聚乙二醇在生命科学中的应用进展

聚乙二醇在生命科学中的应用进展 [10]沈一丁著，《高分子表面活性剂》，北京，化学工业出版社，2002年12月 [11]DFA，224，456 [12]DE4，223，111 [13]孙静等人，中国皮革，2001，(7):29 [14]US5，503，754 聚乙二醇在生命科学中的应用进展 朱建民 田春云 (辽宁奥克化学集团有限公司，辽阳，11003) 摘要摘述了聚乙二醇在近十几年来在生物、生物医药等生命科学领域中的应用 进展。X 关键词:聚乙二醇生物工程援零生物医药 聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)是环氧乙烷聚合得到的水溶性聚合物，由于分子结构中具有醚键 和 可羟基，具有广泛的分子量可调性和无毒无刺激性，具有与各种溶剂良好的相溶性及吸湿性，广泛的粘度 PEG在高新技术领域应 调性。因此，聚乙二醇在许多领域得到了广泛的应用。特别是在近十几年来， 用得到了迅速发展，特别是精制聚乙二醇PEG在生物工程技术(基因工程，细胞工程，酶工程，发酵工程)， 生物医药(重组蛋白质药物，重组疫苗，单克隆抗体)等领域得到广泛应用。 由于生物工程技术(包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程)的迅速发展，进而发展了基因重组 DNA技术、分子克隆技术、细胞融合技术、杂交技术、反义技术等新技术。通过基因工程，人造染 体;借助PEG将基因导入血管壁;PEG血小板生成素，有助于肿瘤病人化疗后血细胞的恢复;用色 PEG与 磷脂质制备而成的微脂粒，可延长在血管内的停留时间，延长药效;用PEG作微包覆做<细胞治疗 >;PEG促原生质体的转化、促细胞的融合、促分子的杂交;予制人体克隆器官的<骨架>等。 1在基因工程的应用 1(1在人体基因疗法中的应用 人造染色体是人类最基本的遗传单位是染色体上的基因，基因是“制造”和“操纵”人类机体的蓝图，它 指挥着细胞合成人类生命的基础——蛋白质。但是，当基因发生变化时，其编码的蛋白质不能履行自己 正常的功能，这种情况下可能会出现疾病。近10多年来，作为纠正存在缺陷的基因的一种技术，是将正常 的基因插入基因组非特定的位置以取代有缺陷(也称为失效或致病)的基因。在这种中，研究人员通 常会利用被称作传病媒介的载体将正常或治疗基因递送到病人的目标细胞中。当传病媒介抵达目标细胞 如肝或肺细胞)后，它便将携带的治疗人类基因的遗传物质“卸下”留在目标细胞中。在治疗基因给出的 遗( 传指令下，细胞开始产生具有相应功能的蛋白质，从而恢复目标细胞的正常功能。 虽然基因疗法离临床应用还有相当长的距离，但是基因疗法的研究最近在某些方面仍取得了令人倍 受鼓舞的进展。2003年3月，美国《新科学家》杂志报道“1，美国加州大学的研究小组成功地利用“涂”有 高 (或脂质体)，将治疗基因递送到人体大脑中。这是一项重大的突破和成就，因 为分子聚乙二醇层的微脂粒 过去的研究表明，病毒传病媒介“身体”过大，无法跨过“血一脑屏障”。新的研究成果将有望治疗帕金森 病。Herrmann等报道”1将携带有水蛭素基因的阳离子脂质体载体聚乙二醇(PEG)与一种可降解的大分 子材 (PLA)混合后，包被在血管内支架的表面，将各种外源治疗基因预埋人支架内，能起到抗凝、 防治料聚乳酸 内膜增生等作用。能有效预防支架内附壁血栓的形成。 