他克莫司通过CaNNO通路抑制人骨髓间质干细胞增殖及向成骨细胞分化

他克莫司通过CaNNO通路抑制人骨髓间质干细胞增殖及向成骨细胞分化 中南大学 硕士学位论文他克莫司通过CaN/NO通路抑制人骨髓间质干细胞增殖及向成骨 细胞分化 姓名:韦鸿雁 申请学位级别:硕士 专业:药理学(临床药理学) 指导教师:肖洲生 20070501 摘要 目的:探讨免疫抑制剂他克莫司(,,;,,,,,,,，,,,,,)对原代人骨髓间质于细胞(,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,;,,,,, ,,,,,,,,,，舳,,,,)的增殖及向成骨细胞分化的影响及其作用机制。 研究方法:建立原代,,,,,,体外模型，在无酚红;,,,,,培养基(含,,,经葡聚糖包被炭末吸附的血清)中加入,一甘油磷酸(,,,,,,;,,,,,,,,,,,,，,,,,,)、抗坏血酸(,,,,,;,,,,, ,;,,)和地塞米松(,,,,,,,,,,,,,,,,,,)，诱导,,,,,,向成骨细胞分化。观察不同浓度的,,,,,对,,,,,,的增殖及向成骨细胞分化的影响;并分别合用雌二醇(,,,,,,,,,，,,)或白藜芦醇(,,,,,,,,,,,，,,,,)，探讨,,,,,作用于,,,,,,的分子机制。测定,(溴脱氧尿核苷(,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,)掺入率，反映细胞,,,合成即增殖情况;测定细胞内碱性磷酸酶活性(,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,，,,,)与钙沉积量，反映,,,,,,向成骨细胞分化的情况;用,,,,,,,,,,,蛋白印迹法反映,,,,,,,,,,,达的情况。用一氧化氮(,,,,,; ,,,,,，,,)试剂盒及钙调神经磷酸酶(,,,;,,,,,,,，,,,)试剂盒测定,,产量及,,,活性的变化。 结果:他克莫司(,(,,,,(,,,,,,(,,,)呈剂量依赖性地抑制,,,,,,的一氧化氮的产量，并表现为,一溴脱氧尿核苷掺入率显著降低，细胞碱性磷酸酶活性及钙沉积量明显减少。, ,(,,,(,(,的他克莫司除以上作用外，还表现为显著抑制,,,,,,的,,,活性，细胞内成骨细胞特异性转录因子,,,,,,,,,,,表达明显降低。且他克莫司(,,,,,(,,,)对,,,,,,向成骨细胞的分化的抑制作用不能被,,促进齐,雌二醇(,(,, ,,,,(,,,)及及自藜芦醇(, ,,,,,(,(,)所逆转。 结论:他克莫司呈剂量依赖性地抑制,,,,,,的增殖及其向成骨细胞的分化，其作用机制可能与其抑制,,,,,细胞内的,,,,,,,,,,,,,,,,,,信号转导通路有关( 关键词:他克莫司。人骨髓间质干细胞，,,,，,,，,,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,:,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,;, ,, ,,;,,,,,,,(,，【,,,)，,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,，,, ;,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,, ,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,;,,,,,,,,, ;,,,,(，,，,,,,,)( ,,,,,,,:,,,,,,, ,,,,,, ,,,, ;,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,，,,,;, ;,,,,,,, ,, ,,,,,, ,,,(,,,, ,—,,, ,,,,,,,,,,(,,,,,,,,;,,,,, ;,,,;,,, ,,,,,,,,，,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,?,(, ,,,,,,,,,,,,,(,, ,,?,(, ,,;,,,,; ,;,, ,,, ,, ,,,,?,, „,,,,,,;,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,;,,, ,,,,,,,,,,,; ,,,,,,,,,,,,,,,(,圮;,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,, ,,,,,(,(,,。