荧光法在对-二苯氨基苯基硼酸（DPBA）对单糖的识别作用中的应用

荧光法在对-二苯氨基苯基硼酸（DPBA）对单糖的识别作用中的应用 荧光法在对-二苯氨基苯基硼酸(DPBA)对 单糖的识别作用中的应用 山西大学(自然科学版)30(2):229,233,2007 JournalofShanxiUniversity(Nat.Sei.Ed.) 文章编号:0253—2395(2007)02—0229—05 荧光法在对一二苯氨基苯基硼酸(DPBA) 对单糖的识别作用中的应用 双少敏,程哲,王仲如,李仲辉,M.S.Wong (1.山西大学化学化工学院,山西太原030006;2.香港浸会大学化学系,香港) 摘要:采用荧光光谱法研究了具有分子内电荷转移性质的一种新型硼酸衍生物,对一二苯氨基苯基硼酸(DPBA) 与羧甲基一环糊精(CM—pICD)的包合行为,并考察了包合物DPBA在CM一CD存在下与四种单糖分子的识别 作用,实验结果明,DPBA与果糖,葡萄糖,半乳糖,甘露糖分子的结合计量比均为1:1,结合常数从大到小的顺 序为:D一果糖>>D一甘露糖>D一半乳糖?D一葡萄糖.CM一,e-CD对DPBA具有增溶增敏性,从而能够在水溶 液中更好地对糖分子进行识别. 关键词:荧光光谱;对一二苯氨基苯基硼酸(DPBA);单糖;羧甲基一环糊精(CM—CD) 中图分类号:0657.3文献标识码:A 糖类广泛地存在于生物界,是人体不可缺少的能源和生理活性物质,参与重要的生命过程,包括对外部 信号的传递和识别,细胞膜的构建等.检测或识别生物体中重要的单糖对理解生命过程有着重要的意义_1]. 目前,糖的分析方法主要有荧光法_3],吸收光谱法_4],毛细管电泳法_5],色谱法_6等.荧光分析法具有灵 敏,且通过提供分子结构和微环境的变化,分析各种健康和疾病的变化等优势L7].其中硼酸及其衍生物作为 受体对糖分子的识别被广泛的研究与应用E8,9~苯基硼酸衍生物在水中溶解度小,研究受到一定限制,但与环 糊精作用后可以增强其在水中的溶解度"],进而达到能更好地识别糖分子的目的. 近年来,分子内电荷转移(intramolecularchargetransfer,ICT)备受关注_3.具有ICT性质的化合 物,对溶剂极性等介质性质的变化较为敏感_1H].因此,在研究过程中常选ICT化合物作为荧光探针.本课 题组已研究了对一二苯氨基苯基硼酸(DPBA)的光化学及光物理行为L】.本文用羧甲基一j3一环糊精(cM—j3一 CD)对DPBA进行包合,提高DPBA的溶解性和灵敏度,进一步研究形成的包合物对单糖分子的识别作用. 1实验部分 1.1试剂与仪器 对,二苯氨基苯基硼酸(DPBA)为本实验室合成,其结 构式如图1所示.D一果糖(生化试剂,上海试剂二厂),葡萄糖 (分析纯,北京化学试剂二厂),D一半乳糖(生化试剂,上海试 剂二厂),D,甘露糖(生化试剂,上海科学用品试剂加工厂), N 台 图1对一二苯氨基苯基硼酸(DPBA)的结构 羧甲基,一环糊精(本实验室合成,MW=1431,D.S.一5.1),Fig.1Them0leeularstrueture0fcompoundDPBA 乙醇(分析纯,北京化工厂),磷酸(分析纯,北京化工厂),磷酸 二氢钠(分析纯,天津石英钟厂霸州市化工分厂),氢氧化钠(分析纯,天津市化学试剂三厂),磷酸氢二钠(分 收稿日期:2007—03—10 基金项目:国家自然科学基金(20575038) 作者简介:双少敏(1965一),女,山西交城人,博士,教授 山西大学(自然科学版) 析纯,天津市化学试剂三厂),其余试剂均为分析纯,水为二次蒸馏水. F一4500荧光分光光度计(日本日立公司),PHS一3C型精密pH计(上海雷磁仪器厂). 1.2实验方法 准确移取5×10mol/LDPBA的乙醇溶液0.1mL于10mL容量瓶中,依次加入1mL1×10.mol/L CM—B—CD的水溶液,适量0.1mol/LD一果糖(或D一半乳糖或葡萄糖或D一甘露糖)的水溶液,体系pH为8.0, 由0.5mol/L磷酸盐缓冲溶液控制,用二次蒸馏水定容至刻度,摇匀.放置30min后,置于1cm的荧光池 中,扫描荧光光谱,并测量荧光强度值.