黄连素对CA诱导的tau蛋白过度磷酸化的保护作用及其机制

黄连素对CA诱导的tau蛋白过度磷酸化的保护作用及其机制 华中科技大学 硕士学位论文黄连素对CA诱导的tau蛋白过度磷酸化的保护作用及 其机制 姓名:余光 申请学位级别:硕士 专业:病理学与病理生理学 指导教师: 王小川 20090527 论 文 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文黄连素对 CA 诱导的 tau 蛋白过度磷酸化的保护作用及其 机制 硕士研究生 余光 导 师 王小川 副教授 摘 要 黄连素，又称小檗碱 BerberineBR，是从中草药黄连等植物中提取分离得到的一类异喹啉类生物碱，属季 铵类化合物。近年来，有研究明，盐酸小檗碱 1. 在增加IL-1和诱生型一氧化氮 合酶的表达的同时能改善阿尔茨海默病Alzheimer diseaseAD模型大鼠的空间记忆损 伤;2. 通过改变阿尔茨海默病淀粉样前蛋白的加工过程减少 A的分泌;3. 通过减 少海马神经元细胞内游离的钙离子来保护 Aβ诱导的神经元凋亡;4. 具有抗乙酰胆 碱酯酶的活性而成为治疗阿尔茨海默病的一种潜力药物。由异常过度磷酸化 tau 蛋 白构成的神经原纤维缠结neurofibrillary tangles NFTs含量与 AD患者的临床痴呆程 度呈正相关，提示 tau 蛋白过度磷酸化促 NFT 形成在 AD 发病中起关键作用。 而受累神经元内蛋白激酶/蛋白磷酸酯酶动态平衡失调是导致 tau 异常过度磷酸化 的主要生化机制。同时亦有报道:小檗碱可影响人类结直肠癌细胞HCT-116cells GSK-3的活性，而后者是 AD 发病中起重要作用的一种蛋白激酶。但迄今为止，尚 无直接证据表明小檗碱影响 AD 动物模型亦或是 AD 患者脑内蛋白激酶/蛋白磷 酸酯酶的活性，进而影响 tau 的磷酸化程度。为此，本文的探讨了小檗碱对花萼海 HEK293/tau)诱导的神经细丝绵诱癌素(Calyculin ACA)在人胚肾转 tau 细胞( 过度磷酸化中的影响及其相关酶活性的变化。采用 CCK-8 测定细胞活力来确定药 物作用浓度;并用显微镜成像和 hoechst 观察给药前后的细胞状态及凋亡情况。 通 过免疫印迹技术 1 论 文 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文和细胞免疫化学测定 tau 蛋白的磷酸化程度及相关酶 的活性。结果显示:2.5nM CA 作用 12 小时可以使 tau 蛋白在 ser198/199/202、 ser396/404 位点的磷酸化程度明显增高并且 GSK-3活性明显增加 PP-2A 活性明显 下降。经过 24 小时浓度为 20mg/ml 的黄连素治疗 这些位点的过度磷酸化有明显 降低 研究其作用机制发现 GSK-3在Tyr216 位点磷酸化程度明显下降 表明 GSK-3活性下降;同时 PP-2Ac 在 Y307 位点磷峄 陆?表明 PP-2A 活性上升。结 论: 黄连素小檗碱可能通过降低 GSK-3的活性 升高 PP-2A 的活性来降低 tau 蛋 白过度磷酸化程度，提示其成可能成为治疗阿尔茨海默病的一种潜在药物。关键词: 黄连素 tau 蛋白过度磷酸化 阿尔茨海默病 GSK-3 PP-2Ac 2 论 文 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 Protection of Berberine on tau hyperphosphorylation induced by calyculin A and its mechanism Postgraduate: Yu Guang Supervisor: Prof. Wang Xiaochuan Abstract Berberine is an isoquinoline alkaloid extracted from Chinese herbs such as Coptidisrhizome. In the past several years there are lots of pharmacodynamic studies of berberine swhich indicates its potential role in the treatment of Alzheimer’ Disease AD. Theseresults involve that berberine chloride can ameliorate the spatial memory impairment andincrease the expression of interleukin-1beta and inducible nitric oxide synthase in the rat s smodel of Alzheimer’ disease berberine alters the processing of Alzheimer’ amyloidprecursor protein to decrease Abeta secretion tetrohydroberbine could protect against theapoptosis induced by beta-AP by reducing hippocampal neuronal intracellar free Ca2berberine has anticholinesterase activities. Above all berberine becomes a potent drug for