为了正常的体验网站,请在浏览器设置里面开启Javascript功能!
首页 > IL-33TLRs信号通路在A549细胞上皮-间质转化中的作用

IL-33TLRs信号通路在A549细胞上皮-间质转化中的作用

2019-01-11 14页 doc 59KB 18阅读

用户头像

is_358746

暂无简介

举报
IL-33TLRs信号通路在A549细胞上皮-间质转化中的作用IL-33/TLRs信号通路在A549细胞上皮-间质转化中的作用 摘要 目的 观察生长转化因子β1(TGF-β1)对上皮来源的A549细胞增殖及相关细胞标记物的影响,探讨IL-33/TLR4信号通路在上皮来源的A549细胞上皮-间质转化中的作用。 方法 培养A549细胞,用5ng/ml的TGF-β1刺激A549细胞;在不同时间点,MTT法检测TGF-β1对A549细胞增殖的影响;Real-time PCR方法检测IL-33/TLR4信号通路中关键因子IL-33,TLR4、PI3K基因的表达改变;western blot方法检测...
IL-33TLRs信号通路在A549细胞上皮-间质转化中的作用
IL-33/TLRs信号通路在A549细胞上皮-间质转化中的作用 摘要 目的 观察生长转化因子β1(TGF-β1)对上皮来源的A549细胞增殖及相关细胞标记物的影响,探讨IL-33/TLR4信号通路在上皮来源的A549细胞上皮-间质转化中的作用。 方法 培养A549细胞,用5ng/ml的TGF-β1刺激A549细胞;在不同时间点,MTT法检测TGF-β1对A549细胞增殖的影响;Real-time PCR方法检测IL-33/TLR4信号通路中关键因子IL-33,TLR4、PI3K基因的表达改变;western blot方法检测α-SMA, E-cad, p-AKT蛋白的动态表达。 结果 (1).MTT结果显示,各组细胞生长良好,随时间的延长,细胞数量逐渐增多,但加入5ng/ml TGF-β1刺激12h,24h,48h后,A549细胞的增值与对照组相比,无统计学意义(P>0.05)。 (2).在5ng/ml的TGF-β1刺激下,A549细胞与对照组相比,E-cad蛋白表达量逐渐下降(P<0.05),而α-SMA的表达呈逐渐上升的趋势(P<0.05)。提示,A549细胞上皮细胞特征逐渐减少,而间质细胞特征逐渐增多,即A549细胞发生了上皮-间质转化。 (3). Real-time PCR结果显示,经5ng/ml的TGF-β1处理的A549细胞与对照组相比,在12h、24h、48h,IL-33/TLR4信号通路的关键基因IL-33、TLR4均呈先升高后下降的趋势,在24h时表达量最高,差异有统计学意义(P<0.05)。 (4).western blot结果显示,经5ng/ml的TGF-β1处理的A549细胞,随时间的延长,在12h、24h、48h,p-AKT的表达量逐渐升高,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。 结论 (1)5ng/ml的TGF-β1刺激A549细胞后,上皮细胞标志性蛋白E-Cad表达逐渐降低,间充质细胞标志性蛋白α-SMA表达逐渐升高,即TGF-β1诱导A549细胞过程中存在上皮-间质转化(EMT),提示EMT与纤维化病变密切相关。 (2)  在TGF-β1诱导的A549细胞上皮间质转化过程中,存在IL-33、TLR4等的过表达,提示IL-33/TLR4信号通路发挥了作用。 (3)  在EMT过程中,PI3K/AKT信号通路被激活,TLR4能与PI3K结合,而TLR4的激活依赖于IL-33,故推测PI3K/AKT信号通路的激活与IL-33的过表达有关。 (4)EMT过程中,存在IL-33、TLR4呈先升高后下降的趋势,提示肺组织受损伤后,IL-33作为警报素,启动肺组织的自我修复,参与了肺纤维化的形成。 关键词 上皮-间质转化 (EMT);白细胞介素-33(IL-33); Toll样受体(TLRs);磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)。 Abstract Objective: To investigate the effects of A549 cells on the cell proliferation of epithelial origin and related cell markers by TGFβ1.To investigate the role of IL-33/TLR4 signaling pathway in A549 cells in epithelial mesenchymal transition Methods: Cultured A549 cells were treated by TGFβ1 (5ng/ml).The effect of proliferation of A549 was detected by MTT at different time. The expression of the key