纤维素酶水解作用机制

纤维素酶水解作用机制 纤维素酶 水解作用 机制 纤维素酶水解作用机制2010-04-1608:44纤维素分子是由许多吡喃型的D-葡萄糖残基通过β-1,4葡萄糖苷键连接而成的多糖链,天然纤维素为直链式结构,链与链之间有晶状结构和排列次序较差的无定形结构;纤维素分子以结晶或非结晶方式组合成微原纤维,微原纤维集束形成微纤维,以微纤维为基本构造构成纤维素。纤维素的结晶度一般在30%~80%之间。 纤维素酶由三类组成1)内切葡聚糖酶(endo-1,4-β-D-glucanase,EC3-2- 1-4,也称EG酶或Cx酶);(2)外切葡聚糖酶(exo-1,4-β-D-glucanase,EC3-2-1- 91),又称纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase,CBH)或C1酶;(3)β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,EC3-2-1-21),简称BG。 纤维素酶解是一个复杂的过程,其最大特点是协同作用。内切葡聚糖酶首先作用于微纤维素的无定型区,随机水解β-1,4-糖苷键,产生大量带非还原性末端的小分子纤维素,外切葡聚糖酶从这些非还原性末端上依次水解β-1,4糖苷键,生成纤维二糖及其它低分子纤维糊精,在β-葡萄糖苷酶作用下水解成葡萄糖分子。这种协同作用普遍存在,除了上述协同作用,还可以发生在内切酶之间,外切酶之间,甚至发生在不同菌源的内切酶与外切酶之间。一般地说,协同作用与酶解底物的结晶度成正比。 纤维素酶优先作用于纤维素的无定形区域,对结晶纤维素有一定的降解,但难度较大"值得庆幸的是,通过研究,我们对结晶纤维素降解的作用机制已有了一定的认识在纤维素酶解的最初阶段,EG和CBH能引起纤维素的分散化和脱纤化,使纤维素结晶结构被打乱导致变性,纤维素酶深入到纤维素分子界面之间,使其孔壁!腔壁和微裂隙壁的压力增大,水分子介入其中,破坏纤维素分子之间的氢键,产生部分可溶性的微结晶。 纤维素酶中单个组分的作用机制与溶菌酶相似,遵循双置换机制。 2影响纤维素水解的主要因素 2.1酶复合物的组分及其比例微生物产生的纤维素酶复合物不一定都有前述三类酶,而是因种类不同,差异较大。酶复合物的组分及其比例决定了它对纤维素的水解程度,组分较齐,比例适当的酶复合物对纤维素的水解能力较强。以研究得较多的菌种为例,丝状真菌能产生大量的纤维素酶(20g/L),三类酶都有,而且比例适当,一般不聚集形成多酶复合体,能降解无定纤维素和结晶纤维素。 陆地细菌产生纤维素酶的量较少低于0.1g/L),主要是EG,因此大多数对结晶纤维素没有活性。 值得一提的是海洋细菌,目前仅有少数学者研究。王玢等从黄海深海海底筛选出一株产低温纤维素酶的海洋适冷细菌(MB1),所产纤维素酶既能水解羧甲基纤维素,又能降解微晶纤维素,且有淀粉酶活。曾胤新等分离出产纤维素酶的极区低温海洋细菌,同时产蛋白酶!淀粉酶和琼脂酶。由于海洋细菌极具多样性,对其广泛深入研究,有希望获得具有较高应用价值的产纤维素酶的菌株。 2.2酶活目前得到的菌株所产纤维素酶活性低,另一方面可能也因为纤维素 纤维素酶解的转换率数比淀粉低12量级,这使得在实际生产中应用降解难度大, 成本太高。 酶活较强的菌种有大霉、曲霉、根霉和青霉,特别是李氏木霉、绿色木霉、康氏木霉,是目前公认的较好的纤维素酶生产菌。