h,Ylgen公司01正在研究的PEG血小板生成素(Thmmbopoietin)和重组人巨核细胞生长发育因 (rHuMGDF)，临床试验后血小板的恢复明显加快。人肝细胞生长因子(s(、F)与细胞集落因子(G—子 复合使用治疗乳腺癌要比单用G—SCF更有效，有助于肿瘤病人化疗后血细胞的恢复，为21世SCF) 纪人类攻 ——425, 克癌症带来新的希望。 基因治疗是对遗传性疾病和癌症极具前景的途经。因此基因的药物的输送系统便 成为急待解决的问 题。隐形微脂粒(steaIth lipo?me)是经高分子聚乙二醇(PEG)结合的磷脂质制备而成之微脂粒，又称之为”空间安定化”(Sterically stab?ed)阳离子微脂粒载体„“，其生体相容性佳，生产成本低，较具开发之价值。它可以延长在人体血管内之循环时间，其半衰期可达48小时，并具有在肿瘤细胞聚积的现象。 基因疗法有可能借助聚乙二醇的应用实现人类疾病的预防和治疗。 1 2在植物转基因技术中的应用 转基因技术防治农作物的抗病虫害研究愈来愈多的为人们所重视。 “?转化了单子叶 利用根癌农杆菌 植物石刁柏及中国水仙就是成功一例:用高梁原生质体通过PEG诱导导人改建的根癌农杆菌Ti质粒6ll(带CAT基因及T—r)NA的q号基因)的DNA，已获得抗氯霉素的再生愈伤组织。 林木遗传转化”。技术 是将动物、微生物和植物本身的基因，通过遗传转化方法将异源基因导入树木， 并使得这些基因在合适的调控顺序下在异源植物的细胞中表达。以农杆菌Ti质粒和Ri质粒经改建后作 为载体的遗传转化系统，成功地转化了大多数试验过的双子叶植物和裸子植物。遗传转化的方法已从最 初的农杆菌介导法发展r多种DNA直接转化法，如原生质体电激穿孔法、PEG法、微注射法、基因枪 术、超声导人技术、激光导入技术等等。 技 I(3在细胞工程中的应用 “微包覆(microencapsulation)技术””3在许多医学应用领域占有相当重要的地位，例如:利用包埋胰岛 细胞 “1，包埋血红素(hemoglobin)作为红血球取代物和药物释放控制。其中包埋胰岛细胞 即是来治疗糖尿病 “细胞治疗”。细胞治疗乃是生物科技领域中的一项重要技术，在过去十年之中吸引r无数的 生技公所谓的 每年潜司及研发机构大规模投入产品与技术开发，主要的应用在于荷尔蒙缺乏或神经退化等疾病的治疗， ”1。细胞治疗通常需要将活的细胞包覆或固定于一个可以保护细胞的装 嚣内，此在市场预估有数十亿美元 术所需娶装置可能是一个高分子半透膜、一种三度空问结构体、或是可以保存细胞的水胶材料。微包覆技 及免疫兼的材料必须符合相当多的特性要求，例如:适当的机械强度、生物分解性、生物兼容性、通透性、以 Alginate(藻酸盐)与po[y(L—lysine)(聚(L一赖氨酸))等等， 它们具有免疫容性等。过去所发展的包覆材料有 ” ，但缺点是植人之后产生严重的纤维增生，后来人们研究发现，加入PEO 保护功能的优点(Idyethylene oxide)能够改善生物兼容性 。，PEO分子链有高度的亲水性与柔曲性，在水中PEO有很好 的”运动”特 性(而且并不属于离子性结构，因此大量被用来合成接枝共聚合物。 植物原生质体分离和培养技术在过去的20年来(在大量植物中获得，成功。其中，聚乙二醇具有改 变细胞原生质膜通透性的作用。1982年Krens等人首次用PEG处理烟草原生质体获得了转化植株，开 了_用PEG进行植物转化的新途径。农杆菌、PEG及直接吸收DNA法都可以用来进行原生质体转拓 化。 常用的食用菌原生质体融合方法有化学融合法和电融合法。