,(,雎,,,?,(,),,,,, ,, ,, ;,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,嗽，,(,,,,,,?,,,),, ,,,,,,,,,,, ,,,, , ,,,,?,,,),,,,,,,,(研,, ;,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,, ,, ,,,, ,,;,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,; ,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,, ;,,,,,, ,,, ,,,,,,,, ,, ;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,;,,,,,,, ,, ;,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,(,，聊,;,,,,,, ,,, ;,,;,,, ,,,,,,,,,,(,,,,,; ,,,,, ,,,),,,,,;,,,, ,,,;,,;,,,,,,,(,,,),;,,,,,, ,,,, ,,,,,,,, ,, ,,,,, ;,,,,,;,,, ,,,, ,,,, ,, ,,, ,,, ;,,,,,,, ,,,,, ,,,(,,,,,贮,,,,,,,( ，, ,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,, ;,,, ,,,,,,, ,,;,,, , ,(,,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,( ,,,,,,,:,,【,,,(,(,, ,(,,,,,?,,,),,,,,,,, ,, , ,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,, ,, ;,,, ,,,,,,,,,,,,,勰,,,,,,,, ,, ,,;,,,,,, ,,,,,,;,,,,,,,,,,，,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,; ,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,, ,,,,,,;,,,, ,, ;,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,(,,,),;,,,,,, ,,, ;,,;,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,, ;,,,,,,,(,,,,, ,,,, ,,,,,,,,, ,, , ,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,, ,, ,, ,,,,,,,,,(,,【,,,(, ,,,,?,,,),,,,,,,, ,,,,;,, ,,,,;,,,,,, ,, ,,,, ,, ,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,(,,,,,,,，,,(,(,,,,,,?,,),, ,,,,(, ,,,,?,,,),,,, ,, ,,,,,,, ,,, ,,,,,(,,,,,?,,,,一,,,,;,, ,,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,,,,; ,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ;,,,,,,,( ,,,;,,,,,,:,,,,, ,,,,,,,,, ;,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,; ?,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,, ;,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,(,,, ,,,,, ,,;,,,,,,,，,,,,, ,,,, ,,,,,,—,,,,,,, ,,,,,;,,,,,,,,, ;,,,,，,,,，,,，,,,,,,,,,,, , 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注 和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证而使用过的。