激发和发射狭缝均为5nm,激发波长固定为306nm. 2结果与讨论 2.1CM一CD对DPBA荧光光谱的影响 DPBA乙醇水溶液本身可以发射荧光,激发波长为306nm,发射波长为446nm,加入CM—CD的水溶 液后,当DPBA从乙醇水溶液中进入CM—CD中,相当于从极性大的环境进入到极性小的环境中,因而使 其最大发射峰位蓝移,随着CM—CD逐渐增加,荧光发射峰位由446nm逐渐蓝移至420nm.荧光峰强度 比未加CDs时增加了约35%,且在458nm处可以观察到有一等发射点出现(图2).说明CM一/3-CD与 DPBA形成包合物. 羧甲基一环糊精(CM—B—CD)与DPBA的包合常数可采用直接荧光法依改进的Benesi—Hildebrand方程 兰一×瓦1+求得?式中,F.Fo分别表示DPBA在有cM—p_cD 存在和无CM一13-CD存在时的荧光强度,I-P].,[CD].分别表示DPBA和CM—B—CD的总浓度,Q是包合物的 荧光量子产率,k为仪器常数,K为包合常数.由1/(F—F.)对1/[CD]作图,得一直线,线性方程为 y一8.3E一8z+0.00038,,.一0.9994,截距除以斜率求得DPBA/CM一13-CD包合物的包合常数K一4578.3 L/mo1.良好的线性关系表明,DPBA/CM—p_CD包合物的化学计量比为1:1(如图3). [CM—t3-CD](×10mol/L):(1)O.0,(2)O.20,(3)O.33, (4)0.50,(5)0.67,(6)0.83,(7)1.OO,(8)1.33,(9)i.67 图2CM—B—CD对5xi0.mol/LDPBA荧光光谱的影响 Fig.2ThefluorescencespectraofDPBAirithe presenceofCM—p—CD 1/[CM-B-CD】 图3DPBA与羧甲基一环糊精包合物的双倒数曲线 Fig.3DoublereciprocalplotsforDPBAcomplex toCM一8一CD 2.2四种单糖对包合物DPBA/CM—B—CD荧光光谱的影响 图4(P231)为化合物DPBA在pH=8.0的磷酸缓冲液(含乙醇1)中加入过量CM—B—CD后D一果糖 对荧光光谱的影响.过量的CM一13-CD将DPBA包合后,逐渐加入的D一果糖与超分子包合物进一步作用.由 图4可知,随着D一果糖的逐渐加入,发射峰位进一步蓝移(?一37nm),荧光强度明显降低(约70%),这 是由于硼酸基团结合糖后,降低了硼酸化合物的pK值,使硼酸基团由中性型体(-B(OH))变为了碱性型 双少敏等:荧光法在对一二苯氨基苯基硼酸(DPBA)对单糖识别作用中的应用23l 体(-B(OH);-),改变了硼原子的杂化态,从而使硼酸基团得电子能力降低,削弱了 DPBA分子内的电荷转 移.将DPBA在421nm与360nm处的荧光强度比值与D一果糖的浓度关联,得到荧光滴定曲线(图8, P232),根据公式一拟合滴定曲线,可得出DPBA与.一果糖的结合常数(m.l?L).式 中.为没加糖时DPBA在CM—p—CD溶液中的荧光强度,,为结合糖后荧光强度的极值.拟合曲线与实验值 很好的吻合表明DPBA与糖分子间的结合计量比为1:1,得出结合常数为(1714.2?70.4)L/mol,7|一 0.9960. Wavelength/nm [CM一~-CD]:(1)O.0,(2),(15):1.67×10-.mol/L;~DPBA]:5 ×10mol/L;ED—Fructose](×10mol/L):(1)0.0,(2)0.0,(3) 0.17,(4)0.33,(5)0.50,(6)0.67,(7)0.83,(8)1.00,(9)1.33, (10)2.00,(11)3.33,(12)5.00,(13)6.67,(14)10.00,(15)13.33 图4D一果糖对DPBA/CM—CD荧光光谱的影响 Fig.4TheeffectofD—fructoseonfluorescence spectraonDPBA/CM—B_CD Walelength/nm [CM一~-CD]:(1)O.0,(2),(15):lI67×10tool/L;[DPBA]:5 ×10一mol/L[glucose](×10一tool/L):(1)0.0,(2)0.0,(3)0. 