、我国一轻工业研究所采用含Ca(:k的 30,的聚乙二醇(PE(;一4000)，DH8(5作为融合剂进行双孢蘑菇原生质体融合。融合子经过0(6M甘 醇洗涤以去除PEG毒性后(置于堆料再生培养基培养lO一20天。把肉眼可见的小再生菌落分别移露 鲜的PDA培养基继续培养，凡菌丝生长速率恢复正常的分离株均选出作同工酶检测。另据资料报至新 ”“ 用PEG融合法克服甘薯种内杂交不亲和性已获得以下杂交不亲和组合的体细胞杂种植株。 道 早在60年代(科学家们就发现鸡卵黄中存在lgG抗体汹„2。，其含量与鸡血清相似甚至更高，但由于 很难将IgG抗体从丰富的卵黄脂质中分离出来，使得鸡蛋作为抗体来源的研究受到限制。直到80年代 初，Polson和Jensenius相继建立了有效且相对简便的聚乙二醇(PEG)提取法““” ，将鸡卵黄免疫球蛋白 (j抗体 7S免疫球蛋白，与哺乳动物IgG略有不同。聚K,--醇被成功用 于提取从卵黄中分离出来(该抗体是一种 G抗体“",IgG。使得这方面的研究便如雨后春笋般大量涌现，并且被广泛应 用在生鸡卵黄免疫球蛋白 物学的许多领域。另外，利用聚乙二酵对原生质体的溶懈性，可以使两种原生质体融合。 1(4在分子克隆技术中的应用“” 在克隆人体器官的过程中有一个组织工程的过程，所谓组织工程是利用构成组织和器官的基本材料 细胞以及为细胞生长提供场所的支架材料，在体内或体外制造生物组织或器官的高新技术。它的基本过 程是，先用兼容性好且将来能逐步被细胞吸收掉的材料(倒如天然胶原蛋自或合成的聚乙二醇)根据所要 ——426— 培育的组织或器官的三维结构设计、构建出一个基本“骨架”，然后把在体外培养、增殖的细胞附着到“骨 架”上，待细胞和“骨架”长成稳定的复合体后，再把它们移植入机体;伴随着细胞的继续生长和分化”骨架” 被渐渐消 解性的性化，最终再生出具有特定形态和功能的新的组织或器官。这里利用了聚乙二醇的相溶性和可溶 也有培育质。目前，国外已有了人造骨骼、软骨、血管、皮肤及神经等多种组织并开始进行体内试验，我国出人耳廓样软骨——即“人造耳”的报道。人工再造复杂组织和器官正在展示出璀璨的前景。 2生物药物mlf25】 聚L--醇在生物医药工业中同样扮演着重要的角色，通过酶工程和基因工程在发酵工程中的应用，生 产出了人胰岛素、人生长素、干扰素和乙肝疫苗等生物新药，随着人类基因组计划和基因组药物研究的推 进，一些常见疾病如乳腺癌、结肠癌、高血压、糖尿病等涉及遗传倾向的基因定位将得到进一步确证，这终 将为这些疾病的精确诊断和基因工程药物的开发奠定基础，更多的基因工程药物将会面世。目前已上市 的生物药物主要分三类:重组的蛋白质药物、重组疫苗及单克隆抗体 J。在这些生物制剂中都有PEG的 出现，PEG成为它们中的助剂或中间体。 2(1聚乙二醇修饰蛋白质 聚乙二醇修饰蛋白质””的目的是通过聚乙二醇改善其药物动力学与药效学 性能，而保留天然蛋白质 的内在生物学活性，修饰后的蛋白质，在治疗上的益处包括减少肾脏与细胞清除，延长半衰期;增强对蛋白 水解的保护;降低毒性。用聚乙二醇修饰后的衍生物由于具有良好的生物相容性和免疫原性而被广泛应 用于生物分子的化学修饰。其它聚乙二醇化治疗蛋白的临床前研究结果表明，与天然蛋白质相比，PEG 多聚物能增强蛋白质的药理学活性。最显著的是PEG多聚物增加了这一结合蛋白的半衰期。半 延长与肾脏和细胞清除减少，蛋白分解作用受到抑制有关。 衰期的 借助聚乙二醇，突破生物屏障，促进药物吸引”J。