与我共同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了明确的说明。 作者签名:——日期: 年』一日 关于学位论文使用授权说明本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即:学校有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅;学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其他手段保存学位论文;学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。作者签名:——导师签名:——日期:——年一月一,,塑?堂位论室 蓝直 第一章前言 他克奠司(,,;,,,,,,,，,,,,,)是,,,,年,,,,，;, ,,在真菌产物中寻找一种特异性的?，,抑制剂时发现的一种全新的免疫抑制剂一一个新的第,,个大环内酯类抗生素【,】，现在已经成为第三代免疫抑制剂。他克莫司，隶属于一种放线菌类链霉菌属的代谢产物，于,,,,年首次在小鼠体外心脏异体移植中证实有抗免疫活性，并且很快在一系列的实验模型中发现是环孢素,(,,;,,,,,,,,,，,,,)强力的替代者。,,,,年，匹兹堡大学,,,,,,教授首次进行了临床试验。,,,,年,硒,,在日本首次上市，随后,,,,,在美国、英国、德国等国家相继上市,,，,,。,，,,,,与第二代免疫抑制剂,,,一样，临床主要用于肝肾移植后宿主抗移植物的免疫排斥反应，而且有取代,,,的趋势。此药虽然与这种经典的免疫抑制剂结构不同，但是其机制类似:主要为钙调神经磷酸酶(,,,;,,,,,,，;删特异性抑制剂。其机制为先与,细胞浆中的特异性亲免素受体(,,(,,, ,,,,,,, ,,,,,,, ,,，,,,,,,,)结合，形成药物蛋白受体复合物，然后抑制钙离子依赖性的钙调神经磷酸酶活性，进而抑制,细胞活化因子(,,;,,,, ,,;,,, ,, ,;,,,,,;, , ,,,,,，,,,盯)，最终抑制了诸多细胞因子的表达，如白介素(，,,,,,,,,,,，?，,)(免疫反应性纤维素一,(,,,,,,,,,,,，，,,,,)等旧。麟表现为强大的抗免疫活性，它的发现不仅有助于临床器官移植治疗的进程，而且有助于基础研究在,细胞活性信号转导的分类等相关研究。 目前，,,,,,主要用于肝肾移植术后移植物抗宿主的免疫反应，而且已经表现出在抗急性移植物抗宿主病变(,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,鼢?，,,,,)较环孢素,更为有效闭。虽然,,,,,对于急性免疫排斥反应比,,,优越，但是病人,年存活率以及移植器官的存活率并没有统计上的差别。而且两者都有诸多的副作用:肾毒性嘲，机会性感染、恶性肿瘤,、高血压啪、血脂紊乱、神经毒性、血糖升高嘲，以及快速的骨质疏松“”。因此引起了众多研究者的关注和机制方面的研究。 众所周知，高血压病与血管内皮细胞一氧化氮(,,,,,,,, ,,,,,,,,,，,,) 的释放量减少有关。,,在一定浓度范围内升高，可以使血管平滑肌细胞舒张， 血管舒张血压下降。反之则血压升高““。有关试验证实,【,,,可使血浆中,, 释放量减少;又有试验说明,,,,,使血管内皮细胞一氧化氮合酶(,,,,,; ,,,,, ,,,,,,,,，,,,)生成减少，导致,,释放量减少，,习。 雌激素缺乏是绝经后骨质疏松症重要的致病因素之一咖“(】。虽然现在广泛使用雌激素替代疗法(,,,,,,, ,,,,,;,,,,, ,,,,,,,，,,,)用于预防和治疗绝经后骨质疏松症，但长期使用伴随的不良反应，如子宫内膜过度增生及子宫出血、增加乳腺癌风 险性等。”，限制了此类药物的长期普遍使用，因此寻找其他的药物或治疗方法尤为必要。最近有研究报道，植物雌激素白藜芦醇(,,,,,,,,,,,，,,,,)可以避免以上的副作用，可用于治疗绝经后骨质疏松症“”。 我们及其他试验室均发现，,, ,,一雌二醇(,,,,,,,,,,,,,，,,)及植物雌激素白藜芦醇(,,,,)对成骨细胞增殖和分化的刺激作用部分由一氧化氮(,,)介导〔,,,,,,。