33,(4)1.33,(5)2.00,(6)3.33,(7)5.00,(8)6.67,(9)10.00, (1O)13.33,(11)16.67 图5葡萄糖对DPBA/CM—ft-CD荧光光谱的影响 Fig.5TheeffectofD—glucoseonfluorescence spectraonDPBA|CM一CD Walvelength/nmWavelength/nm ECM—p—CD]:(1)O.0,(2)一(15):1.67×10—4mol/L}[DPBA]:5ECM一口一CD]:(1)O.0,(2)一(15):1.67×10—4mol/L;[DPBA]:5× ×10—7mol/LED—galactose]:(×10tool/L):(1)0.0,(2)0.0,10mol/LED—mannose](×10mol/L):(1)0.0,(2)0.0,(3)0. (3)0.33,(4)0.67,(5)1.33,(6)2.00,(7)3.33,(8)5.00,(9)6.67,17,(4)0.33,(5)0.67,(6)1.33,(7)2 .00,(8)2.67,(9)3.33,(1O)6. (1O)10.00,(11)13.3367,(11)10.00,(12)13.33,(13)16.67 图6D一半乳糖对DPBA/CM—cD荧光光谱的影响图7D一甘露糖对DPBA/CM—B—CD荧光光谱的影响 Fig.6TheeffectofD—galactoseonfluorescenceFig.7TheeffectofD—mannoseonfluorescence spectraonDPBAfCM——CDspectraonDPBAfCM——CD 图5,图6,图7分别为D一葡萄糖,D一半乳糖,D一甘露糖对DPBA荧光光谱的影响.图9,图10,图l1分别 占H0Il田0nl 占Is=0H?0nl 占=芒H芑?,0nl 占E0H0?0n1 山西大学(自然科学版) 为图5,图6,图7对应的.一葡萄糖,.一半乳糖,.一甘露糖的荧光滴定曲线.根据公式一拟合 滴定曲线,得出DPBA与D一葡萄糖,D一半乳糖,D一甘露糖的结合常数K. o.oooo.0020.OO40.O060.0080.0100.0120.0l4 D—FructoseConcentration(M) 图8DPBA/CM—CD对D一果糖浓度的荧光滴定曲线 Fig.8TitrationcurvesofDPBA/CM—B-CD withdifferentconcentrationofD—fructose 0.0000.0020.OO40.O060.0080.0l00.0l20.0l4 GalactoseConcentration(M, Oil300~1(120/304013060.0080-0l00-0l2?l40-0160.018 GtucoseConcentration(M) 图9DPBA/CM—日-CD对D一葡萄糖浓度荧光滴定曲线 Fig.9TitrationcurvesofDPBA/CM一CD withdifferentconcentrationofD—glucose 0JO0o0J00201304n006n0o80-0100D120.014nO160-0l8 Mannasec0neentra~onOI1) 图10DPBA/CM—CD对D一半乳糖浓度的荧光滴定曲线图11DPBA/CM—p-CD对D一甘露糖浓度的荧光滴定曲线 Fig.10TitrationcurvesofDPBA/CM—p—CDFig.11TitrationcurvesofDPBA/CM—p-CDwith withdifferentconcentrationofD—-galactosedifferentconcentrationofD—-mannose 将DPBA与四种糖的结合常数列于表1中,从表中可以很明显地看到DPBA与D一果糖的结合常数最 大,四种糖与DPBA的结合常数从大到小的顺序为果糖》甘露糖>半乳糖?葡萄糖,说明DPBA对D一果糖 具有好的选择识别能力.DPBA对D一果糖选择性识别,可能是由于果糖与其它三种单糖的分子结构存在较 大差异,导致硼酸基团与果糖结合后形成五元环状内酯,而硼酸基团与其它三种单糖结合后形成六元环状内 酯,从而出现特殊的选择性识别. 