factor IL-33、TLR4、PI3K in the IL-33/TLR4 signal pathway was determined by Real-time PCR. The dynamic protein expression of α-SMA、E-cad、p-AKT was determined by western blot analysis. Results: (1) MTT results showed that the cells grew well in every group. With the prolongation of the time, the cells gradually increased in number. But with the addition of TGFβ1(5ng/ml) stimulates 12h、24h、48h. The proliferation of the A549 cells has no statistical significance compared with the control group(P>0.05). (2)With the stimulation of the TGFβ1(5ng/ml).The expression of the epithelial cell marker protein E-cad decreased gradually(P<0.05).But the expression of α-SMA showed an increasing tendency(P<0.05).The results suggested that the characteristics of the epithelial cells decreased gradually. But the characteristics of the mesenchymal cells increased gradually. Epithelial mesenchymal transition happened in the A549 cells. (3)The results of the Real-time PCR showed that the expression of the IL-33 and TLR4 in the IL-33/TLR4 signal pathway of the A549 cells treated by TGFβ1 (5ng/ml) were first increased and then decreased In 12h, 24h, 48h compared with the control group. The expression in the 24h was the highest, the difference was statistically significant (P<0.05). (4) The results of the western blot showed that the expression of the p-AKT in the A549 cells which is treated by TGFβ1 (5ng/ml) increased gradually compared with the control group with the extension of time(in 12h, 24h, 48h).The difference was statistically significant(P<0.05). Conclusion: (1) After the stimulation of the TGFβ1 in the A549 cells. The expression of the epithelial cell marker protein E-cad decreased gradually. But the expression of the Mesenchymal cell marker protein α-SMA increased gradually. The results showed that epithelial mesenchymal transition is induced by TGFβ1 in A549 cell. It confirmed that epithelial mesenchymal transition is closely related to pulmonary fibrosis. (2) In the process of epithelial mesenchymal transition induced by TGFβ1 in A549 cell. The expression of IL-33, TLR4, p-AKT increased, It was inferred that in the process of the epithelial cell injury and