药物进入人体后，首先遇到由毛细管组成的生物屏 障，毛细管壁被紧密地连接成一体象鹅卵石一样。生物屏障只允许需要的物质通过。当然，可以修饰屏障 让药物通过，但同时也会带来让其它物质通过的风险，这是一个利弊均衡的问题。风险的程度取决于这些 屏障如何被突破。能突破生物屏障的新输送系统正在使药物变得更为有效，并同时减少副作用。不能突 破生物屏障对一些疾病，如脑肿瘤、HIv感染、阿尔茨海默病(AD)和帕金森病(PD)等的治疗将会极其困 难。现有的药物是有效的，如果它们能通过这些屏障(4)有利于药物吸收。一个明显不同的突破生物屏障 的方法是聚乙=醇化。当一个接有聚乙二醇(PEG)链的分子通过生物屏障时，不会出现其它东西随之而 过的危险。除非使用突破屏障的渗透增强剂。Nobex公司将小PEG加脂质聚合物与蛋白质或小分子药 化学结合以减慢体内酶降解。这一战略可帮助经这种技术改进的水和脂质平衡药物更容易在组织和细物 的水和脂质问扩散，包括胃肠道壁和血脑屏障。它同时也能改变药物吸收后在血流中的行为，因为化合胞 水溶性增加和亲脂性增强能使分子在血流中循环时间更长。例如，Nobex公司的结合胰岛素和降钙物 白质其循环半衰期明显长于天然蛋白质。药物分子接上一个以上的短链PEG聚合物(通常是500--素蛋 分子量)能有效地被弹性的聚合物包封，并通过立体位阻保护其免受肠道酶的作用，同时也帮助药物2000 肠道生物屏障。而大分子蛋白质药物现在通常用长链PEG聚合物(5，000-20，000分子量)修饰通过 溶解度、减慢清除率等，但它们不能经口输送，因为生成的药物一PEG复合物难以被吸收。这些以改善 明，药物输送技术在不断发展，而借助聚乙二醇，突破生物屏障，促进药物吸引突破生物屏障似乎述事例表 发展前景的途径。是一条有 2 2聚乙二醇化干扰素„291 聚乙二醇化干扰素(PEG—IFN)是借助聚乙二醇有阻止蛋白酶迅速降解的作用，从而使干扰素能够 在体内起到长效作用，从而避免频繁注射，提高了患者用药的依从性。 例如，a一千扰素对慢性丙型肝炎患 者的治疗疗效受限于蛋白质特性，包括蛋白质的稳定性差、半衰期 短及其免疫原性。研究表明，干扰素的半衰期为4,16小时，在肌肉注射或皮下注射后3,8小时到达血 浆峰浓度(wills，1990)。静脉注射、肌肉注射或皮下注射24小时后，在血清中仅有很少甚至检测不到干 扰 et 索(Barouki al，1987;Wills，1990)。这些特性造成的后果是，需频繁注射干扰素才能达到有效的血 浆治 a一干扰素制剂每周需注射三次，即使是这样，每次注射 后均疗浓度。在慢性丙型肝炎的治疗中，普通的 会导致血药浓度的较大波动，形成药物浓度的峰值与谷值。当药物浓度达峰时，发热、寒战、头痛、肌 ——427—— 痛和头晕等副作用的发生率增加?(Perry,Jarvis，2001)。当药物浓度到达低谷时，这段时间血液循环 et 中没有干扰索，对病毒的抑制作用消失，导致了病毒水平的反跳(tam al，1997)。PEGASYS(1召聚 二醇修饰后的蛋白质)是在干扰素a一2a的基础上增加了大分子量的、分枝状的、40K(D的PEG多聚 乙 使血清治疗浓度保持稳定，从而使治疗问期延长为每周一次，稳定和足够量的血清PEGASYS物，它 水平提高了 持久病毒学应答率。另外，每周一次给药较为方便性，也有助于提高生活质量。 1996--2000年国外首次上市17个抗病毒药，其中有干扰素复合物，是重组基因干扰素a一2b的聚乙 二醇复合物，治疗慢性丙型肝炎。