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Hox基因在高糖诱导人视网膜色素上皮细胞增殖分化中作用研究(可编辑)

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Hox基因在高糖诱导人视网膜色素上皮细胞增殖分化中作用研究(可编辑)Hox基因在高糖诱导人视网膜色素上皮细胞增殖分化中作用研究(可编辑) Hox基因在高糖诱导人视网膜色素上皮细胞增殖分化中 作用研究 l73S7‘5 分类号VDC 密级 博士学位论文 Hox基因在高糖诱导人视网膜色素上皮细胞 增殖分化中的作用研究 TheRoleofHox in GlucoseCondition genesHigh ofCultured DifferentiationandProliferation Inducing HumanRetinal Cells PigmentEpithelia...
Hox基因在高糖诱导人视网膜色素上皮细胞增殖分化中作用研究(可编辑)
Hox基因在高糖诱导人视网膜色素上皮细胞增殖分化中作用研究(可编辑) Hox基因在高糖诱导人视网膜色素上皮细胞增殖分化中 作用研究 l73S7‘5 分类号VDC 密级 博士学位论文 Hox基因在高糖诱导人视网膜色素上皮细胞 增殖分化中的作用研究 TheRoleofHox in GlucoseCondition genesHigh ofCultured DifferentiationandProliferation Inducing HumanRetinal Cells PigmentEpithelial 作者姓名: 童平 学科专业: 眼科学 学院 系、所 : 湘雅二医院 指导教师: 唐罗生教授 J 答辩委员会主 论文答辩日期立垒:L 中南大学 二O―O年五月 原创性声明 本人声明,所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知,除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外,论文中不包含其他人已经发或撰写过的研究成果,也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证而使用过的材料。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。 (等冬 作者签名: Ju,f 日期:鲨年―』月―,_日 关于学位论文使用授权说明 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学校 有权保留学位论文,允许学位论文被查阅和借阅;学校可以公布学位 论文的全部或部分内容,可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论 文;学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。 储躲玺导 月JEt j! 博士学位论文 中文摘要 摘要 研究背景 随着糖尿病发病率在全世界范围内不断上升,糖尿病性视网膜病 变 diabetic 以上的糖尿病患者会导致视网膜病变,其中约60,1型糖尿病患者、 20,2型糖尿病患者最终会进展为增殖型糖尿病性视网膜病变 diabetic ? proliferative 未来防盲i治盲的重点眩1。然而,鉴于PDR的病理机制尚未完全阐明, 且目前的治疗方法一光凝和玻璃体切除术对局部组织创伤较大、远期 疗效不明显,在分子水平上探究其发病机制以期指导临床显得尤为重 要。 PDR是一类以新生血管形成为主要病理特征的细胞增殖性疾病, 其发生发展与细胞的激活、增殖和分化调控失常有关,新生血管也是 细胞异常增殖的结果。在决定细胞的定向分化与增殖的众多基因中, I型同源盒基因 Hox基因 是一类很重要的发育相关基因(一旦Hox 基因或其转录调节蛋白功能异常,将直接影响细胞的增殖与分化过 程。已有研究表明Hox基因参与血管生成的过程,特别是在抗肿瘤血 管生成的靶向治疗中起到重要作用口咱3;参与胚胎发育过程中肢体、 器官等形态发生阳1妇。并且以种族特异性和阶段特异性方式在造血增 殖分化中起调控作用n2’143等。目前Hox基因与糖尿病关系罕有报道 Ds,16];其与PDR的关系,国内外尚未见相关文献报道。已有文献证实 博士学位论文 中文摘要 高糖可使视网膜色素上皮细胞 retinal pigment 生一些增殖分化和功能方面的变化n7’181,其中包括高糖致使RPE细胞 endothelial 分泌的细胞因子如血管内皮生长因子 vascular growth derived factor’VEGF 和色素上皮衍生因子 pigmentepithelium 细胞增殖分化中起重要作用的Hox基因是否参与该变化过程?PDR是 以新生血管为主要特征的病变,而作为主要血管刺激因子的VEGF和 主要血管抑制因子PEDF之间的平衡对新生血管的形成是至关重要 的。有不少文献报道Thox基因参与血管生成过程n卿引,其中有部分 与视网膜新生血管形成过程进而与PDR的发生发展相关联?为验证 以上假设,我们如下实验,进一步探讨PDR的发病机理,以期在 分子水平上为其防治带来新的曙光。 目的 1观察不同浓度葡萄糖培基对体外培养的ARPE(19细胞增殖分 化以及VEGF、PEDF表达的影响。 达,探讨其与PDR发生、发展的关系。选择各组间表达差异最明显 的某一Hox基因进行下一步实验。 PEDF的影响及探讨其可能机制。 IT 博士学位论文 中文摘要 方法 培养ARPE一19,比较传代后两组细胞每天 1-8天 增殖数量以及细 胞形态;设高糖组和正常糖组 NGl:培养7天细胞组;NG2:培养 14天细胞组;NG3:培养21天细胞组 细胞分别为对照组和实验组。 2设高糖组和正常糖组细胞分别为实验组和对照组。应用Hox族 基因特异引物,采用RT―PCR结合图像分析法检测两组细胞中39个 Hox基因mRNA的表达水平。统计分析比较两组细胞中Hox族基因 表达水平,用基因,GAPDH灰度比值表示。选择两组细胞中表达差 异最明显的HoxB7基因进行下一步实验。 