陆地细菌中活力较强的菌种有纤维素菌属、生孢纤维粘菌属和纤维杆菌属。 2.3所用植物原料不同,酶解速度也不同此中因素有三1)比表面积比表面积是指单位质量颗粒状物质的总表面积,纤维素的比表面积是纤维素的细度、细纤维化程度和长度变化的复函数,可间接反映纤维素酶抵达纤维素分子的难易程度。植物原料纤维素的比表面积越大,越有利于纤维素酶的作用。(2)木质素含量纤维素酶在向纤维素内部扩散的过程中,受纤维素和木质素的可及性影响。扩散传递速度降低,致使酶解速度降低。木质素具有无效吸附作用,使纤维素酶用量增加。木质素还起屏蔽作用,其含量越高屏蔽作用就越大,从而降低了酶解率。木质素对酶解过程有无抑制作用,吸附后的纤维素酶是否仍有活性,尚无定论。(3)结晶度植物原料的纤维素微细结构是由结晶区和非结晶区组成"在结晶区中,组成纤维的大分子呈有序排列状态;在非结晶区中,大分子为无序排列状态。结晶度是指纤维素中结晶部分占纤维整体的百分比例,主要反映结晶成分的平均值。一般地说,植物原料纤维素的结晶区难以被纤维素酶破坏、降解。 Charpuray等以麦草为材料研究了几种因素对酶解的影响,结果表明比表面积是主要因素,其次是木质素含量,最后是结晶度。 2.4反应条件不同来源的纤维素酶有不同的最佳反应条件。常见的纤维素酶产生菌中,如曲霉、青霉及木霉,产生的酶一般为酸性酶,酶的最适温度大多在45~65?之间,最适pH值大多在4.0~5.5之间。一些嗜碱和耐碱性的细菌,如Bacillus属中的某些种,可以产生在碱性条件下保持较高活性的纤维素酶。至于海洋细菌,王玢等分离出的细菌产纤维素酶最适反应温度为35?,最适pH值为6.0,属酸性酶。曾胤新等分离出的细菌所产纤维素酶的最适作用温度皆为35?。 此外,酶的用量、激活剂、抑制剂等都会影响纤维素水解及其速率。从目前的研究来看,纤维素酶的激活剂主要有钙离子和一些非离子表面活性剂纤维素酶的抑制剂主要有离子表面活性剂,植物中丹宁类、酚类各种白色素成分。 3纤维素酶在中药成分提取中的应用现状 虽然目前纤维素酶用于植物药效成分提取的研究尚不多见,但得出的结果比 即酶解预处理能明显提高植物药有效成分的提取率。 较一致, 沈爱英等用由纤维素酶!果胶酶和蛋白酶按一定比例组成的复合酶,对姬松茸子实体酶解预处理后用热水浸提,多糖提取率为15.7%;所需时间为单纯热水浸提的一半,而提取率明显高于水浸提和酸、碱浸提。刘佳佳等在提取金银花绿原酸时,增加了纤维素酶解工艺,结果能显著提高金银花提取物得率和绿原酸得率,最大可使绿原酸得率提高25.97%。赵宁等在提取干红辣椒中辣椒素的研究中,得出结果酶法提取工艺比传统丙酮浸提法辣椒素产量提高了30%。马田田用黄柏提取小檗碱,在纤维素酶的作用下,小檗碱的收率平均提高0.2856%,P值小于0.05,与未加酶法相比有显著差异。杨军宣等在三七的提取中用纤维素酶、三七总皂甙提取率提高23.5%。奚奇辉和王辉等分别用竹叶和银杏叶提取黄酮,增加了纤维素酶处理步骤后,其含量比原方法分别提高23.5%和55.69%。 纤维素大分子中的β-1,4-糖苷键是一种缩醛键,对酸特别敏感。因此目前常用的浓硫酸水解也能对纤维素造成一定的破坏。酶解与浓硫酸水解对药效成分的提取率是否有明显差异?对此,张彩霞等学者也做了一些工作。她们在用穿山龙提取薯蓣皂甙元的研究中,对比了酶法和酸法的提取效果,经过五次实验,结果均为酶法的提取率明显高于浓硫酸法。 在提取成分分析方面,也有学者做一些工作。