【doc】心肌肥厚大鼠细胞核内蛋白激酶和蛋白磷酸酶的活性

【doc】心肌肥厚大鼠细胞核内蛋白激酶和蛋白磷酸酶的活性 心肌肥厚大鼠细胞核内蛋白激酶和蛋白磷 酸酶的活性 206ISSN1007—3949ChinJArterioscler,Vol10,No3 ? 实验研究?[文章编号]1007—3949(21302)10-03—0206—04 心肌肥厚大鼠细胞核内蛋白激酶和蛋白磷酸酶的活性 刘健,何作云,王培勇 (第三军医大学1.新桥医院心内科,重庆市400037;2.病理生理学教研室,重庆市400038) [主题词]左心室肥厚;细胞核;蛋白激酶;蛋白磷酸酶 [摘要]探讨细胞核磷酸化和去磷酸化在心肌肥厚发生中的作用,制备腹主动脉缩窄大鼠心肌肥厚模型,差速 离心和密度梯度离心提纯心肌细胞核,同位素P掺入法测激酶活性,无机磷生成显色法测定蛋白磷酸酶活性.结 果发现,与对照组比较,腹主动脉缩窄组心肌细胞核丝裂素活化蛋白激酶活性增加82.o3%(P<0.05),膜丝裂素 活化蛋白激酶活性无显着变化,胞浆丝裂素活化蛋白激酶活性下降53.69%(P<0.01);蛋白激酶A活性均无明显 变化.细胞核磷酸酶2A活性增加44.95%(P<0.05),膜磷酸酶2A增加36.75%(P<0.05);细胞核磷酸酶2B活 性增加43.57%(P<0.05),胞浆磷酸酶活性均无显着增加.正常组心肌细胞核丝裂素活化蛋白激酶活性与胞浆 无显着差异,但腹主动脉缩窄组心肌丝裂素活化蛋白激酶活性为核>膜>胞浆,蛋白激酶A活性分布无显着差异: 磷酸酶2A,2B和2C活性分布为核<膜<胞浆.结果提示,压力超负荷时细胞核内蛋白磷酸化和去磷酸化水平增 高,可能在介导心肌肥厚的发生中起重要作用. [中图分类号]R363[文献标识码]A ActivitiesofProteinKinasesandPhosphoproteinPhospha~inPressureOverload?-in?- ducedHypertrophicRat'SHearts LIUJian,HEZu~Yun,andWANGPei—Yong (DepartmentofCardiology.the17tirdMillitaryMedicalUniversity,Hosp/ta/,Chongqmg400037,?) 【MeSHJHypertrophy,LeftVentfic~dar;CellNucleus;ProteinKinase;PhosphoproteinPhosphatase 【ABSTRACTJAimToobservewhetherproteinphosphorylafionanddephosporylationinnucleiplayrolesinthedevelop— mentofmyocardialhypertrophyanddistributionofproteinkinasesandphosphatasesincellfractionsweredetermined.Meth— odsThemodelofhypertensiveratwasestabhshedbyabdominalaorticeotrstriction.Velocityandisopyknic~adientcentrifuga— tionwasemployedtofraefionateratmyocardimutomembrane,cytosoleandnuclei.Enzymaticmethodswereemployedtodeter— minekinasesandphosphatases.ResultsComparedwithcontrolgroup,theactivityofnfitogenactivatedproteinkinase (MAPK)increasedby82.03%(P<0.05)innuclear,changedwit}loutsignificanceinlnembranousfraction,whereasdechned by53.69%(P<0.01)incytosolicfraction;t}leactivityofproteinldnaseA(PKA)indifferentfractionswereclosetothoseof