RNA, 序列设计了三条HoxB7特异性的小干扰RNA small interfering 载体,将重组质粒转入ARPE(19细胞,荧光显微镜下检测转染效率, 半定量RT-PCR和Wersternblot方法检测对HoxB7基因干扰效果以及 因对各组细胞增生能力的影响;比较转染后各组细胞形态。 结果 1(HG组细胞长呈纺锤形或更狭长形状,而NG组细胞呈圆形或鹅卵 石形。第4天开始HG组细胞较NG组细胞明显增殖,两组比较差异 III 博士学位论文 中文摘要 具有统计学意义 P 0(05 ;培养第8天时,HG组细胞数量由 加, 1 组与HG组比较差异具有显著性 P O(0o应用Westernblot检测:各 实验组同对照组比较,随时间延长VEGF的蛋白表达逐渐降低,差异 具有显著性 P O(01 ;各实验组同对照组比较,随时间延长PEDF 的蛋白表达逐渐增加,差异具有显著性 P O(01 。 ’2(Hox基因全部39个成员中有12个成员在两组细胞中都有表达,它们 HoxBl3基因的表达较NG组细胞增高,差异具有统计学意义 P O(05 IHoxB7是两组细胞中表达差异最显著的基因之一。 并有效的抑制了趾冲E(19细胞中HoxB7基因的表达,稳定转染后, 54-2(3 HoxB7(mRNA和蛋白抑制率依次Y寸 50(11 , 55(414-2(99 ,1且 博士学位论文 中文摘要 表达较未转染组和阴性对照组增高 P O(01 。干扰HoxB7基因后, ARPE(19细胞形态未发生明显改变。 结论 1高糖可刺激hRPE细胞增殖分化;控制血糖可从转录及翻译水平上 调hRPE细胞PEDF的表达,并抑制VEGF的表达。 2 殖型糖尿病视网膜病变的发生发展过程;HoxB7可能是与增殖型 糖尿病视网膜病变的发生发展关系最密切的Hox基因成员之一。 生发展过程。 关键词Hox基因;增殖型糖尿病性视网膜病变;ARPE(19;VEGF; PEDF:siRNA V ABSTRACT BACKGRoUND diabetesworldwide to Astheincidenceof rise, diabetic continuing causeof oneofthemostcommon become retinopathy DR has Callcause afterbirth。over90,of withdiabetes blindness people 1 with whichabout60,of diabetes,20,in retinopathy,of type patients 2 diabeteswill to diabetic type eventuallyprogressproliferative the PDRinour has become countryalready key and retinopathy PDR , as in totreatand blindness aswell point prevent currently treatmenton thecurrent PDR,laser (However,given future andtheir and can localtissues vitrectomyinjure photocoagulation fornew isnot itis tolook available, necessary long―termefficacy quite onits fortreatmentbased pathogenesis( approaches PDRisakindofcell diseaseswith proliferative isrelatedtocell main characteristics(It activation, asthe pathological vesselsare anddifferentiationcontrol new proliferation disorders,and ofabnormalcell IHox alsotheresults genes Hox proliferation(Type the kindof todetermine vital genes,contribute genes ,a growth-related differentiationand ofHox orientationofcell ortheir will affectcell directly genes transcriptionalregulationprotein thatHox anddifferentiation haveshown proliferation progress(Studies 博士学位论文 英文摘要 havebeeninvolvedinthe of genes progress an roleinthe of playingimportant tumor( anti―angiogenictargetedtherapy havealsobeeninvolvedin and in They body organmorphogenesis embryocic are forthe development,etc(Andthey responsibleregulation ofthe and as differentiation and hematopoieticproliferation race―specific manner(Therearehithertorarestudiesaboutthe stage-specific betweenHox anddiabetes(Andthe relationship genes relationship between PDRandHox hasnot been show genes that yet reported(Studies ARPE-19cells in conditions distinct grownhyperglycemicmaydisplay celldifferentiationandcell causesthe functions,includinghighglucose ofRPEcellstosecrete suchaSvascularendothelial changes cytokines growth factor