斯氏狸殖吸虫抗原的一维与二维电泳分析特异抗原成分识别和应用研究（可编辑）

斯氏狸殖吸虫抗原的一维与二维电泳特异抗原成分识别和应用研究（可编辑） 斯氏狸殖吸虫抗原的一维与二维电泳分析特异抗原成 分识别和应用研究 泸州医学院 硕士学位论文 斯氏狸殖吸虫抗原的一维与二维电泳分析特异抗原成分识别和 应用研究 姓名:陈文碧 申请学位级别:硕士 专业:中西医结合基础 指导教师:王光西;张锡林 20040501 斯氏狸殖吸虫抗原的一维与二维电泳分析、特异抗原 成分识别和应用研究 摘 要 背景:斯氏狸殖吸虫[Pagumogonimus skrjabini Chen,1959 Chen,1963] 散在分布于我国四川、重庆、甘肃、福建等 15 个省、市、自治区，国外 尚没有该虫种分布的报道。由于人为该寄生虫的非正常宿主，幼虫在人体 内通常不能发育至成虫，而是滞留于童虫阶段。由于童虫在人体内组织、 器官间的游走、移行，造成肺外不同组织、器官的损害，常常引起游走性 皮下包块或结节、脑占位性病变和内脏损伤等不同类型肺外型肺吸虫病表 现。根据其寄生部位的不同，临床表现多种多样，临床症状常常不典型， 因而误诊率甚高, 给人们的健康，尤其是儿童的健康造成极大的危害，阻 碍了流行区的经济建设。该虫体在人体内寄生的特点决定了其病原学诊断 困难，因而免疫学检查在该型肺吸虫病的实验室诊断和鉴别诊断中尤其重 要。在常用的抗原、抗体检测系统中，影响检测效果的关键因素主要是诊 断用抗原和免疫诊断方法。要求诊断用抗原具有较高的特异性，同时要求 免疫诊断方法既要有高度的敏感性和特异性，又要操作简便、快 速，才能 满足临床常规免疫诊断的需要。 目的: 1. 研究斯氏狸殖吸虫成虫可溶性抗原和成虫排泄分泌抗原 (Excretory-secretory antigen ，ES-Ag )，检测和分析其特异抗原组分;为开 发敏感、特异的免疫学诊断方法、研制抗斯氏狸殖吸虫药物和疫苗提供参 考资料。2.建立斑点金免疫渗滤法(dot immunogold filtration assay，DIGFA ) 检测斯氏狸殖吸虫病患者血清 IgG 抗体, 以快速诊断肺吸虫病，并明确 DIGFA 的敏感性、特异性、重复性和稳定性。 方法: 1.用聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-PAGE 、酶联免疫 电转移印迹 1 Western blotting 和二维电泳 two-dimensional gel electrophoresis 等方法,对 斯氏狸殖吸虫成虫可溶性抗原及成虫ES 抗原进行分析。 2. 以斯氏狸殖吸 虫成虫可溶性抗原为上样抗原，胶体金标记羊抗人 IgG 为显色 剂，建立检 测斯氏狸殖吸虫病患者血清抗体的斑点金免疫渗滤法(DIGFA ); 并以经 典的ELISA 方法作平行对照。 结果: 1. 斯氏狸殖吸虫成虫可溶性抗原及成虫ES 抗原 经SDS-PAGE， 氨银染色和考马斯亮兰染色后，都可见 1 复杂的蛋白带谱。氨 银染色后， 成虫可溶性抗原显示 30 条以上蛋白带，主带 18 条，染色深而宽，分子量 范围为 13.0,68.6 kDa 间;成虫ES 抗原可见 9 条蛋白带，主带 4 条，分 子量范围为 13.0,38.4 kDa 间。考马斯亮兰染色后，成虫可溶性抗原可见 22 条蛋白带,分子量范围为13,64kDa，其中主带8 条,即13、15、22 、26 、 28 、35、40 和64kDa，而65kDa 以上未见条带;成虫ES 抗原可见 6 条蛋 白带，分子量范围为13.0,30.1kDa，主带3 条，分别为 13、26 和28kDa 。 成虫可溶性抗原及其ES 抗原经SDS-PAGE 电泳后，在10,30 kDa 间蛋白 区带的位置、宽度及染色深浅度较相似，其相似的主带有13、26 和28 kDa 蛋白带;而在 40,100 kDa 间蛋白带其位置差异较大，各带均不同。 