熊胆贝母止咳胶囊的体外抗病毒作用的实验观察

熊胆贝母止咳胶囊的体外抗病毒作用的实验观察 熊胆贝母止咳胶囊的体外抗病毒作用的实 验观察 四川生理科学杂志2006;28(3)131 熊胆贝母止咳胶囊的体外抗病毒作用的实验观察 杨光李碗宜包旭.张再蓉贺英菊.龚其美 (1.四川大学实验动物中心,2.四川大学华西基础医学与法医学院, 3.四川大学华西药学院;成都610041) 摘要目的:观察熊贝止咳胶囊是否具有体外抗病毒的作用.:按常规病毒体外试验,首先将熊贝止咳胶囊粉溶于 Hank,S液,以二倍稀释法配制成1:2O,1:2560浓度,分别加入狗肾传代细胞(MIX:K)和Hela细胞培养板中,100~1?孔_.,连续 7日于37?5C02孵箱中培养,逐日观察,测其对细胞无毒性作用的最大药物浓度.然后以100TC的流感病毒川属99和柯萨 奇病毒(CVB3)分剐加入MDCK和Hela细胞培养板中,分剐吸附2.Oh和1.5h,去病毒液后,于MDCK细胞培养板孔中分剐加入熊 贝止咳胶囊最大无细胞毒性药物浓度稀释液,并以病毒唑1:2O,1:20480作平行阳性对照.而在Hela细胞培养板中,分别加入 无细胞毒性熊贝止咳胶囊1:8O,1:640的药液,亦以病毒唑1:8O,1:640作平行阳性对照.100~1?孔_.,每浓度3孔,并设空 白细胞和病毒对照,37?5C02孵箱中培养,逐日观察细胞病变,当病毒对照组细胞出现约有75以上细胞病变时终止试验,当细 胞发生约5O细胞病变以上时,则判受试药物该浓度对该病毒无抑制作用.结果:测得熊贝止咳胶囊对MDCK和Hela细胞的无 毒性浓度分别为1:2560和1:80;而病毒唑对两株细胞的无毒性浓度均为1:2O.实验显示熊贝止咳胶囊1:2560~1:20480的 各种浓度对流感病毒川属99无抑制作用;1:8O,1:640的浓度对CV%无抑制作用.结论:熊贝止咳胶囊对MDCK和Hela细胞 的无毒性浓度以下各浓度,对流感病毒川属99和cVB3在体外无明显的抑制作用. 关键词:熊贝止咳胶囊;病毒;利巴韦林 熊贝止咳胶囊是熊胆贝母止咳胶囊的简称,由熊胆粉,浙 贝母,甘草,黄芩等6味中药组方,临床用于咳嗽咯痰或兼发热 等症的急性支气管炎或慢性支气管炎急性发作的治疗.上呼 吸道感染的主要病因之一为病毒,故对其体外抗病毒作用进行 了探索性实验研究观察. 1材料与方法 1.1试验药物 熊贝止咳胶囊:为棕黄色粉末,1.Og粉末相当5.5g生药 量, 由四川I华星中医药有限公司提供,批号:010601.称取 1.Og粉末溶于10mlHank'S溶液中,配制成1:1O的药液,然 后以此药液用Hank'S液作倍比稀释成1:2O作起始浓度,供 实验用利巴韦林(病毒唑)注射液:100mg?ml,,由无锡市第 七制药有限公司生产,批号:010831.用Hank'S液对倍稀释成 1:2O作起始浓度,供实验用.病毒株;流感病毒川属99和柯 萨奇病毒(CVB3)分别由四川卫生防疫站和成都生物制品研究 所提供,四川大学华西医学中心微生物教研室冻存传代培养, 实验前分别测定两株病毒的TC?均为1O一.细胞株:狗肾 传代细胞(MDCK)和HeLa细胞株由成都生物制品研究所提 供,经四川大学华西医学中心微生物教研室复苏传代,生长液 为含1O小牛血清的RPML1640液. 1.2试验方法 1.2.1细胞毒性试验取1:2O的熊胆贝母止咳胶囊和病毒 唑药液,以Hank's液分别作倍比稀释成1:4O,1:8O,1: 160,1:320,1:640,1:1280,1:2560的系列稀释药液,分别 加人MIX:K和HeLa细胞96孔培养板,100~l?孔_.,每浓度3 孔,并同时设细胞对照和以Hank'S液溶媒对照,于37?5 作者简介:杨光,男,主要从事实验动物病理学研究,E—mail:YG780905 @163.com CO2孵箱中培养,逐日观察药物对细胞的毒性反应,连续观察7 日记录细胞病变程度. 1.2.2抗病毒试验:将100TCI~o的流感病毒川属99和cVB3 分别加人MIX:K和Hela细胞培养板中,100~l?孔_.,置孵箱 分别吸附2.Oh和1.5h,倾去病毒液后,于MDCK细胞培养板 分别加人熊胆贝母止咳胶囊1:25601:20480稀释液和病 ,1:20480稀释液,观察药物抗流感病毒川I属99 毒唑1:2O 的作用;而于Hela细胞培养板中分别加人熊胆贝母止咳胶囊 和病毒唑1:4O,1:640稀释液,观察药物对cVB3的作用; 100~l?孔,,每药物浓度3孔,并设细胞和病毒对照,置37? 5C02孵箱中培养,逐日观察细胞病变,当病毒对照组出现3 +(+++),而细胞对照组细胞生长良好,形态正常时,即可终 止试验,药物是否发生病变及其病变程度为指标,当细胞出现2 +(++)病变时,可判断受试药物在该稀释浓度对该病毒无抑 制作用. 2试验结果 2.1熊胆贝母止咳胶囊对细胞毒性试验结果见1 表1熊胆贝母止咳胶囊对传代细胞的毒性试验 砸昙 注t"一"表示细胞无毒性."】+,4+"表示对细胞反应程度(1+表示约有2s%,2 +表示约有so%,3+表示约有75%,4+表示lOO%细胞发生病变). 2.2熊胆贝母止咳胶囊的抗病毒作用的观察,分别见表2及 表3. 132四川生理科学杂志2006;28(3) 注:同表1 表3熊胆贝母止咳胶囊对Hela细胞中CVB3生长的影响 注:同表1 3结论与讨论 结果显示熊贝止咳胶囊1:2560和1:8O以下浓度,分别 对MDCK和Hela细胞无毒性作用,病毒唑1:20以下浓度对 两株细胞均无毒性作用.熊贝止咳胶囊对MD(,K细胞最大无 毒浓度(1:2560)以下的各药物浓度,均未能显示其对生长于 MDCK细胞中的流感病毒生长的抑制作用,对Hela细胞最大 的无毒浓度(1:80)亦有5O的细胞因C?.的生长而发生病 变,其可能原因是熊贝止咳胶囊对两种细胞具有毒性,尤其是 MDCK细胞的毒性较大,因此,在选择对细胞最大无毒浓度以 下的各药物浓度进行抗病毒试验时,由于药物浓度显着地偏低 而不能显示其体外显着的抗病毒作用,因为据文献记载甘 草,黄芩[3,,儿茶均具有抗流感病毒的作用,另外,由我 们对熊胆贝母止咳胶囊体内抗病毒作用的考察研究,其对流感 病毒感染的小鼠具有较好的实验治疗作用,显着下降病毒感染 小鼠的肺指数,至于熊贝止咳胶囊在体内是否可达到抗病毒作 用有效浓度,或有否可能产生新的抗病毒物质,尚可进行深入 的探讨研究. 