the excessive repair of the mesenchymal cell, the over expression of IL-33 and TLR4 played a role in IL-33/TLR4 signaling pathway. (3)The expression of the p-AKT increased gradually with the extension of the time. So in the process of epithelial mesenchymal transition, PI3K/AKT signaling pathway is activated. TLR4 can bind to PI3K and the activation of TLR4 depended on IL-33.It was inferred that the activation of the PI3K/AKT pathway was associated with the overexpression of IL-33. (4) With the extension of time, IL-33 and TLR4 increased first and then decreased. Combined with our previous study, we speculated that when lung was injured, IL-33 played a role of warning. It started the repair of lung tissue. With the extension of the time, the effect of the IL-33 decreased. TLR4 which is the downstream of the IL-33 also increased firstly and then decreased, and the activation of PI3K/AKT pathway presents the cascade. The downstream molecules gradually activated, ultimately involved in the process of pulmonary fibrosis. Keywords:epithelial mesenchymaltransition(EMT);Interleukin-33(IL-33);Toll like receptors (TLRs);phosphatidylinositol -3- kinase(PI3K). 第一章 绪论 1 间质性肺病的概述及研究进展 间质性肺疾病(ILD,interstitial lung disease),又称为弥漫性肺实质性疾病(diffuse parenchymal lung disease,DPLD),是由多组疾病组成的一类不同性质的疾病,包括200多个病种。基本病理变化为弥漫性肺实质、肺泡炎症和间质纤维化,临床上主要表现为X线胸片弥漫性浸润阴影、进行性加重的呼吸困难、限制性通气障碍、弥散功能降低和低氧血症。目前国际上将ILD/ DPLD分为四类:(1)已知病因的间质性肺疾病:如药物,结缔组织疾病相关的肺部病变等;(2) 少见的间质性肺疾病,如慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、朗格罕斯细胞肉芽肿病、淋巴管平滑肌瘤病、肺出血-肾炎综合征即Goodpasture 综合征等; (3) 肉芽肿性间质性肺疾病,如外源过敏性肺泡炎、结节病、Wegenerr肉芽肿等; (4)特发性间质性肺炎(idiopathic interstitial pneumonia,IIP):寻常性/特发性即UIP/IPF、脱屑性间质性肺炎(DIP)、非特异性间质性肺炎(NSIP)、淋巴细胞性间质性肺炎(LIP)、急性间质性肺炎(AIP)、呼吸性细支气管炎性间质性肺病(RB-ILD)、隐源性机化性肺炎(COP)[1]。 特发性肺纤维化(IPF,idiopathic pulmonary fibrosis)是最常见的肺间质疾病,也是肺间质纤维化的主要原因。2011年美国胸科学会(ATS),欧洲呼吸学会(ERS),日本呼吸学会(JRS),拉丁美洲胸科学会(ALAT)共同发表了关于IPF的最新研究概况的循证指南,为IPF的诊疗提供了更加完善的方案。IPF是一种不明原因的、慢性、进展性的肺部弥漫性疾病,病变部位局限于肺组织,主要表现为呼吸困难和肺功能的障碍。该指南提出诊断IPF时,需排除其他已知原因的引起的ILD,同时强调了高分辨率CT(HRCT)在IPF诊断中的重要性[2]。疾病的发展是一个动态过程,在临床上需结合症状、体征、职业史、用药史、环境因素、影像学检查、肺功能、病理活检、支气管肺泡灌洗等相关检查,对IPF进行全面细致的诊断。由于诊断技术的不断提高,IPF的检出率不断增加,但目前的治疗手段并未获得满意的疗效。