我们先前的研究表明，体内内源性一氧化氮合酶(,,,)抑制物非对称性二甲基精氨酸(,,,,,,,,; ,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,)可以损害原代培养的小鼠骨髓来源的问质干细胞向成骨细胞分化九。此外，,,也是骨转换过程中重要的信号传导分子。,制。以上表明,,在成骨细胞介导的骨形成和骨转换过程中起着极其重要的作用。 文献最初报道,,,在调节破骨细胞形成和功能上有着重要的作用。,,,,,过量表达可通过抑制成熟的破骨细胞达到抑制骨吸收的目的嗍。最近在细胞及动物在体试验证实,,,可同时通过成骨细胞正向调节骨的形成嘲。目前虽已明确,,,,,为,,,特异性抑制剂，但其毒副作用机制仍在探讨之中。最近有文献提出,,,,,通过抑制肾脏传入神经中,,,活性，导致血压升高闭;另有试验表明，,,，,,,通过抑制骨组织,,,活性，导致肾移植患者骨质疏松田，( 骨髓腔是两种干细胞的贮存库，包括造血干细胞和骨髓间质干细胞(,,,,,,,,,;,,,,, ,,,, ,,,,,，,,,,,)。,,,,,来源于中胚层，是一类具有很强的自我增殖能力和多向分化潜能的干细胞，可在不同诱导剂的诱导下分化成多种细胞的前体细胞，如脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、成纤维细胞等…(,,,,虽然在骨髓中含量极少，约只占骨髓有核细胞的十万分之一例，但,,,,,是出生后骨改建过程中成骨细胞最主要的来源，对骨总量的维持具有重要意义;并可以在体外分离及大量扩增培养。因此，体外培养,,,,,为我们提供了一个很好的研究成骨细胞分化调控的体外模型。 在本研究中，我们假设原代人骨髓间质干细胞(,,,,,,)能对,,,,,刺激发生反应，并且,,,,,,信号途径是,,,,,效应发挥过程中的重要信号传导通路。为证实这一假设，我们在体外培养相对均质的原代,,,,,,，诱导其向成骨细胞分化;在此基础上，观察,,【,,,对,,,,,,的细胞增殖和向成骨细胞分化的影响，考察该效应是否与一氧化氮(,,)有关;并进一步探讨,,,信号传导通路在,,,,,效应中的介导作用。从而阐明,,,,,对原代,,,,,,增殖和向成骨细胞分化的影响以及与,,,,,,信号途径的关系。 , 第二章 材料与方法,(,试剂 ,,,蹦、无酚红,—,脚、胎牛血清(,,,)、青一链霉素溶液(,,,)、十二烷基磺酸钠(,,,)购自美国,，,,, ,,,(,,,,, ，,,,,,，,,，,,,)。他克莫司(,,,,,)白藜芦醇(,,,,,)、,, ,一雌二醇(,,)、胰蛋白酶、维生素,(,,,,)、,一甘油磷酸(,,,,)、对硝基酚(,,,)、二乙醇胺、磷酸对硝基酚(,,,,)、二甲基亚砜(,惦,)、葡聚糖包被炭末购自美国,,,,, ,,,,,;,, ,,((,,(,,,,,,，,,，,,,)。,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,购自美国,,,,,;,,公司;,,, ,,,;,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,, ,,,,为,，,,,, ,,,,,,， ,,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,。,,,,,表达抗体购自美国,,,, ,,,,, ,,,, ,,;,,,,,,, ，,;((,,,,,,,，姒，,,,)。与辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔二抗、牛血清白蛋白(,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,，,,,)、考马斯亮蓝染色液、,,,蛋白浓度测定试剂盒等均购自碧云天生物试剂公司。化学发光底物试剂盒购自博士德公司。钙试剂盒购自上海科华生物技术有限公司。细胞培养板、培养瓶及培养皿购自美国,,,,,,,—;,,,,, ,,((,,,,,,,,;,,,,,，,,，,,,)。其他化学试剂均为分析等级，购自上海生物科技有限公司。,(,仪器 ;砚培养箱(美国,,,,,,,公司)、超净工作台(中国苏净集团)、倒置显微镜(日本,,,,,公司)、电子天平、低速冷冻离心机、高速冷冻离心机(美国,,,,,公司)、细胞超声破碎仪、紫外可见光分光光度计(日本,,,,,,,,公司)、酶标仪、凝胶成像分析系统(上海天能)、高温烤箱、水平摇床、稳压稳流电泳仪、垂直电泳槽(北京六一仪器厂)。