VEGF andpigmentepithelium-derivedfactor PEDF andthe of RPEcells expressionaspectpromoting WeaSsumeHox isinvolvedinthe isakindof genes progress(PDR diseaSeaSsociatedwithneovascularization(VEGFandPEDF are major bloodvessels factorand factor stimulating inhibiting balancebetweenwhichiscrucialto ofstudieshave angiogenesis(Lots thatHox areinvolvedin of have proved which genes angiogenesis,parts reported the ofVEGFor theymayregulateexpression PEDF(Theremore, Weassume Hox contributeto the genes angiogenesisbyregulating ofVEGForPEDF(Inordertovalidatethe expression hypothesis,We the to the of then design experimentsinvestigatepathogenesisPDR,and VII aneffectivetreatmentand forit( we find prevention may oBJECTIVE differentconcentrationsof on theeffectof glucose 1 Toinvestigate anddifferentiationofARPE一19 wellasthe proliferation cells,as andPEDF( ofVEGF expression the ofHox inARPE一19cells 2 Toinvestigateexpressiongenes mediainorderto of cultured culturedindifferentconcentrations glucose choosethehox Hox andPDR(To the between relationship genes explore ofwhichisthemost thenext difference obvious,to gene,theexpressional experiment( ofthe on and theeffect purposegeneproliferation 3 Toinvestigate VEGFand aswellasthe of differatiationofARPE(19cells expression mechanisms。 PEDF(To its relative explorepossible METHoDS DMEM culturedin 18mMand5(5mM cells 1 ARPE一19 thenumberof andcell morphology proliferation respectively(Comparing were thetwo 9cells groups(ARPE-1 day 1-8days between per into totheconcentrationof inthe divided according glucose groups media:1(thecontrol culture 8mM ; 2(the glucosegroup HG,1 group high groups normalglucose 7 experiment culturedfor14 dayscell group;NG2 cells for21 andwesternblotwereusedtodetect cultureddays group(RT-PCR VIII 博士学位论文 英文摘要 the ofVEGFandPEDFinall expression groups( andNGwere andcontrol 2 HG experiment group group, ofHox todetect respectively(Applicationgenefamily―specific primers themRNA levelsof39 inthetwo RT-PCR expression genes groupsby and levelofthe was as image analysis(The geneexpressionexpressed ratio Hox to expressionrate RER ofgene,GAPDHcomputer image between difference thetwo was analysis(The groupsanalyzedby Statistical levelof analysis(Theexpression HoxB7,the expressional of differencewhichisthemost measuredwesternblot( available,wasby weredividedintofive 3 Cells and control HoxB7 small group(Threespecific interferingRNA small a interferingRNA,siRNA andnegmive toitsmRNA clonedinto designedaccording sequence,then pRNAT vector(TherecombinantweretransfectedintoARPE一19 plasmid plasmids transfection with wasdetected cells,respectively(Theefficiency fluorescence andwesternblotwereusedtoconfirm microscopy(RT-PCR the