在药物治疗治疗方面,指南提出目前尚无有明确疗效的药物。糖皮质激素、秋水仙碱、环孢素A、免疫抑制剂、乙酰半胱氨酸、干扰素-γ等传统药物的治疗效果尚不肯定,对于愿意接受药物治疗的诊断明确的IPF患者,指南推荐的治疗方案是①乙酰半胱氨酸+硫唑嘌呤+泼尼松,②抗凝治疗,③乙酰半胱氨酸,④吡非尼酮;非药物治疗在一定程度上能够缓解部分患者病情,如长期氧疗、肺康复训练、肺移植等[2]。IPF明确诊断后,患者的中位生存时间约为3~5年,预后极差,患者生活质量明显下降,因此对IPF的发病机制、治疗方案有待深入研究。 IPF病理改变的特点为肺组织内变化不均,分布不均,可见正常组织,间质的炎症,纤维增生,蜂窝肺等病理表现共存,主要位于两肺的周边部和基底部。病变早期以肺泡炎为主,同时伴少量的纤维增生;中期肺泡炎症的消退,但出现大量成纤维细胞的增殖,胶原纤维的增生;后期肺组织纤维化的形成。 IPF的发病原因尚不清楚,可能与长期接触粉尘、毒物、病毒感染、吸烟、自身免疫、遗传因素、环境污染和放射线等有关。目前,全世界IPF患者有一千余万人,在我国的发病率也有3~5/10万每年,且呈逐年升高的趋势。发病后的平均存活时间为2.5~3年.据统计,男性发病率为20.2/100,000,女性发病率为13.2/100,000,且发病率呈上升趋势。美国一项研究表明,在十年(1992–2003)内死于特发性肺纤维化的人数已经上升了50%[3-5]。流行病学调查结果显示,IPF的男性发病率较女性高(1.5-1.7:1),吸烟、粉尘及木屑等环境是其危险因素,仅0.5-3.7%的患者可能与遗传因素有关[8-9]。目前尚无治疗IPF的特效药物,虽然肺移植是唯一能延长IPF患者生存期的措施,但因供体极少、且价格昂贵、移植后生存率低[6-7]等原因,不能广泛应用于临床。尽管对其开展研究已有数十年之久,但是仍未找到明显的致病因素,尚不能完整陈述其致病机制。经典的发病机制认为,IPF可能是炎症、组织损伤、修复持续叠加和恶性循环的结果。各种致病因素包括炎症,组织损伤等,可损伤肺泡上皮细胞、毛细血管内皮细胞与上皮下基底膜,启动成纤维细胞募集、增生和分化,引起肺泡中巨噬细胞活化,淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等炎性细胞浸润,促进炎症介质和细胞因子的释放,导致早期肺损伤;在随后肺纤维化的形成过程中,炎症细胞释放的炎性介质与多种细胞因子起到重要作用[10] 。因此,认为慢性损伤和纤维增生修复最终导致了肺纤维化,起主导作用的细胞主要是肺泡上皮细胞和活化的成纤维细胞(即肌成纤维细胞)。肺腺癌细胞来源的A549细胞在纤维化过程中呈现的变化与人肺泡上皮细胞相似,因此本试验选用A549细胞为研究对象。 2 IL-33/TLRs-PI3K信号转导通路 白细胞介素-33(IL-33)是近年来新发现的细胞因子,2005年被鉴定为属白介素-1类家族新成员[11]。IL-33广泛表达于许多组织,但其表达亦受细胞类型的限制[12]。人类和小鼠的IL-33 mRNA在胃、肺、脊髓、脑、皮肤出表达水平较高,而在淋巴组织、脾、胰腺、肾脏和心脏出现表达较低。在细胞水平上IL-33主要出现在间质细胞包括上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等[13],而且,IL-33在呼吸道、消化道等与外界接触的黏膜系统具有更高的表达水平。IL-1β 和IFN-α 刺激后,正常人皮肤成纤维细胞、肺成纤维细胞、肺泡上皮细胞以及在支气管平滑肌细胞中均出现了IL-33 mRNA 的高水平表达。牛肺泡蛋白沉积症以及皮癣皮肤样品中IL-33 mRNA 的表达呈现显著升高的趋势 [14]。 向志光等[15]对IL-33转基因小鼠的肺组织检查发现,肺组织存在着炎症性病理改变,在气管和血管周围的炎性病灶出现嗜酸性粒细胞等炎性细胞的浸润,杯状细胞增生,粘液在呼吸道积聚。IL-33信号通路的靶细胞主要包括Th2细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞等,嗜酸性粒细胞可以驱动和激活炎症信号,可以认为IL-33参与了肺部炎症反应。在外伤或感染引起组织损伤时,作为警报素的IL-33分泌增多,启动组织的修复反应[16]。Prefontaine D等在动物实验中研究发现哮喘者气道平滑肌的IL-33表达量高于无哮喘者,特别是在严重哮喘发作时更明显[17],且国外学者发现抗IL-33抗体能防止小鼠哮喘的进展[18],表明IL-33在哮喘的发病过程中发挥了一定的作用。 本课题组前期通过小鼠IPF模型证明肺纤维化过程中存在IL-33/ST2信号通路的异常激活,IL-33表达量升高,在第14天表达达到最高,提示IL-33可能参与了肺纤维化过程[19]。同时,在细胞层面本课题组研究结果提示IL-33能与ST2受体结合,激活IL-33/ST2信号转导通路,在肺纤维化的发病机制中起了重要作用[20]。 Toll样受体(Toll like receptor,TLRs)是一类进化高度保守的病原分子识别受体,是连接天然免疫和特异性免疫的跨膜信号转导受体,属Ι型跨膜蛋白, 要包括胞外区、跨膜区、胞内区三部分。