表1DPBA与单糖的结合常数值K Table1ThestabilityconstantsKoftheDPBA/CM一13-CDinvestigatedinthepresenceofsugars 单糖D一果糖(fructose)D一葡萄糖(glucose)D一半乳糖(galactose)D一甘露糖(mannose) K(L/mo1)1714.2?70.4221.9士15.2292.6士24.5409.5?31.2 r0.99600.99030.98540.9930 3结论 本文用荧光光谱法研究了对一二苯氨基苯基硼酸(DPBA)在羧甲基一l3一环糊精(CM—p-CD)存在下对四 种单糖的识别.CM——CD对DPBA具有增溶增敏性,使其在水溶液中更好地对糖 分子进行识别.DPBA对 四种单糖有不同程度的识别作用,特别对果糖具有选择性识别. 双少敏等:荧光法在对一二苯氨基苯基硼酸(DPBA)对单糖识别作用中的应用233 参考文献 r1]SPRINGSTEENG,WANGB.ADetailedExaminationofBoronicAcid— diolComplexationI-J].Tetrahedron,2002,58: 529l一53OO. 1-23DAVISAP,WAREHEMRS.CarbohydrateRecognitionThroughNoncovalentInterac tions:AChallengeForBiomim— eticandSupramolecularChemistryl'J].AngewChemIntEd,1999,38:2978—2996. 1-33ARIMORIS,BOSCHLI,WARDCJ.FluorescentInternalChargeTransfer(ICT)Sacch arideSensorI-j].Tetrahedron Lett,200l,42:4553—4555. 1-43WARDCJ,PATELP,ASHTONPR,eta1.AMolecularColourSensorForMonosacchari desI-J].ChemCommun,2000: 229—230. 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(1.SchoolofChemistryandChemicalEngineering,ShanxiUniversity,Taiyuan030006,China; 2.DepartmentofChemistry,HongKongBaptistUniversity,KowloonTong,HongKongSAR,China) Abstract:TheinclusioncomplexofP一 (diphenylamino)phenylboronicacid(DPBA)withcarboxymethyl— cyclodextrin(CM一一 CD)asafluorescentprobeformonosaccharidesrecognitionwasstudiedby fluorescencespectroscopy.ThefluorescenceintensityofDPBAwasenhancedbyforminganinclusion complexofDPBA—CM—p—CD.TheinclusioncomplexDPBA—CM—p— CDshowedlargespectralshiftsinthe emissionwavelengthandasignificantintensitychangeonbindingsaccharides.WhenD— Fructoseinteracted withDPBA—CM一一 CD,theemissionmaximashiftedfrom421nmto383nm(=306nm).These phenomenacanbeexplained?bytheintramolecularchargetransfer(ICT)mechanism.The1:1binding constantwasobtainedbyfittingthetitrationcurvesagainstmonosaccharidesandthebindingconstants followedtheorder:D—Fructose>>D—Mannose>D—Galactose-~Glucose. Keywords:fluorescencespectra;DPBA;monosaccharide;CM一一CD