2001年7月瑞士批准Roche公司的长效聚乙二醇重组基因a一2b干 素(Pegasys)用于治疗丙型肝炎。我国于2000年元月至2001年6月在申请的进口注册证或换发注册扰 种中有:聚乙二醇干扰素a一2b注射剂和重组干扰素a,2b注射剂等。 的品 2(3聚乙二醇修饰粒细胞集落刺激因子(G—csF)”“ 这是美国最大的生物医药公司——安进公司成功制作的生物医药之一，其适应症为肿瘤化疗引起的嗜中性自细胞减少症，对粒细胞集落刺激因子进行聚乙二醇(PEG)修饰，延长其在体内的代谢时间。其商 品名NEUPOGEN，Neupogen(r)的长效剂型也在开发当中(新产品名称为SD,01)。安进公司的另一 业化最为成功的生物技术药物为EPO(商品名EP()C忑N)。这两种药物不仅造福了无数血液透析种商 癌症化疗患者。也为公司带来了巨额的利润，公司也据此迅速发展壮大1992年安进公司首次患者和 跻身财富 500强，当年公司产品销售首次突破10亿美元。2000年财富500强排名，安进公司排在455位。2000 年 在全球医药50强中排在21位。 PEG对蛋白质的修饰”“也是改善蛋白质工程药物药理作用的有效手段。如PEG修饰能有效地改善 多肽蛋白质类药物的免疫原性，增加稳定性，延长体内半衰期，减少毒副作用等。PEG一腺苷脱胺酶已 放市场，PEG一天冬酰胺酶，PEG—IL一2，PEG—SOD，均已进入临床。 投 2(4 PEG的修饰寡糖PEG缀合物一一抗癌药 1 一个从事糖化学研究的研究组在进行的生物活性寡糖的合成及活性研究中，取得了很多有意义的成 果，如，首次完成了单、双、三糖苯丙素苷的全合成;筛选出了两种结构明确、活性较强的抗癌转移寡糖，并 总结出有意义的结构与活性的关系;发现一种具有良好抑制自细胞一内皮细胞粘附活性、抗休克作用的寡 糖PEG缀合物;合成的糖并螺杂环化合物，筛选出具有明显抑制肿瘤血管生长活性的抗肿瘤化合物。 里充分利用了PEG的修饰作用与寡糖构成了缀合物，构成抗癌药物。 这 2(5 PEG作水溶性及亲水性基质„”1 水溶性基质主要借其亲水性，吸水膨胀溶解分散在体液中释放药 物。释放药物与基质在体液中的溶 解度有关。其主要有甘油明胶，聚乙二醇(PEG)，吐温一61，吐温一60，以及纤维素类的衍生物(甲基纤维 素，羧甲基纤维素钠等)。它们构成医药的主要辅料来使用。 2(5(1鼻腔给药新剂型 1 鼻腔给药具有生物利用度高、吸收迅速、起效快、无损伤性、使用方便等特 点，已成为制剂领域研究的 热点之一。鼻腔给药的剂型包括:滴鼻荆、气雾剂、喷雾剂、粉剂、凝胶剂、微球、微粒和毫微粒、脂质体、乳 剂等。在微球剂型中Nakamura等制备了布地奈德(budesonide)的聚甲基丙烯酸和聚乙二醇共聚物的pH 敏感粘附性微球，并考察了其体外释药曲线和体内血药浓度,时间曲线，发现药物作用可持续8h，但 释现象。 有突 2(5(2目标病毒初始物的浓缩——聚乙二醇做载体 当初始物体积较大时，要考虑对其进行浓缩后再分离纯化。浓缩时最好同时能获得初步纯化有利于 效果。在不影响目标病毒的感染性的前提下，可选用盐析、超滤、透析等方法进行浓缩。盐析法不仅可以 用来浓缩初始物。同时也能达到一定的分离纯化效果。最常用的盐是硫酸铵;许多病毒如腺病毒、AAV病 毒和单纯疱疹病毒用聚乙二醇,氯化钠系统沉淀可获得很好的效果并且不影响病毒的感染性。据报道”” 采 “氯仿处理一PEG,NaCl沉淀一氯仿抽提”3个步骤分离、浓缩和纯化重组腺病毒伴随病毒(recombi— nant 用 h内完成。