sAlzheimer ’ Disease. There is positive correlation between the content of NFTs constitutedby hyperphosphorylation of microtubule-associated protein tau and clinical dementiadegree which suggests tau hyperphosphorylation- induced NFTs conformation plays a key srole in Alzheimer’ disease onset. The imbalance between protein kinease and proteinphosphatase of involved neurons is the main biochemical mechanism inducing tauhyperphosphorylation. In addition there is one report that berberine can affect GSK-3βactivity in HCT116 cells and GSK-3βis one of the protein kinases which play important srole in Alzheimer’ disease onset. Until now there is no direct evidence that showsberberine can affect tau phosphorylation by affecting protein kinase/phosphatase in brains sof AD- like animals or patients with Alzheimer ’ disease. This study is to confirm whether 3 论 文 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 文berberine has any effect on tau hyperphosphorylation and the underlying 位 论 mechanism. Thelongest human tau tau441 cDNA was stably transfected into HEK293 cells HEK293/tauand hyperphosphorylation of tau was induced by 2.5 nM calyculin- A for 12h. Afterdifferent drug dose exposure cell viability was detected by cck-8 technique to make sure aproper drug dose along with microscope imaging and hoechst staining which were done toobserve cellular morphous and apoptosis condition. Tau hyperphosphorylation and therelated enzymes were assayed by Western blot and cell immunochemistry. The results showthat hyperphosphor- ylation of tau at ser198/199/202 ser396/404 epitopes was reduced by20g/ml berberine treatment for 24h together with decreased phosphorylation of glycogen synthase kinase-3 GSK-3 at Tyr216 and decreased phosphorylation of catalytic subunitof protein phosphotase 2A PP-2Ac at Y307. 20g/ml berberine can reduce tauhyperphosphorylation induced by 2.5nM calyculin-A specifically at the ser198/199/202ser396/404 sites. However almost no alteratio n at Thr231 was observed. Level ofphosphorylated GSK-3 at Tyr216 and phosphorylation of catalytic subunit of proteinphosphotase 2A PP-2Ac at Tyr307 were obviously decreased after 20g/ml berberinetreatment. Berberine may be used to reduce tau hyperphosphorylation in AD- like tauopathyby reducing GSK-3 activity and activating PP2A which make it become a potential drug sfor Alzheimer’ Disease. sKey words: Berberine tau hyperphosphorylation