effectofHoxB7siRNAandtodetectthe of and VEGF expression MTT dtheeffectofHoxB7oncell PEDF(Usinginvestigate proliferation inall cell between groups(Tocompare morphologyeverygroup( RESULTS in hadan or 1 Cellsgrownhighglucoseelongatedspindleshape( IX 博士学位论文 英文摘要 hadaroundedor Cells in concentrations grownphysiologicalglucose the cobblestone differenceincellnumberbetween shape(Asignificant ofthe two wasnotedthefourth groups by day cellnumberfrom in increasedinviable grownhighglucose on 8(Thecellsin5(5 on 1t031(2+2(1E+04,ml 5(1+0(3E+04,ml day day wellon 1to from4(5+0(4E+04,ml mM increased per day glucose well 8(The ofPEDF-mRNAin 14(1+1(2E+04,ml expression per byday NGwas than andNG1 with HG HG P 0(05 ,NG2 higher comparing andNG3 with ofPEDF HG P 0(O1 ;theexpressionptotein comparing in was thanHG P O(0the levelincreased NG higher 1 ,andexpression in waslowerthan withthe ofVEGFNG time P 0(O1 ;theexpression decreasedwiththe andthe level time P 0(01 ( HG expression are12hox 2 There ( alrterence 、 sedmintwo S KrouDs(Thegro pressiona’differenceortrlox_m、 expressional two werenot groups of expression significant P 0(05 (The 10inHGwere with HoxD NG P 0(05 ( down―regulatedcomparing 13inHGwere The ofHoxB5、HoxB7、HoxBup―regulated expression is with differenceofHoxB7 expressional comparingNG P 0(05 (The mostobvious( HoxB7 1 knockeddown of specifcally expression 3 pRNAT-HoxB7 X 博士学位论文 英文摘要 and with control andblank effectively(Comparingnegativegroup group, thelevelofHoxB7mRNAand inARPE一 19cellstransfected protein with were 5士2(3 stably pRNAT-HoxB71inhibited 50(11 ,and level ofVEGFmRNAand inARPE-19cells 55(41士2(99 ,(The protein transfectedwith werelowerthan control stablypRNAT-HoxB71 negative andblank levelofPEDFmRNAand group group P 0(01 (The protein inARPE-19cellstransfectedwith were stably pRNAT-HoxB71higher than control andblank with negative group group P 0(01 (Comparing control andblank down negative HoxB7 group group,knocking siRNAinhibited of expressionby ARPE一 19cell(The proliferation inhibitionrations 6(1 were 1 afterthetransfectiontimeof48hand72h(There wasnodifferenceincell with controlandblank after morphologycomparingnegativegroup group downHoxB7 siRNA( knocking expression by CONCLUSIoN Canstimulatethe anddifferentiationof 1 Highglucose proliferation hRPE cell(Tocontroltheblood level can PEDFand glucose up―regulate 博士学位论文 英文摘要 HoxDl0 13、HoxC6and cells(HoxA6、HoxB3、HoxB5、HoxB7、Ho B members beoneofthe have withPDR(HoxB7 may relationship may most relatedtoPDR( closely the and 3 Theeffectthat canstimulate hi曲glucose proliferation differentiationofhRPEcell beachieved the may byup-regulating have withPDR ofHoxB7(HoxB7 expression may relationship by hRPEcells( PEDFand VEGFin