control;t}leactivityofPPase2Aincreasedby44.95%(P<0.05)and36.75%(P<0.05)respectivelyinnuclearandmem— branousfractions,changedwithoutsignificanceincytosolicfraction;theactivityofPPase2Bincreaseby43.57%(P<0.05)in nuclearandchangedwithoutsignificanceinmembranousandcytosohcfractions;theactivityofPPase2Cindifferentfractionswere closetothoseofcontro1.ConclusionsNuclearMAPK,PPase2AandPPase2Bmightbeinvol vedindevelopingoverload— inducedcardiachypertrophy. 心肌肥厚是心脏对多种因素长期刺激所发生的 适应性重塑,目前研究提示,多条信号通路参人心肌 肥大的发生过程.磷酸化/去磷酸化是细胞内信号 转导最普遍的分子调节机制,细胞核内蛋白磷酸化/ 去磷酸化水平是胞浆的30,40倍,说明对细胞核磷 酸化/去磷酸化调节尤为重要.目前发现心肌肥大 时胞浆激酶活性发生改变,但是对心肌细胞核内磷 [收稿日期]2001—1018[修回日期]2002—04-25 [基金项目】困家自然科学基金fNo.39870347和30870392)资助. [作者简介】刘健,1%8年出生,女,…东省t]照If人,他{,主要从 书心m管晕翅研究l培觉,1066年出,E,…诸城『f人,博主 要从事心m锊病H,理学研究何作,1942'{一{l{乍,辽0'大连 f}i人,硕L,主要从事心m管流变学研究 酸化/去磷酸化调节是否也发生异常还缺乏直接的 证据.因此,本研究在腹主动脉缩窄大鼠左心室肥 厚动物模型上,采用亚细胞器分离的方法,研究蛋白 激酶和蛋白磷酸酶在心肌细胞膜,细胞浆和细胞核 的分布规律,以进一步阐明心肌肥厚发生机制. 1材料与方法 1.1主要试剂 苯甲基磺酰氟(phenylJ11ethylsulf0nyIflufide, PMSF),三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate,ATP),苯 唑嘧啶,Na,\704,髓磷脂碱性蛋白,氧繁碱及锕蛋由 【IIA购自Sigma;【了一IJlArP(370GBq/mo1)购自北京 CN43—1262/R中国动脉硬化杂志2002年第l0卷第3期 亚辉生物医学工程公司;丝/苏氯酸磷酸酶分析系统 鹏自Promega(USA);亮肽素,抑驮酶,胃酶抑素A购 自分子探针公司(MolecularProbesInc.美国).其余 试刘为国产分析纯 1.2心肌膜性成分,胞浆酶液和心肌细胞核的提纯 按以往的方法制备腹主动脉缩窄大鼠心肌肥厚 模型,测定血液动力学参数并计算心肌肥大程度_】j. 大鼠活杀开胸迅速取出心脏,用50mL冰冷TKM液 (Tris.HCl50mmol/L,KCl25mmol/L及MgCl25retool/ L,pH7.5)洗去红细胞,剪碎后加入5倍体积等渗 匀浆液(含蔗糖250mmol/L,EGTA1.0mmol/L,D3T 1.0mmol/L,PMSF1.0mmol/L及亮肽素,抑肽酶,胃 酶抑素A各lmg/L的删液)中,用内切式匀浆器 低速匀浆2.5min,200目尼龙布过滤,离心(14O0g, 10min)两次,取上清超速离心(100000g,60min),沉 淀为心肌膜性成分,上清为胞浆成分,分别用于测定 心肌膜性和胞浆内酶活性.所有操作在0,4下 进行.将沉淀加入l倍体积的1.0mol/L蔗糖一TKM 液中,充分混匀加入3倍体积的2.5mol/L蔗糖一TKM 液,混匀后超速离心(120000g,60min),沉淀即为纯 化的心肌细胞核.分离的细胞核纯度采用酶学方法 鉴定,其他细胞器标志酶均小于5%.采用Lowry法 行蛋白质定量. 1.4丝裂素活化蛋白激酶,蛋白激酶A活性测定 采用酶学方法测定丝裂素活化蛋白激酶(mito— genactivatedproteinkinase,MAPK)L2J及蛋白激酶A (proteinkinaseA,PICA.)L3J的活性.