,(,细胞培养 经孕妇自愿捐献，取,,,月左右水囊引产胎儿，用酒精消毒胎儿四肢，取出四肢长骨(遵循湖南省伦理委员会的伦理学，并经湖南省卫生厅同意)。在超净操作台中剥尽肌肉和骨膜，剪去两端骨骺，用, ,,一次性注射器冲洗骨髓腔。冲洗液以,,,,转,秒的速度，,?离心,,分钟;弃掉上清，加入,,,,含,,,,,,的,一删培养液重悬细胞。将细胞的浓度调整至每毫升,,,个，将重悬液以,:,比例缓慢加入装有, ,, ,,;,,,淋巴分离液的的离心管中，以,,,,转,分速度离心,,分钟，可见淋巴细胞分离液分层。小心吸出培基和分离液之间的间质干细胞层，放入塑料离心管中，用,一把,培养基洗涤,次(,,,,转,分， ,,—,,分钟)。加入含有,,,,,,的,—,,,重悬。将浓度调整至每毫升,,,个细胞，种入,,;,,的塑料培养瓶中，置于,,。,，,,,,,培养箱中孵育。,天后换一半培基，,天后更换全部培基，除去未贴壁的细胞。细胞长满培养瓶底部,,,左右后，用,(,,,胰蛋白酶消化，传代培养，到第四代细胞生长已基本稳定。取第四,六代细胞以,×,,„;,,,,?，，，,“的密度种板，细胞贴壁后，培基换为含,,,,,,(经葡聚糖包被的炭末吸附，,,,)的无酚红,—,,,，加入促进,,,,,,向成骨细胞分化的促分化剂(,, ,,,,?,‟,地塞米松，,, ,,?,,维生素;及,,,,,,?,,, ,一甘油磷酸，,,)。同时给予不同的处理。以后每三天更换培基，并加药。,(,实验与分组 溶媒对照组(,(,,,,,,)、,:(,(,, ,,,?,,,)及不同浓度的,,,,,(,(,,,,(,帅,,?,,,)处理组，以观察不同浓度的,,,,,对,,,,,,增殖以及向成骨细胞分化的量效关系; 溶媒对照组(,(,,,,,,)、,,,,,(, ,,,,?,,,)、,(,(,, ,,,,?,。,)、,,,,(,,„,,,?,,)、,,,,,(,啪,,?,,,)，,,(,(,,岫,,?,,)及,,,,,(, ,,,,?,,,)，,,,,(,岫,,?,,)处理组，以观察,,,,,对,,,,,,增殖及向成骨细胞分化的影响是否通过一氧化氮(,,,,,; ,,,,,，,,)介导。 溶媒对照组(,(,,,,,,)、,,(,,,(, ,,,?,,„)、,,(,(,,岫,,?,,,)、,,,,(,岫,,?,,)处理组、,,(,,,(,?,,?,,,)，,,(,(,,帅,,?,『,)及,,,,,(, ,,,?,,)，,,,,(, ,,,,,?,『„)处理组，以观察钙调神经磷酸酶(,,,;,,,,,,,，,,,)通路是否介导, ,,,,对,,,,,,的作用。 溶媒对照组(,(,,,,,,)，,,,,,(, ,,,?,。,)、,,(,(,, ,,,,?,,,)、,,,,(,岫,,?,(,)处理组、,,,,,(, ,,,?,,)，,:(,(,,岫,,?,,,)及,,,,,(,岫,,?,。,)，,,,,(，岫,,?,,,)处理组，以观察,,,,,对,,,,,表达的影响。,(,观察指标,(,(,细胞增殖的指标:,一溴脱氧尿核苷掺入率测定 ,,,,,,以,×,,„;,,,,?,,,,的密度种入,,孔板，用含,,,,,,(灭活)的,—,,,培养,,小时，使细胞贴壁;而后换上含,(,,,,,(灭活)的无酚红,一删培基再培养,,小时，以使所有细胞生长同步化;再在接下来的两天中，给予含,(,,,,,(,;,)的无酚红培基，并按实验设计加以不同药物处理;在最 ,后的,,小时，加入,一溴脱氧尿核苷一同孵育。此后，用磷酸盐缓冲液(,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,，,,,)洗涤细胞,, , ,,,、固定液室温固定,, ,,,，用洗液洗涤细胞,,, ,,,，再加入,一溴脱氧尿核苷一抗,,, ,,室温孵育,小时:再用洗液洗涤细胞,,, ,,,，加入与辣根过氧化物酶偶联的抗鼠，,,二抗,,,儿室温孵育,,分钟;用洗液洗涤细胞,,, ,,,，每孔加入,,,虬发光底物，在暗处室温孵育,,分钟，待试剂颜色变为蓝色，加入终止试剂,,,儿，可见每孔颜色由蓝色变为亮绿色。此时用酶标仪在,,,,,波长处测吸光度(,,值)。,(,(, ,,,,,,向成骨细胞分化的指标,(,(,(, ,,,,,,,,,,,，，早期指标一细胞内碱性磷酸酶(,,,,, ,,, ,,)活性测定 按照我们以前研究中所用到的方法测定,,,活性洲(细胞按指定时间孵育后，弃去培基，用,,,洗涤细胞,次，并用,(,,,胰蛋白酶消化,,,,,,，待细胞相互分离后收集细胞。