参考文献 l海老名卓三郎.甘草甜素的抗病毒作用U3.国外医学中医中药分册, 1988;10(4):l6一l9. 2常雅萍,毕无邪.杨贵珍.甘草多糖抗病毒作用研究U5.中国中药杂 志,1989;14(4):44—46. 3肖培根.新编中药志[M].第l北京:化学工业出版社,2002;273, 869. 4张广康.中西医结合医学[M].北京:中国中医药出版社2000;597, 598,1829. 5王浴生,邓文龙,薛春生主编.中药药理与应用[M].第2版.北京:人 民卫生出版社,1998;29—31. (收稿日期:2006-06-04) ExperimentalstudyontheantiviruseffectofXiongbeiantitussivecapsulesinvitro YangGuang,LiWan-yi,BaoX,ZhangZai-ronga,HeYing-ju.,GongQi-mei (1.ExperimentalAnimalCenter;2.WestChinaCollegeofPreclinicalandForensicMedicine; 3.SehoolofPharmacy,SichuanUniversity;Chengdu610041,China) AbstractObjective:ToinvestigatetheantivirusactivityofXiongbeiantitussive(XBA)capsules.Methods:1,Thepowderof XBAcapsulesweredoubledilutedcontinuallyto1:2O, 1:2560concentrationsolutionswithHanksbalancedsaltsolution.And thenadding100(1ofthesolutiontoeachmlcrotiterplatewhichwasplantedwithMadin-DarbyCanineKidney(,正CK)cellorHela cel1.Culturingthemlcrotiterplatesin5COzincubatorat37'Cfor7days.Observingandrecordingthecelltoxicreactioncausedby drugdailyfordeterminingthedrugsmaximalnon-toxicconcentrationtocells.2,Adding100TC?)50oftheinflnenzavirus(Sichuan genus99)andCoxsackievirus(CVB~)intoMDCKandHelacellmicrotiterplates.Afteradsorbedintheplates2.0hoursforthein— flnenzavirusand1.5hoursforCVB3,gettingridofallthevirussolutions.Addingthemaximalnon-toxicconcentrationofXBAcap— sulesolutionto,正CKcellinto,正 CKcellmicrotiterplatesandusingtheribavirin1:2O,1:2480astheparallelpositivecontrol group.Inhelacellplates,addingthe1:8O, 1:640XBAcapsules"maximalnon-toxicconcentrationandusingtheribavirin1#8O, 1:640astheparallelpositivecontrolgroupaswel1.Alltheholesoftheplateswereadded100(1ofthedrugsolutionandeverydif— ferentconcentrationofthesolutionhad3holesrepeatedincludingcontrolandpositivecontrolgroups.4,Culturingthemicrotiter platesin5C02incubatorat37"C.Observingandrecordingthecelltoxicreactioncausedbydrugeveryday.Thenendingtheex- perimentwhenviruspositivecontrolgroupcellappeared3+(about75cellshadpathologicalchanges).Consideringtheconcentra— tionhasnoinhibiteffectontheviruswhencellappeared2+(about5Ocellshadpathologicalchanges).Results:TheXBAcapsules maximalnon-toxicconcentrationtoMDCKcellandHelacellswere1:2560and1:8Orespectively.Howevertheribaviriffsmaximal non-toxicconcentrationtoMDCKcellandHeLacellbothwere1:2O.Condusions:TheexperimentdemonstratesthattheXBAcap— sulegsmaximalnon-toxicconcentration(includingthelowerconcentration)to,正 CKcellandHelacellhadnoremarkableinhibit effectontheinflnenzavirus(sichuangenus99)andCoxsackievirus(CVB3)加tro. Keywords:Xiongbeiantitussivecapsules;Virus;Ribavirin