实验各组取酶液 50L(100/*g),分别加入50以下液体:?MAPK 缓冲液(pH7.2,HEPES20.0mmol/L,Mgcl,10.0 mmol/L,MnC122.0mmol/L,DTY2.0mmol/L,Na3VOd 0.5mmol/L,EGTA1.0mmol/L,小牛血清白蛋白0.1 g/L,PKA抑制剂2.0mmol/L,亮肽素,抑肽酶,胃酶 抑素A各2mg/L,ATP—Na250tanol/L;[7一P]A1P37 kBq;髓磷脂碱性蛋白0.5L),于30~C反应15min; ?PKA缓冲液(pH74,Tris—HC1501TIIIlol/L,MgCl, 10.0mmol/L,DTT2.0mmol/L,Na3VO40.2mmol/L, NaF2.0mmol/L,苯唑嘧啶10.0mmol/L,亮肽素,抑 肽酶,胃酶抑素A各2ttg/L,A1P—Na2100tanol/L: f7一P]ATP37kBq,氮茶碱5.0retool/1,底物组蛋白 rLA1.0:7I),于30?反应10min后冰浴终止反应. 取80ftL反应液点于p8l磷酸纤维素滤纸上,凉干 岳0.5%(体积分数)磷酸液浸泡行离子交换20 rain之后抽滤冲洗4次,再r}j丙酮浸泡2t?in,烘干 后置于问烁瓶中,加入闪烁液测定翌I,放射活性,同 时作空白对照检测,以实验管与空白管的差值表示 激酶活性,以(,pm/100l*g?protein表示. 1.5蛋白磷酸酶活性测定 胞浆,膜性成分和核制备用苟聚糖凝胶G一25过 柱除去内源性无机磷.取样本2O肚g,加入1.0 mmol/L磷酸肽5.0t*I,去无机磷的超纯水30f止,磷 酸酶2A5×缓冲液(pH7.2,咪唑250mmol/L,EGTA 1.0mmol/L,0.1%G一巯基乙醇,小牛血清白蛋白0.5 g/L)10I*L,或磷酸酶2B5×缓冲液(pH7.2,咪唑 250mmol/L,EGTA1.0mmol/L,Ml250mmol/L, NiC125.0mmol/L,CaC122.0mmol/L,钙调素250f1g/ L,0.1%口一巯基乙醇)10L,或磷酸酶2C5×缓冲 液(pH72,咪唑250m.n~l/L,EGTA1.0mmol/L, Ml:25nunol/L,0.1%p一巯基乙醇,小牛血清白蛋 白0.5g/L)10I*L,空白管不加样本,30~C反应30 min,加入钼酸铵一孔雀石绿一磷酸混合液50fL终止 反应,室温放置30min,在酶标仪上测定L595lqm的 吸光度,根据KHP04标准曲线计算蛋白磷酸酶 (phosphoproteinphosphase,PPaSe)活性,采用三复管 测定,以nmol/(rain?g)为单位. 1.6统计学处理 实验数据以均数?标准差(?s)表示,两组比 较采用Wehcht检验,多组问比较采用方差分析 (One—wayANOVA),组间差异显着性采用q检验. 2结果 2.1形态学和血流动力学指标 实验组大鼠体重(232?4.8g)与对照组大鼠体 重(237?0.4g)无显着性差异.HE染色显示,腹主 动脉缩窄大鼠左室壁显着增厚,心肌纤维增粗,排列 紊乱.与对照组相比,腹主动脉缩窄大鼠左心室重 量指数增加52.6%,平均颈总动脉压增高43.1%, 颈总动脉收缩压增加44.5%,颈总动脉舒张压增加 44.4%,左心室收缩末压增加25.9%,左心室舒张末 压减59.38%,?dp/dt,=分别下降22.1%和27. 3%(表l,Table1). 2.2丝裂素活化蛋白激酶和蛋白激酶A活性变化 与对照组相比,腹主动脉缩窄组心肌细胞核 MAPK活性增加82.0%(P<0.05),细胞浆MAPK活 性下降53.7%(P<0.01),细胞膜MAPK活性无明 显变化,PICa,活性也无显着变化对照组心肌细胞 核MAPK活性与胞浆无显着差异,但腹手动脉缩窄 组心肌细胞核MAPK活性明显高于胞浆,为胞浆的 4.1倍(P<0.05);膜MAPK活性也明显高胞浆, 208ISSN1007—3949ChinJArterioscler,Vol10,No3 为胞浆的2.6倍(P<0.05).对照组和腹主动脉缩 窄组心肌细胞核PKA活性高于胞浆,但无显着性差 异(表2,Table2). 表1.