细胞内,,,活性测定底物为,,,,,,,,?,,, ,,,,,，反应液,,值为,,(,，,,(;反应,,分钟，加,(, ,,,?,,‟,,,,终止反应，,,,,,,处测定吸光度。同时用考马斯亮蓝法测定培养细胞总蛋白质含量。,,,活性用总蛋白含量校正，并表示为,,,,?,,,?,, ,,,,,,,,,(,(,(,(,晚期指标一钙沉积量(,,，;,哪,,,,,,,,,,)测定 ,,,,,,的钙化通过改进的,,,,法测定洲。细胞按指定时间孵育后，用,,,洗涤细胞,次，,(, ,,,,,,, ,,， ,,, ,,,脱钙,,,，用钙离子测定试剂盒经,,,法检测样本,;,上清液中的钙离子浓度，从而反映细胞中的钙含量。而脱钙后的细胞，用裂解液(,(，,,,?,,, ,,,,、,(,,,,,),,, ,,使细胞裂解，并用,,,试剂盒测定细胞裂解液中总蛋白质含量。钙沉积量用总蛋白含量校正，并表示为,,?鹏,,,,,,,,。,(,(,,,产量的测定 ,,,,,,法测定培养液中硝酸盐和亚硝酸盐产量以间接反映,,释放量。在第,天收集细胞培养液，,,, ,,培养液或,,, ,,硝酸盐标准液(,,,,, ,,,,,)与,,, ,, ,,,,,,试剂混匀。在,,, ,,处测定吸光度，根据标准曲线计算硝酸盐和亚硝酸盐的量，,,释放量以硝酸盐和亚硝酸盐量表示(,(,(, ,,,活性的测定 ,硒?堂位论奎 挝魁与左溘 ,,,,,,以,, , ,,;,,,,?,,,,,的密度种入,,孔板。先给予,,,,,,含血清的培基培养,,小时，以保证其贴壁。而后，为使细胞同步化并且减少,,,的基础活性，将细胞置于仅含,(,,,,,的培基中孵育,,小时，然后在给予 不同药物刺激之前,小时及药物处理期间，实施血清饥饿，即不给予任何血清。处理,,小时后，收集细胞。培养的细胞用,,,(,,?, ,,,,，,, ,(,。,,, ,,,,,,)洗涤，冰上操作，加细胞裂解液(,, ,, ,,,,，,, ,(,，,(,枷,,,,，,(,,, ,,,,，, ,, ,,,。,(,,, ,,,,,)裂解细胞，收集细胞裂解物。,,, ,,,,,离，,，,,分钟，收集上清(,,,)。将树脂水化后置于色谱柱，用细胞裂解液平衡树脂，将样本,,,在色谱柱中,?低温离心，收集离心所得物，进行下步试验。我们用,，，,磷酸肽作为,,,高度特异性底物，根据,,,作用于,，，一磷酸肽释放出磷酸根离子的量间接体现,,,活性。其主要过程为如果,，，,磷酸肽中加入含,,,的样本,,,，就能释放出磷酸根离子。而磷酸根离子会使孔雀绿变绿色，此时用酶标仪在特定波长下可测定孔雀绿的吸光度(即,,值)，然后根据标准直线就能计算出磷酸根离子释放量，从而间接体现,,,活性。,，，,磷酸肽作用底物有两种，一种为含钙离子吸附剂乙二醇二乙醚二胺四乙酸(,,,,,,,,,,,;,,,,,,(,一,,,,,,,,,, ,,,,,)，,,,,)缓冲液，一种不含,,,,。在不含,,,,的底物中，样品,,,释放的磷酸根离子量为总的磷酸根离子;其值减去含,,,,的底物中,,,释放的磷酸根离子量，即为我们所求之值。,(,(, ,,,,,,, ,，,,蛋白印迹法研究,,,,,的作用 先给予腿,,;,含血清的培基,,小时，以保证其贴壁。而后，为使细胞同步化并且减少,,,,,的基础表达量，将细胞置于仅含,(,,,,,的培基中孵育,,小时，然后在给予不同药物刺激之前,小时及药物处理期间，实施血清饥饿，即不给予任何血清。处理,,小时后，收集细胞。培养的细胞用,,,洗涤，冰上操作，加细胞裂解液(,,,?, ,,,,，,,,(,，,,,,,，以及,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,， ?一,,,;,,,,,,,,,,,,，,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,，,,,,,, ,,,,,,,,，,,,,，,,,,,,,,,)裂解细胞(临用前加蛋白酶抑制剂,,,,)，收集细胞裂解物。细胞裂解物蛋白定量及变性后，与, ,,,,,,,,,上样缓冲液混合，上样，在,,,—,,,,胶中稳压电泳分离，然后稳流电转移至,,,,膜。先用封闭液(,,,,,,),”,冰箱摇床轻摇过夜，封闭,,,,膜上非特异性抗体，之后用,,,,,洗膜,×,,分钟:然后用特异性抗体标识一抗,,,,,(,:,,,)，,”,冰箱摇床轻摇过夜，用,,,,,洗,,,,分钟;再用二抗羊抗兔(,:,,,,)室温孵育,小时后，,,,,,洗,,,,分钟。最后通过辣根过氧化物化学发光反应在暗室显影、定影,光片。 ,,(,结果统计 所有参数用均数?