Alzheimer’ disease GSK-3PP2Ac 4 论 文 论 文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师的指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除文中已标明引用的内容外，本论文不包含任何其 他人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体， 均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位 论文作者签名:余光 日期:2009 年 5 月 27 日 学位论文版权使用授权书 本学位 论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的，即:学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权 华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密?，在______年解 密后适用本授权数。 本论文属于 ? 不保密?。 (请在以上方框内打“?”) 学位论 文作者签名:余光 指导教师签名:王小川 日期:2009 年 5 月 27 日 日期:2009 年 5 月 27 日 论 文 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 前 言 阿尔茨海默病Alzheimer’ diseaseAD 是一种原发性神 经元退行性疾病，是老年 s人的多发病和常见病，患者脑内主要的神经病理特征为:神经原纤维缠结neurofibrillary tangles NFTs 和神经细胞外的老年斑senile plaque SPs。研究表明AD 患者的临床症状与脑内NFTs 的数量成正相关。NFTs 的主要组成成分是聚集成双螺旋细丝pairedhelical filament PHF的过度磷酸化的微管相关蛋白Tau蛋白12。Tau蛋白是一种微管相关蛋白主要存在于神经元具有促进微管组装和维持微管稳定的功能。在AD 患者脑中tau被异常修饰如过度磷酸化过度磷酸化的tau 丧失了tau 蛋白的正常生理功能缠结形成NFTs。目前普遍认为蛋白磷酸激酶和蛋白磷酸酯酶调节失衡直接导致了AD样Tau蛋白过度磷酸化3-6。蛋白磷酸激酶glycogen synthasekinase-3 GSK-3 78和蛋白磷酸酯酶2A67910 (protein phosphotase 2A PP2A)是其 中最重要的两个。 GSK-3有GSK-3a和GSK-3两种异构体，GSK-3是主要的Tau蛋白激酶1112 ，与AD的主要病理学机制有直接关系。在AD患者脑中GSK-3在神经元纤维缠结的神经元、老年斑、神经毡细丝、Pick小体、星形胶质细胞和螺旋体等处集聚1314。增强细胞系或大鼠脑中GSK-3活性，可显著诱导Tau多位 脑中PHFs类似15-18。GSK-3与AD所有的病理异常有关，包括点过度磷酸化，与AD 淀粉样蛋白形成老年斑1920、早老素2122 和其他AD样相关蛋白23 的相互作用等。 PP-2A是与AD样Tau蛋白过度磷酸化关系最密切的蛋白酯酶67910。异常过度磷酸化的Tau蛋白能被PP2A显著地去磷酸化24-27 。PP2A占脑中与Tau相关的所有蛋白酯酶活性的70,左右，而PP1、PP-2B 和 PP5则仅占到10,或更少。研究表明PP2A是 。在AD 患者脑中PP2A活性显著降低28 ，但PP2A活性主要的Tau蛋白磷酸酯酶10 显著下降的具体机制还不清楚。 PP2A 全酶由结构亚单位 A、调节亚单位 B 和催化亚单位 C 组成，其催化活性位于 C 亚单位，主要受全酶组装和翻译后修饰的调节29。目前已知 PP2A 翻译后催化亚 5 论 文 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文基 C 可被磷酸化和甲基化修饰。PP2A 催化亚基 Leu309 位点可逆性甲基化/去甲基化修饰，甲基化修饰受特异性的甲基转移酶(PPMT1)调节30 31 ，去甲基化修饰受特异性的甲酯酶PME-1调节32。Songtag33等发现在 AD 脑中，PP2A 甲基化水平下降，从而影响了全酶的组装，这可能是 PP2A 活性下降原因之一。在体外，PP2A 的酪氨酸 307 位点(Tyr307)能够被受体或者非受体依赖性的酪氨酸蛋白激酶如 p60 src、p56kk、胰岛素受体和表皮生长因子受体激酶所磷酸化3435 ，该位点磷酸化后 PP2A 活性显著下降36，pp60c-src 磷酸化 Tyr307 位点使 PP2A 活性下降约 90,34。 黄连素，又称小檗碱BerberineBR，是从中草药黄连等植物中提取分离得到的一类异喹啉类生物碱，属季铵类化合物。具有清火燥湿、泄火解毒的功效36。小檗碱对溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、淋球菌和弗氏、志贺氏痢疾杆菌均有抗菌作用，并有增强白血球吞噬作用。小檗碱的盐酸盐(俗称盐酸黄连素)已广泛用于治疗胃肠炎、细菌性痢疾等，对肺结核、猩红热、急性扁桃腺炎和呼吸道感染也有一定疗效 。黄连素在临床上的用途也越来越广。近年来，已有多篇国内外文献报道了小檗碱及其衍生物在治疗阿尔茨海默病(Alzheimer’ disease)的临床应用、药效机制 s以及该类化合物的构效关系等研究结果37。近年来，有研究表明，盐酸小檗碱 1. 