腹主动脉缩窄心肌肥厚大鼠血流动力学指标变化 Table1.Hemodynamicchangesofhypertrophyrats(?s.n = 12). a:P<O.O1,c0t1par.dwithcontrolgroup.Ratio:theratioofleftventricu— farweighttobodyweight;MABP:meAfflarteria]bloodpressure;LVSP:left ventricularsy~olicpr~sure;INDEP:leftventriculardio.stolicendpressure; dp/dt:deve]opingpressure. 表2.心肌丝裂素活化蛋白激酶和蛋白激酶A活性在细胞 核,细胞膜和细胞浆中的变化. Table2.ChangesofMAPKandPKAactivitiesinnuclear, membranottsandcytosolicfractionsofmyocardimn(?s,n = 5). a:P<0.05,b:P<0.01,c~paredwithcontrolgroup.C:P<0.05,d: P<0.O1,comp.~withthevalueofnuclear;e:P<0.05.comparedwith thevalueofmembrane. 2.3蛋白磷酸酶活性变化 由表3(le3)可见,对照组和腹主动脉缩窄组 心肌细胞浆PPase2A,PPase2B和PPase2C活性均 明显高于细胞膜和细胞核(P<0.05).与对照组比 较,腹主动脉缩窄组心肌细胞核PPase2A活性和 PPase2B分别增加44.95%和43.57(P<0.05),细 胞膜PPase2A活性增加36.75%(P<0.05). 表3.心肌蛋白磷酸酶2A,2B和2c活性在细胞核,细胞膜和细胞浆中的变化 Table3.Changesofphosphoproeinkinase2A,2Band2Cactivityinnuclear.membraneandcy tosolicfractionsofmyocardimn (?s,n:3) a:P<0.05,c0mparedwithcontrolgreop;b:P<0.05,c0n1par.dwiththevalueofnucleara ndinembl"dneinthe8anlegroup 3讨论 近年来大量证据表明,心肌肥厚的发生离不开 信号转导和细胞核反应(基因表达重排)异常这两个 基本环节.最近研究提示,丝裂素活化蛋白激酶是 胞浆多种信号传导通路的共同交汇点,而细胞核是 基因转录调节和生物信息细胞内传递的最终场所. 本研究显示,腹主动脉缩窄4周心肌肥厚时,心肌细 胞核丝裂素活化蛋白激酶活性显着增加,细胞浆丝 裂素活化蛋白激酶活性下降,细胞核丝裂素活化蛋 白激酶活性显着高于细胞膜和细胞浆,说明丝裂素 活化蛋白激酶信号转导途径可能参与心肌肥厚的发 生,细胞核丝裂素活化蛋白激酶活性显着增加,可能 是实现心肌肥厚基因转录表达重排的前提.研究发 现,多种转录因子活性受激酶和磷酸酶的磷酸化/去 磷酸化调节,多种刺激激活转录通过丝裂素活化蛋 白激酶途径J.丝裂素活化蛋白激酶p38介导激活 转录因子MEF2C_5J,而受AT?信号激活的K能直 接刺激转录因子活化蛋白一1的活性,活化蛋白一1则 与心肌骨骼肌型a一肌动蛋白和心房利钠因子基因的 激活有关.锌指转录因子GATA.是心肌肥大反 应的一种新的转录调节者,也受胞内信号丝裂素活 化蛋白激酶系列的激活一J.另外,丝裂素活化蛋白 激酶还激活其他多种转录因子如ElM,c—Jun,ATF一2 和c—myc等,提示核内丝裂素活化蛋白激酶对转录 因子的磷酸化修饰可能是信号转导引起细胞核反应 cN43.1262/R中国动脉硬化杂志2002年第1O卷第3期209 异常的关键环节. 许多研究提示,肾上腺素能受体激活在心肌肥 大的发生中起重要作用.在心肌细胞上的研究提 示,蛋白激酶A激活Raf-1和丝裂素活化蛋白激酶 通路,从而增加心肌细胞的蛋白质合成.Osaki 等采用大鼠Langendorff心脏灌流模型观察到,高 压力负荷2min即可显着增加大鼠心肌的cAMP水 平,2h时蛋白质合成显着增多.但本研究发现,腹 主动脉缩窄4周心肌肥厚时,心肌细胞核,细胞膜和 细胞浆蛋白激酶A活性与对照组相比无显着变化, 说明蛋白激酶A通路不参与心肌重塑后期(4周)的 发生过程. 细胞核是蛋白磷酸化和去磷酸化最活跃的场 所,蛋白磷酸酶在细胞内生物信息传递中与蛋白激 酶具有同等重要作用,然而这方面的研究远不如蛋 白激酶那样清楚.