胞外区富含亮氨酸重复序列,其功能是作为模式受体可以检测到微生物的病原体相关模式分子,跨膜区富含半胱氨酸,主要负责信号的传导,胞内区与白细胞介素-1的胞内区相似,简称TIR结构,该结构与其他含有TIR结构的蛋白相互作用,并招募MyD88分子等蛋白。迄今为止,哺乳动物体内已发现13种TLRs,即:TLR1-TLR13。TLR4是其中一种,在肺部分布较多,与许多肺部疾病有的发生发展有关。TLR4介导的信号通路分为MyD88依赖途径和TRIF依赖的信号途径。研究发现TLR4在肝纤维化、肾纤维、胆囊纤维化中发挥了重要作用,在肺纤维化的作用少有研究。经典的TLR4/MyD88信号通路为研究的热点 [21-23]。 近年来发现除MyD88经典信号通路外,MyD88还可以募集PI3K,形成TLR4/PI3K-AKT信号通路。PI3K/AKT信号通路主要发现于各种肿瘤疾病,能够抑制细胞的凋亡而促进细胞的增殖。肺纤维化的形成与肺成纤维细胞凋亡不足有关,有学者发现PI3K/AKT信号通路的抗凋亡促进增殖的作用在肺纤维化疾病的发病机制中起了作用[24-25]。TLR4与ST2同属白介素-1受体超家族,有极其相似的TIR结构,可以作为IL-33的受体,结合后激活IL-33/TLR4信号通路,进而发挥作用,用IL-33刺激肺泡巨噬细胞后,TLR4受体有增高的趋势[26]。 1.3 本研究的目的、方法、意义及技术路线设计 1.3.1 研究目的 通过体外实验,以TGF-β1刺激上皮来源的A549细胞,观察其对细胞增殖及相关细胞标记物的影响,探讨IL-33/TLRs信号通路在A549细胞上皮-间质转化(epithelial mesenchymaltransition,EMT)中的作用机制。 1.3.2 研究方法 采用细胞生物学和分子生物学研究方法。具体技术方法包括细胞培养,MTT比色法,Real-time PCR,Western blot等。 1.3.3 研究意义 目前国内外对于IL-33在肺纤维化方面的研究较少,在本实验旨在通过TGF-β1诱导Ⅱ型肺泡上皮来源的A549细胞EMT过程,制备细胞层面的肺纤维化模型,探讨IL-33/TLR4信号通路与肺纤维化之间的关系,从而为肺纤维化寻求新的治疗靶点提供理论基础。 1.3.4 实验设计图 第二章IL-33/TLRs信号通路在TGF-β1诱导A549细胞上皮-间质转化中的作用 1材料与方法 1.1仪器   光学显微镜 日本Olympus公司 台式低速离心机 江苏海门市其林贝尔仪器制造公司 台式冷冻温控低速离心机, 5702 RH 德国eppendorf公司 电热恒温水浴箱 江苏金坛市医疗仪器厂 超净工作台 苏州尚田洁净技术有限公司 Mini-Protean III蛋白电泳仪 美国Bio-Rad公司 TY-200S脱色摇床 金坛市医疗仪器厂 小型台式高速冷冻离心机,5417R型 德国Eppendorf公司 台式高速离心机 美国THERMA公司 CO2恒温细胞培养箱 德国Forma公司 紫外凝胶成像仪Ultrospec2000 德国SYNGENE公司 蛋白电泳转移装置 美国Bio-Rad公司 凝胶成像及分析系统 美国Gene公司 核酸检测仪 德国Eppendorf公司 ABI2720普通PCR仪 美国Applied Biosystem 公司 MX3000荧光定量PCR仪 美国Bio-Rad公司 Typhoon 9000扫描系统 美国GE公司     1.2试剂及材料 DMEM培养基、胰蛋白酶、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)均购自WISENT公司,BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天公司,TGF-β1购自Perotech公司,鼠抗人α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)抗体,兔抗人E钙粘蛋白(E-cadherin,E-cad)抗体,ECL显色试剂盒均购自武汉博士德公司,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG,辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG,GAPDH多克隆抗体均购自SANT CRUZ公司。DMSO购自CALBIOCHEM公司,MTT购自Sigma公司。Trizol试剂购自Invitrogen公司,逆转录试剂盒及荧光定量试剂盒均购自TaKaRa公司。 