在增加 IL-1和诱生型一氧化氮合酶的表达的同时能改善阿尔茨海默病Alzheimerdisease AD模型大鼠的空间记忆损伤38;2. 通过改变阿尔茨海默病淀粉样前蛋白的加工过程减少 A的分泌39;3. 通过减少海马神经元细胞内游离的钙离子来保护 Aβ诱导的神经元凋亡40;4. 具 有抗乙酰胆碱酯酶的活性41而成为治疗阿尔茨海默病的一种潜力药物。由异常过度磷酸化 tau 蛋白构成的神经原纤维缠结neurofibrillarytangles NFTs含量与 AD 患者的临床痴呆程度呈正相关，提示 tau 蛋白过度磷酸化促NFT 形成在 AD 发病中起关键作用。而受累神经元内蛋白激酶/蛋白磷酸酯酶动态平衡失调是导致 tau 异常过度磷酸化的主要生化机制。同时亦有报道:小檗碱可影响人类结直肠癌细胞HCT-116 cells GSK-3的活性，而后者是 AD 发病中起重要作用的一种蛋白激酶。但迄今为止，尚无直接证据表明小檗碱影响 AD 动物模型亦或是 AD 患者脑内蛋白激酶/蛋白磷酸酯酶的活性，进而影响 tau 的磷酸化程度。 花萼海绵诱癌素(Calyculin ACA)可以通过抑制 PP-2A 的活性诱导 tau 蛋白的 6 论 文 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文过度磷酸化。本实验用花萼海绵诱癌素(Calyculin ACA)作用于人胚肾转 tau 细胞(HEK293/tau)，从而盏微管相关蛋白 tau 过度磷酸化。加入不同浓度 BR 预处理，观察细胞形态及 BR 对过度磷酸化 tau 蛋白的影响，并通过免疫印迹技术(WesternBlotWB)检测相关酶 文 论 文 华 中 科 技 大 的活性，从而研究其作用机制。 7 论 学 硕 士 学 位 论 文 材料与方法 一、主要仪器 二氧化碳培养箱1815TC(SHEL-LAB，美国)，超净工作台(YJ-1450，江苏苏州净化设备公司)，倒置显微镜(XSZ-D2 ，重庆光学仪器厂)，高压蒸汽灭菌器(YXQ-SG41-280，上海医用仪器厂)，紫外分光光度仪(Pharmacia Biotech，美国)，-80?低温冰箱 心机(LXJ-11， ，上海医用(Nuarie，德国)，凝胶电泳系统(Hoefle)，离 分析仪器厂) 图象分析系统(Image pro-plus kodak， ， 美国) 微波炉(National，日本)，酶标仪(DG-3022型，Pharmacia Biotech，美国)，台式高速离心机(Sigma)，恒温水浴箱(武汉科学仪器厂)，低温高速离心机(Sigma)，恒温振荡培养摇床(武 ，汉科学仪器厂) 电泳仪DF-C型东方特力科贸中心;DY-CI型转移仪，电泳槽(Hofer，美国)，转膜仪(Bio-Rad)，旋涡混匀仪，TP-200振荡器。超声仪，扫描仪;洗片机(柯达)。旋涡混匀仪，TP-200 振荡器。Olympus FV500 激光共聚焦荧光显微镜Olympus Optical 日本 。 二、主要试剂 丙烯酰胺/N N-二甲基甲叉双丙烯酰胺(Acrylamide/Bis-Acrylamide Acr/Bis)、四甲基乙二胺 (tetramethylethylenediamineTEMED)、十二烷基磺酸钠(sodium 、dodecylsulphate SDS) 甘氨酸 、 (Glycine Gly) 小牛血清白蛋白(bovine serum albumin 、BSA) 三羟甲基氨基甲烷 、 (trishydroxymethylaminomethane Tris) 脱氧胆酸钠(sodiumdeoxycholate DOC)、苯甲磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride PMSF)、二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide DMSO)均为Sigma公司产品。过硫酸铵(ammonium persulfateAP)和二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid BCA)蛋白测定试剂盒从Pierce公司购买。预染的高分子量、DMEM 、G418和血清(fetal bovine serum FBS)从Gibico公司购买。PVDF膜从Invitrogen公司购买。免疫印迹所用抗体稀释液为含0.02NaN 3 的3BSA。增强化 8 论 文 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文学发光(enhanced chemiluminescence ECL)显色系统从Pierce公司购买。PMSF，CCK-8，DMSO，G418Hoechst 33258 购自Sigma 公司。硫酸小檗碱购于四川什邡鸿运生物化工有限公司。三、抗体(表1)四、细胞培养 1(细胞冻存保种 (1)前一天，更换新鲜完全培养基，用滴管轻轻吹打混匀细胞。高压灭菌冻存 管(规格2ml)。Tip枪头等。 (2)冻存时，丢弃旧培养基，加 入新鲜完全培养基。用滴管吹打混匀细胞。 (3)用移液器加入细胞悬液1.8ml到2ml冻存管中。 (4)用移液器加入10,DMSO，缓慢加入，并不停的摇动混匀。密封冻存管口， 标记日期，细胞名称和传代次数。 (5)放入4?冰箱，1小时。 (6)放入-20?冰箱，半个小时。 (7)迅速转入-80?冰箱或液氮中长期保存。 2(细胞复苏 (1)准备超净工作台，灭菌培养瓶，灭菌滴管，完全培养基。 (2)准备37?恒温水浴锅。 (3)迅速将冻存的细胞冻存管放入37?恒.