺细胞匀浆进行淀粉酶含量检测。检测样本包括空白，α-淀粉酶1.1U、2.2U、11U对照，待测标本。722型光栅分光光度计测定光密度(A620)。   免疫组织化学染色：常规收获原代培养细胞，用0.2～0.3ml Hanks悬浮后离心涂片，甲醛、丙酮混合液(每100ml中加入甲醛25ml，丙酮45ml，Na2PO4 20mg,KH2PO4 100mg)固定，SP法染色，DAB显色。细胞角蛋白检测所用一抗为兔抗人角蛋白(低分子量和高分子量)的多克隆混合抗体(1∶50)，二抗为生物素标记的羊抗兔抗体(1∶250)。   结果和讨论   胎儿胰腺组织经胶原酶IA型消化分离的细胞团，用10%FBS完全培养基接种培养24h后，90%以上的细胞团贴壁，在一些细胞团周围生长出1，2圈细胞；少数单细胞也贴壁生长。此时换2%FBS完全培养基，细胞团似多个细胞小岛，周围的细胞生长较快，有多圈细胞。这些细胞小岛细胞呈多边形，胞浆较宽，红染，镶嵌排列(图1)。培养96h左右，细胞小岛周边的细胞彼此相接(图2)。传代后，能够再贴壁生长的细胞基本为单个的短梭形或多边形细胞，这些细胞生长缓慢，逐渐汇合呈小灶状或片状时，细胞呈现相嵌状排列，细胞密度越高，这种排列特性越明显；传代后约1周，细胞汇合可达80%～90%。第3代细胞，其生长状况基本同第2代细胞，长梭形的细胞非常少。 1　培养96h的原代胰腺导管上皮细胞。细胞为多边形，胞浆宽广，红染，镶嵌排列。　HE×400 2　培养96h的原代胰腺导管上皮细胞生长为细胞小岛，小岛周边的细胞彼此相接。↑接种的细胞团　HE ×100 3　原代培养的胰腺导管上皮细胞表达细胞角蛋白　×400   Fig.1 Primary culture of pancreatic ductal cells for 96 h. The cells were polygonal in shape, rich in cytoplasm, and tightly mosaic.　HE×400   Fig.2 Primary culture of pancreatic ductal cells for 96h formed cell foci and the cells on the periphery of the foci were confluent with each other. ↑ cell mass at the time of inoculation HE×100   Fig.3 Primary cultured pancreatic ductal cells expressed cytokeratin.　×400   免疫组织化学染色结果显示80%以上的细胞呈角蛋白阳性反应。培养77、96h的原代细胞均未检到淀粉酶(表中为96h的结果)。 附表　原代培养细胞中淀粉酶含量的测定   Table Detection of amylase in primarily cultured cell suspension 　 空白对照   blank   control 标准淀粉酶对照   amylase standards 培养细胞浆浆   cell suspension 1.1u 2.2u 11.0u 100μl 500μl A620* 0.094±0.002 0.024±0.013 0.382±0.005 0.822±0.011** 0.017±0.011 0.097±0.003 *±,r=0.99 for standards in duplicates **稀释3倍的值　value of triple dilution   正常上皮细胞的培养较为困难，往往以成纤维细胞的大量增殖而告终。细胞培养基中的血清常含有抑制上皮细胞生长但可刺激纤维细胞生长的TGF β等因子［1］。Lechner和La Veck［2］首先建立了添加上皮细胞生长因子、微量元素及氨基酸的无血清培养方法，成功地培养了正常人支气管上皮细胞。柯扬等［3］也是借鉴该方法用低血清培养液培养了人胃粘膜上皮细胞。我们参照他们的方法，建立的培养条件是以高浓度血清(10%)的培养基接种，使细胞团尽快贴壁生长，贴壁以后，再用含低浓度血清(2%)培养基进行培养，从而有利于上皮细胞的增生和传代，却能抑制成纤维细胞的生长。这样，在低血清培养范围内，把血清提高到最大允许浓度，生长因子及其他成分减少至最低限度，并可简化完全培养基的配制，减少工作量。   有关人的胰腺导管上皮细胞原代培养的文献报道甚少［4］。国外的报道是对主胰管及其第一级分支直接消化、分离胰腺导管上皮细胞进行培养的，这种方法要求切除的胰腺组织足够大，一般只能在成人的胰腺进行，因此，获取标本十分困难。我们采取消化分离人胚胰腺组织为细胞团接种培养，所获得的细胞有上皮细胞的生长排列方式，细胞匀浆不含有淀粉酶，细胞角蛋白免疫组织化学染色阳性，与文献报道的结果比较一致，可以说明，用这种方法分离培养的细胞以导管上皮细胞为主，这为传代培养和建立转化细胞系提供了可能性。   人正常上皮细胞传代培养的报道很少，作者的工作也仅在原代培养成功后传了两代。由此体会到，人正常上皮细胞是可以传代培养的，重要的是原代培养中成纤维细胞的含量要少，传代培养的条件应有利于上皮细胞的增殖而抑制成纤维细胞的生长。具体在本工作中，我们注意到以下两点，一是要掌握好消化分离的细胞团的大小，细胞团太小，细胞增殖的能力有限；细胞团太大，则可因消化不充分而混杂较多的成纤维细胞。二是接种细胞团的密度要适当。密度太高，细胞还没有充分生长便因接触而抑制增殖；接种太稀，则因细胞团周围的细胞增殖能力有限，导致总细胞量过少。   作者简介：侯敏(1963—)，女(汉族)，河北省威县人，医学博士，主治医师，现在病理科工作   参考文献   ［1］Masue T, Wakefield LM, Lechner JF, et al. Type β transforming growth factor is the primary differentiation-inducing serum factor for normal human bronchial epithelial cells［J］. Proc Natl Acad Sci, 1986, 83(4):2438-2442.   ［2］Lechner JF, LaVeck. A serum-free method for culturing normal human bronchial epithelial cells at clonal density［J］. J Tissue Culture Methods 1985, 9(1):43-48.   ［3］柯杨，宁涛，王冰，等.人胃粘膜上皮细胞系GES-1的建立及其生物学特性［J］. 中华肿瘤杂志，1994，16(1)：7-10.   ［4］Githens S. Pancreatic duct cell cultures［J］. Annu Rev Physiol, 1994,56:419-433.