细胞内磷酸酶PPase2A和PPase 2c的底物特异性较低,许多蛋白都可作为其底物, 参与DNA修复,转录,蛋白合成,有丝分裂和糖代 谢.新近研究发现,磷酸酶2B是一种依赖Ca2/ CaM的蛋白磷酸酶,在胞内生物信息传递中发挥作 用.Molkentin等叫报道高表达的小鼠发生严重心 肌肥厚与心衰,引起心肌肥厚的多种刺激通过其受 体引起细胞内ca2增加,激活蛋白磷酸酶,引起胞 浆内转录因子NF.AT1去磷酸化,去磷酸化的NF. A转位入核,与核内心脏锌指转录因子GArrA4,活 化蛋白.1及C—MAF协同激活心肌肥厚相关基因的 转录,导致最终的心肌肥厚.本研究发现,心肌细胞 核激酶活性高于细胞浆,而细胞浆磷酸酶活性明显 高于细胞核,腹主动脉缩窄心肌肥厚时,心肌细胞核 PPase2A和PPase2B活性均显着增加,细胞浆中无 明显变化,说明细胞浆是细胞内磷酸酶活性最高的 部位,心肌肥厚时,核内磷酸酶活性增加,提示压力 超负荷时,可能不仅细胞核内蛋白磷酸化功能加强, 去磷酸化调节也增加,从而在介导心肌肥厚相关基 因转录调控和基因表达激活中起重要作用. [参考文献] [1]刘健,何作云,王培勇,等心肌肥厚大鼠心肌细胞核三磷酸肌醇受 体特性的研究生理,2001,53(4):281—285 [2]李田昌,庞永政,唐朝枢,等.丝裂素活化蛋白激酶活性测定.基础 医学与临床,1996,16(2):78—80 【3]BenyoDF,Zele'znikAJCyclicadenosinerllonoph(~e8is..1insinthe一 matec0r】sluteum:m,aintenanceofproteinkinaseAactivitythin:outtheluteal oftherner~trualcycle.西蛔,1997,138(8):3452~58 【4JTreisn,.anR.Regulationof?aIBonbyMAPklnasecascaCurtot)/n //Bio1.1996,8:205—215 【5JHartJ,JiangY,LiZ,etalActivationofthe雠upb邮factorMEF2cby theMAPkina~v38inirlflanm-lation.Nature.1998.386:296-299 【6JParadisP,MacLellanWR,Be]aguliNS.eta1.SertmasDon8efacl~rmediat~ AP-1一dependentindllctionoftheskeletalQactinpr~lrnoterinventricularrnyocyte,~ J/o/Ct/c/n,1996.271:10827—833 l7JHasegawaK,LeeSJ,JSM,etal,Cis—actingrthatmediatein ductionof?inheavychai不geneexi0ndI?ingleftverltricatlarhypert~,y duetoaolticcol~strictionCurulzaion,1997,96:3943—953 [8]YamazakiT,KomuroI,Z0uY,etalProteinkin,~AandproteinkirC s"ticallyactivatetheRaflkinase/mitogen—activatedproteinkina~ca,~cade inneonatalmcardiot~ocytes.JMolCellCardid,1997,四(9):249l一5ol [9JOsakiJ,HanedaT,K?hY,eta1.~irKtucedexpv~ionofheat stmckplotein70mRNAinadultlatheartiscoupledhod1t0proteinkinaseAde— pendentandpmteinksu~eC—dependentsystem8.,,1998,16(8): 1193—2? 【10J.MolkentinJD,Lum,Allt(BCL,eta1.Acalcineurin—dependenttramcripti0n— alforc.a/diachyper~op}rf.Ce//,1998,93:215—228 (此文编辑文玉珊)