标准差(,,,,,,,,,)表示，采用单因素方差分析,,,,,,,,,,,,,)进行统计分析。概率,,,(,,表示在统计学上差异具有显著性。 ,亟?堂位,金塞 筮三重结墨 第三章 结果,(, ,,,,,,的生长及形态 原代,,,,,,置于培养瓶中培养,小时后开始贴壁，,,小时贴壁可达到,,,。初期细胞伸展贴壁后，开始分裂增殖，呈集落生长。,—,天后胞体鸾ケ涞么执螅 识嘟切危 邢赋さ耐黄穑ㄍ迹 保 ,固熳笥蚁赴 搪 康祝 食に笮危 帕姓 耄ㄍ迹 玻 , 笊 っ飨约涌欤 丁 感?笨赏耆 冢 食に笮位蚨嘟切危 程炷艽锏窖侨诤稀, 降谒拇 赴 ひ亚饔谖榷ǎ 尤氪俜只 梁蟪中 嘌 仓埽 赴 食に笮胃床闵 ぃㄍ迹 常 ,常 ?,,,,,抑制原代,,,,,,增殖及向成骨细胞分化 预实验结果显示,,,,,,的,,,活性在矿化液诱导下第,,天达到高峰，并在第,,天已经出现下降趋势(图,)。经过,,,,或,。处理后的,,,,,,其,,,活性相应升高，但,,,表达时空效性仍维持不变。我们及其他实验室均证实体外培养的,,,,,,在,,天内矿化物质已明显沉积于细胞层之中,,。因此，我们分别选择在药物处理后最敏感第,天测定,,,活性和第,,天测定钙沉积量的变化。 如图,—,所示，,,,,,呈剂量依赖性(,(,,,,(, ,,,,?,,,)的抑制,,,,,,的,,溴脱氧尿核苷掺入率，并在,(,,,,,,?,(,的浓度就开始有显著性差异，至,(, ,,,,?,,,达到最大效应;而后剂量再减小(,(,,, ,,,,?,,,)，,,,,,就没有显著性差异(结果未显示)。类似的剂量依赖效应也见于,,,,,处理后第,天时对,,,,,, ,,,活性的抑制，,,,,,?,,,达到最大效应(图,—,)。,,,,,对,,,,,,的钙沉积的抑制作用相比 略蛏晕? 酰海?,,,,?,, „,,的,,,,,才开始显著减少钙沉积量，而此浓度也达到了最佳效应(, ,,, ,,,,,使,一溴脱氧尿核苷掺入率，细胞,,,活性和钙沉积量分别减少,,(,,，,,(,,和,,(,,。(图,—,)。根据以上实验结果， , ,,,,?,,,是,,,,,抑制,,,,,,增殖及向成骨细胞分化的最佳有效浓度，因此我们选用此浓度的,,,,,来继续进行后面的机制探讨实验。,(, ,,,,,对人类骨髓问质干细胞,,生成量的影晌 ,,,,,(,(,,,,(,,,,,,,)孵育第,天时的人类骨髓间质干细胞培养上清中,,的代谢物硝酸盐和亚硝酸盐的含量与溶媒对照组相比降低。其中, ,,,,,,组的效应具有统计学显著性(,,,(,,)(,(,(,, ,,,,,,)和,,,,(, ,,,,,,)表现的作用与,,,,,相反。,,,,,(,,,,,,,)对,,的合成，不能被,。(,(,, ,,,,,,)和,,,,(, ,,,,,,)所逆转。,(, ,,,,,对人类骨髓问质干细胞,,,活性的影响 ,,,,,(,,,,,,,)处理人类骨髓间质干细胞,,小时后，,,,释放的磷酸根离子与空白对照组相比明显降低，而且有统计学差异。,,(,(,,,,,,,,)和,,,,(,,,,,,,)处理组,,,活性没有明显改变。,,,,,(,,,,,,,)对,,,活性的抑制作用同样不能被,,(,(,, ,,,,,,)和,,,,(, ,,,,,,)所逆转。,(, ,,,,,对人类骨髓间质干细胞,,,,,,,,,,,表达的影响 免疫印迹结果表明:,,,,,(, ,,,,,)处理人类骨髓间质干细胞,,小时后，其,,,,,,,,,,,表达量相对于看家基因,,,,;,,, ,,,,表达量明显降低。,,(,(,,,,,,,,)和,,,,(,,,,,,,)单独处理组,,,,,,,,,,,表达量显著增加，但是同样剂量的,,和,,,,不能逆转,,,,,(, ,,,,,,)对,,,,,,,,,,表达的抑制作用。,(,图表及图例 ,,,,,,,:,,, ,,;,,,, ,, ,,,,,,, ,,,,,, ;,,,,,,, ,, ,,, ,(×,,,)( , ,,,,,, ,:,,, ,,;,,,, ,, ,,,,,,, ,,,,,, ;,,,,,,, ,, , ,,,,(×,,,)(,,,,,, ,:,,, ,,;,,,, ,, ,,,,,,(,,,,,,, ,);,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,, ,,,,, ,,(×,,,)(亟?堂僮论奎 差三重结星 ? 弱 ? 笛 ? ,, 竹 , 一，,,,,西,(。; 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