杨军宣等分别用酶工艺和75%乙醇工艺提取三七总皂甙,其产物经薄层层析分析,两种方法所提出的成分一致。马田田用黄柏提取小檗碱也做了同样的试验,取对照品盐酸小檗碱、加酶提取物和未加酶提取物做薄层层析,两种提取方法所得成分一致,与对照品相同。张彩霞等在纤维素酶用于穿山龙中薯蓣皂甙元的提取实验中,将薯蓣皂甙元对照品、加酶组与未加酶组工艺得到的提取物结晶,在同一硅胶G薄层板上展开,通过斑点的比较证明,两种提取方法所得成分一致,与对照品相同,并且加酶组提取物有一定纯度。由此表明,纤维素酶用于中药有效成分的提取,对提取物成分影响小,而且纯度也高。 4应用纤维素酶于中药成分提取中的优点 纤维素酶解提取过程大致可分为两个步骤一是酶解破壁。用纤维素酶降解细胞表面结构及胞章连接物,部分胞内物质溶出;二是有效成分的提取。通过提高温度等方法灭酶,用溶剂浸提有效成分。 传统的水、酸、碱、有机溶剂提取方法是利用浓度梯度使存在于植物药纤维组织之内的有效成分逐步扩散到提取溶剂中,受植物细胞壁纤维组织的屏障作用,往往萃取时间长,需要使用大量溶剂,而且提取率较低,尤其是以富含纤维素的根、茎、皮类药材为原料提取时,纤维素的屏障作用更为突出。植物细胞壁的主要成分是纤维素,恰当地利用纤维素酶处理,可使细胞壁发生不同程度的改变,如软化、膨胀和崩溃等,从而可改变细胞壁的通透性,提高中药成分的提取率,有利于壁内的药效成分溶出,从而提高药效成分的提取率。 纤维素酶用于中药有效成分的提取的优点有1)纤维素酶预处理能显著提高药效成分的提取率,而且操作简便易行,对设备要求不高。纤维素酶水解条件温和,降低了随后的溶剂提取的难度,使整个提取工艺条件温和化,有助于保持药效成分的原有性质。比如植物药经醇处理后,其成分已发生了不同程度的改变或丢失,以至直接影响中药制剂的药理作用及疗效,用纤维素酶预处理后,可用水或其他溶剂代替醇,从而最大限度地保持药效成分的原有性质"再如一些植物药中含特定立体旋光结构的真菌类多糖,在提取中有时需用酸处理,由于酸能破坏多糖的苷键而形成较多的单糖和低聚糖,从而使构象。(3)"仿生化提取"是近几年提出的中药成分提取的构想。为了克服传统的高温煎煮对活性成分药效的影响,这 一构想提出把提取温度降至接近人体温度,低温存在的问题是不利于植物药纤维素的破坏,纤维素酶能担此重任,能在低温下迅速有效地破坏纤维素,有助于实现中药有效成分的低温提取。 诚然,纤维素酶应用于中药成分的提取是一个比较新的课题。目前仍存在着一些问题,包括纤维素酶活性低的问题,这是制约纤维素酶应用的最大因素。人们已着手选育性能优良的产酶菌株,特别是高温、广适pH值等一些极端环境中菌株的筛选,同时也对菌株进行常规理化诱变、基因重组、基因定位突变等方面的工作,以便构建高酶活的菌株,且已有一些成功的报道。 5展望 海洋占地球表面积的70%,海洋细菌数量庞大,极具多样性。与陆地细菌截 海洋菌生活在诸如高盐度、高压、低营养、低温特别是深海或局部高温、然不同, 无光照以及不同的生物之间等特殊甚至极端环境中,具有独特的代谢方式,其产 所产纤纤维素酶的能力与特性有待发掘。海洋细菌产生的酶在高盐度下有活性,维素酶能分泌到胞外,并且产酶种类较多。因此,对海洋细菌展开广泛深入的研究,有希望获得有较高应用价值的菌株。 在不久的将来,随着纤维素酶的研究深入,纤维素酶必将在中药有效成分的提取中发挥强有力的作用。在中药现代化进程中,用纤维素酶对中药进行提取前处理,符合"仿生化提取"的观念,能改善提取工艺,提高中药品质,有很好的应用前景。