最终从5个转瓶生长的4x109个载 adeno—assoeiated virus，rAAv)，整个纯化过程可在4 体生 5x10”病毒颗粒,mL，SDS一聚丙烯酰胺凝胶结果表明，rAAV的纯度大于95,， 电产细胞中可得到 rAAV仍保持较强的感染性，其感染性滴度达到 子显微镜下绝大多数病毒颗粒的结构完整。纯化后的 一428— 2“10”转导单位(transducing unit，TU),mL，总的病毒颗粒数与感染性病毒颗粒数的比值为25。为 rAAV大规模生产后的纯化提供了一种简便、快速、低成本的方 法。 2(5 3单克隆抗体”” 基因工程单克隆抗体是近年来国外研究的新的活跃领域，已有近10个单抗新药 59个单抗 上市，还有 处于关键性的临床试验阶段，所涉及的治疗领域包括癌症、移植、呼吸、皮肤和自身免疫系统等。在人源化抗体方面，已应用了噬菌体呈现技术开发一系列的人源化抗体来达到治疗疾病的目的。同时抗体工程的 飞速发展也极大地促进了靶向药物的开发。 一些以核心技术在某一特定技术领域中形成竞争优势的公司崭露头角，如Genentech公司以其大规 模制备人源化抗体技术开发了系列抗体药物;Enzon公司首先上市了PEG一,腺苷脱氨酶并用它的PEG 化技术开发了一系列产品;Vical公司重点发展基因速释技术用于DNA药物的开发;雅培等公司的 释微球技术;Medlmmune公司与Aviron公司等均有自己独特的单一技术并作了深层次的开多肽缓 司都因其独特的技术优势而使其在激烈的市场竞争中立于不败之地。 发。这些公 2(6纳米药物粒制备技术”1 在药剂学中纳米粒的尺寸界定在1,1000纳米之间。药剂学中的纳米粒可以分成两类:纳米载体和 纳米药物。纳米载体系指溶解或分散有药物的各种纳米粒，如纳米脂质体、聚合物纳米囊、纳米球、聚合物 胶束等。纳米药物则是指直接将原料药物加工成的纳米粒。 纳米粒制备的关键是控制粒子的大小和获得较窄且均匀的粒度分布，减少或消除粒子团聚现象，保证 用药有效、安全和稳定。毫无疑问，生产条件、成本、产量等也是综合考虑的因素。目前发展的纳米粒制备 技术可分为3类，即机械粉碎法、物理分散法和化学合成法。 不同的制备技术和工艺适合于不同种类纳米粒的制备。例如，熔融分散法主要用于固体脂质纳米粒(sLN)的制各;溶剂蒸发法、乳化,溶剂扩散法等物理方法可用于纳米混悬液或假胶乳的制备;而利用聚乳 酸(PLA)、聚丙交酯一乙交酯、聚氨基酸、壳聚糖等作为疏水链段，利用聚乙二醇(PEG)、聚氧乙烯(PEO) 一聚氧丙烯等作为亲水链段，合成具有表面活性的嵌段共聚物或接枝共聚物，在水中溶解并形成纳米胶 束;将含有壳聚糖一PEG嵌段共聚物的水溶液与聚阴离子化合物一三聚磷酸钠的水溶液混合，由于相 电荷的结合而凝聚成纳米粒等。 反 参考文献 [1]毛黎，科技日报，2003年7月11日( [2]赵意平，张柏根，周围血管疾病基因治疗的研究进 [3]邹晓徽，生物医药工程产业的现状及展望，安徽安展，上海第二医科大学附属仁济医院血管外科( [4]吕淑彬，微脂粒，制药产业的束来!，中国化学制药股份有限公司( [5]中国科生物高技术公司，合肥 [6]施季森，迎接21世纪现代林木生物技术育种的科学院，植物生理研究所，实验室目前的工作进展( 2000，第 挑战，南京林业大学，中国农业科技导报， 2卷(1) 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