1.3主要溶液及成份 实验主要溶液及其配方如下所示: 溶液 成分 Tris-HCl(pH 6.8) 6.05g Tris碱和0.4g SDS,加超纯水定容至100ml,用浓盐酸调pH Tris-HCl(pH 8.8) 18.2g Tris碱和0.4g SDS,加超纯水定容至100ml,用浓盐酸调pH 10%SDS贮存液 100g电泳级的SDS,加超纯水定容至1000满了,加热至68℃助溶,用浓盐酸调节pH至7.2 5×Tris-甘氨酸电泳液 5.1g Tris碱和94g甘氨酸溶于950ml超纯水,再加入50ml 10%的SDS贮存液 10%过硫酸铵 1g过硫酸铵溶解于10ml超纯水中,-20℃保存 考马斯亮蓝R-250染液 90ml甲醇:水(1:1,V/V),和10ml冰醋酸混合液,加入考马斯亮蓝R-250 0.25g,充分溶解,然后过滤后备用 脱色液 10%乙酸,30%甲醇,60% 超纯水 转膜液 Tris 5.8g,甘氨酸2.9g和0.37g SDS加超纯水定容至800ml 中,再加入200ml甲醇 10×TBS 80g NaCl,2g KCl和30g 加超纯水定容至1000ml,用盐酸调节pH至7.4 TBS/T 将10×TBS稀释10倍后以1:1000的比例加入吐温20 消化液 Ⅱ型胶原酶7.5 mg溶于5 mL DMEM培养基含10%胎牛血清用0.2 μm滤器过滤除菌 (不超过1周)   聚丙烯酰胺凝胶制备配方见表1: 表1聚丙烯酰胺凝胶配方   积层胶(ml) 10%分离胶(ml) 水 2.7 4.0 30%丙烯酰胺 0.67 3.3 1.5mMTris-cl (PH8.8) — 2.5 1mMTris-cl(PH6.8) 0.5 — 10%十二烷基硫酸钠 0.04 0.1 10%过硫酸胺 0.04 0.1 TEMED 0.004 0.004       1.4实验细胞 A549细胞株,购自中国科学院上海细胞研究所。 1.5 细胞培养、传代、冻存、复苏 细胞培养:A549细胞选用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液,以4-5×105/ml接种于细胞培养瓶中,放置于37℃,5%CO2细胞培养箱中孵育。 细胞传代:细胞生长汇集约70%-80%进行传代,弃旧培养基,用灭菌PBS冲洗,0.25%胰蛋白酶1ml消化,2min,倒置显微镜观察细胞变圆,细胞连接变疏松,用2ml培养基终止消化,吹打瓶壁使细胞脱落,将液体移入离心管,1000r/min,5min,弃上清,加入3ml培养基,按1:3~5的比例传代。 细胞冻存:取生长状态良好的细胞(冻存前一天最好换新鲜培养基一次),将细胞收集移入离心管,1000r/min,5min,弃上清,加入预先配置好的冻存液(DMSO:胎牛血清=1:9),使冻存液中的细胞浓度为(5~10)×106个/ml。用吸管将细胞吹打混匀,按每支冻存管1.5ml进行分装。并标注冻存细胞类型及冻存日期。4℃,2h;-20℃,1h;-70℃,长期保存。 细胞复苏:从-70℃超低温冰箱将冻存管取出,放入37℃恒温水浴箱中,使冻存管内的液体尽快融化。水浴结束后,取出冻存管,用75%乙醇进行消毒后,用移液管取出细胞悬液,并加入适量培养液,混匀后离心,1000r/min,5min,弃上清,并加入培养液进行稀释,维持细胞密度在5×105个/mL。复苏后第二天换液,常规培养。 2实验分组 按加入的TGF-β1的时间不同分为四组(0h,12h,24h,48h)。参照本课题组既往的研究,本实验所用TGF-β1浓度为5ng/ml[27] 3实验方法 3.1 MTT法 1)取对数期生长的细胞,常规以0.25%的胰酶消化,加入含培10%胎牛血清养基制备成单细胞悬液后接种200ul到96孔板。A549细胞数分为2000个/孔,每组设5个复孔,并设调零孔。 2)在各组细胞于5ng/ml的TGF-β1处理后12h、24h、48h各取出一块板,每孔加入5 mg/ml MTT 20ul,继续在细胞培养箱中培养。 3)4 h后取出,吸弃孔内上清液,加入150ul DMSO,振荡8min使结晶物充分溶解。 4)置于酶标仪上检测,以630nm波长为参考,在490nm波长处测定吸光度A值。 上述试验重复3次。细胞增殖率(%)=(用药组A值-对照组A值)/对照组A值×100%。 3.2细胞蛋白的提取及浓度测定 (1)细胞蛋白提取 1)取培养细胞的六孔板置于冰上,吸弃培养基,用遇冷的PBS冲洗三遍后,每孔加入100ul喊10%PMSF的细胞裂解液, 2) 用细胞刮子将细胞刮下,收集细胞于EP管中,静置于冰上,每5分钟置于螺旋震荡仪上充分震荡1分钟,共震荡四次,使细胞充分裂解。
/
本文档为【IL-33TLRs信号通路在A549细胞上皮-间质转化中的作用】,请使用软件OFFICE或WPS软件打开。作品中的文字与图均可以修改和编辑, 图片更改请在作品中右键图片并更换,文字修改请直接点击文字进行修改,也可以新增和删除文档中的内容。
[版权声明] 本站所有资料为用户分享产生,若发现您的权利被侵害,请联系客服邮件isharekefu@iask.cn,我们尽快处理。 本作品所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用。 网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽..)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。

历史搜索

    清空历史搜索