2. Western blotting 成虫可溶性抗原显示20 条显色带, 主带6 条，即 13、18、 22 、28 、35 和64kDa 。但在15、26 和40kDa 处缺如，值得注意的是SDS- PAGE 凝胶考马斯亮蓝染色不清楚的一些蛋白带经酶联免疫印迹染色后变 得清晰可见,如 18kDa 蛋白带。可见有些成虫可溶性抗原量虽少,却可产生 明显的免疫反应。而SDS-PAGE 考马斯亮蓝染色清楚的一些蛋白带经酶联 免疫染色后却未见棕色条带,如 15、26 、40kDa 蛋白带。特别是 26kDa 在 SDS-PAGE 凝胶虽为主带，染色特别宽深，而在Western blotting 却无反应; 成虫ES 抗原显示3 条显色带,主带2 条，即 13 和28kDa 。 3. 二维电泳分 离出斯氏狸殖吸虫成虫可溶性抗原 48 个多肽斑点, 绝大部分分布于 PI 2 3.10,7.14，少数分布于 PI 8.78,9.85，而在 PI 7.14,8.78 之间，几乎未 出现多肽斑点;其分子量范围为 14,70kDa 。48 个多肽斑点中 18 个着色 深，为主要抗原多肽点，其中酸性多肽斑点11 个，中性多肽斑点2 个，碱 性多肽斑点5 个。4. DIGFA 和ELISA 分别检测83 例斯氏狸殖吸虫病患者 血清抗体，其阳性率分别为 95.2%和 91.6%，两法差异无显著性 P ,0.05 。 DIGFA 分别检测健康者血清32 例、华支睾吸虫病患者血清23 例和日本血 吸虫病患者血清36 例，前者均为阴性，后两者的交叉反应率分别为4.3 % 和8.3 %;DIGFA 和ELISA 两法的符合率达92.3 % 。 结论: 1. 斯氏狸殖吸虫成虫可溶性抗原经 SDS-PAGE 考马斯亮蓝染 色后显示的 22 条蛋白带中,有 6 条蛋白含量较高、免疫印迹识别可见的显 色条带;成虫ES 抗原6 条蛋白带中,有2 条蛋白含量较高、免 疫印迹识别 可见的显色条带。这些具有较强免疫反应性的蛋白的存在,对进一步研究斯 氏狸殖吸虫有较大价值。然而这些抗原是否都是斯氏狸殖吸虫的特异抗原, 还需与其它吸虫的免疫血清进行 Western blotting, 以进一步确定其特异性。 2.在斯氏狸殖吸虫成虫可溶性抗原 48 个多肽斑点中有 18 个多肽含量明显 较高,其中大部分为小分子量、偏酸性的多肽斑点。3. 我们建立的DIGFA ， 其敏感性和特异性与ELISA 相近，但方法简便、快速、试剂稳定，且不需 特殊设备，适用于各级医疗单位和血清流行病学调查，是一种检测斯氏狸 殖吸虫病患者血清IgG 抗体的较好的免疫诊断方法。 关键词: 斯氏狸殖吸虫;抗原;SDS-PAGE;酶联免疫电转 移印迹; 二维电泳;斑点金免疫渗滤法; ELISA 3 Study and Application on Antigens of Pagumogonimus Skrjabini By SDS-PAGE and Two-Dimensional Gel Electrophoresis Abstract Background :Pagumogonimus skrjabini is epidemic in 15 provinces of China including Sichuan,Chongqing,etc. As an abmoral host, people infected with P.skrjabini often exihibite extrapulmonary type of paragonimiasis with multiple organ and tissue damage, which do great harm to the people’s