up((regulating suppressing KEYWORDSHox 9;VEGF;PEDF;siRNA genes;PDR;ARPE-1 XU 博士学位论文 目 录 目 录 中文摘要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„I 英文摘要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„VI 前言„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„l翮青„„„„„„„„„”„„„„„„„”„„„„„„„“”„„„‘l 第一部分不同浓度葡萄糖对ARPE(19细胞生长与功能的影响 1(1材料和方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„4 1(2结果„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„14 1(3讨论„„??????„„„„„??„„„„„„„????„„„„„„„„„„„„22 第二部分l-lox基因在ARPE-19细胞中表达的研究 O OOO„„„„„„„„„„„„„„„„„„26 2(1材料和方法„„„„„OO 2(2结果„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„30 2(3讨论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„32 -19细胞生长及功能的影响 第三部分HoxB7基因对ARPE 3(1材料和方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„36 3(2结果„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„52 3(3讨论„„„„„„„„??„„„„„„„„„„„„„„„„„„„????6l 全文结论与展望„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„66 参考文献„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 68 综述„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 77 攻读学位期间主要的研究成果„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 87 致 谢„„????„„„„„„„????„„„„„„„„„„„„„„„??„„„„? ?88 博士学位论文 英文缩略语注释 英文缩略语注释 英文缩写 英文全称 中文全称 ARPE(19adultretinal 9 视网膜色素上皮细胞 pigmentepithelium-1 DR diabetic 糖尿病性视网膜病变 retinopathy PDR diabetic 增殖型糖尿病性视网 膜病变 proliferativeretinopathy l冲E retinal 视网膜色素上皮 pigmentepithelium PEDF derivedfactor 色素上皮衍生因子 pigmentepithelium VEGF vascularendothelial factor growth 血管内皮生长因子 Hox Hox 同源异型盒基因 genes siRNAsmall RNA 小干扰RNA interfering DMSO smlfoxide 二甲基亚砜 dimethyl 3一 4,5一二甲基噻 唑一2 3- 4,5-dimethy-2-thiazolyl 一2,5一diphen MTT bromide yl??-2H??-tetrazolium 一2,5一二苯基四 氮唑溴盐 bFGF basicfibroblast factor 碱性纤维细胞生长因 子 growth GROa growth―relatedoncogenenea生长相关的原癌基因Q MMPsmatrix 基质金属蛋白酶 metalloproteinase HUVECshumanumbilical veinendothelialcells 人脐静脉内皮细胞 EC endothelialcell 内皮细胞 CAM chickchorioallantoicmembrane鸡胚绒毛尿囊膜 VSMCvascularsmoothmusclecell 血管平滑肌细胞 博士学位论文 日?舌 ?????-‘'??_?- 刚看 糖尿病性视网膜病变 diabetic 症。研究发现,DR的发生率随糖尿病病程的进展逐渐升高,糖尿病发病5年后视 网膜病变发生率约为25,,10年后增至60,,15年后可高达75,(80,,其中25, diabetic 为危害最大的增殖型糖尿病性视网膜病变 proliferativeretinopathy,PDR 九。随着我国糖尿病患病率的不断上升,PDR已成为我国主要致盲眼病之一n1, 是我国目前以及未来防盲、治盲的重点121。然而,目前针对PDR尚缺乏十分有效 的预防和治疗手段,究其原因在于其发病机制极为复杂,以高血糖为始发因素, 多种途径参与其发病过程,如较为经典的分子通路:多元醇通道活性的增加: 蛋 BiOSynthesis Glyeation 病通路的上游存在各致病通路的共同启动因子活性氧 reactive oxygenspecies, ROS ,推出了统一机制学说。但目前还没有哪一种途径能完全阐明PDR的发病 分子机制。鉴于PDR的病理机制尚未完全阐明,且目前的治疗方法一光凝和玻璃 体切除术对局部组织创伤较大、远期疗效不明显,在分子水平上探究其发病机制 以期指导临床显得尤为重要。 以往大量研究表明,长时期的高血糖是发生DR的基础及决定因素,它可刺激 视网膜多种细胞生长增殖、分泌多种生长因子,且这些生长因子在DR病理过程 中发挥着极其重要的作用晦301,从而致使D础拄展成PDR。PDR是以视网膜新生血 管和纤维化为特征的视网膜病变。视网膜新生血管位于视网膜表面,大多突出于 内界膜外,与玻璃体接触;血管壁薄,易破裂引起玻璃体出血;新生血管与玻璃 体皮质粘连,垂直长入玻璃体后经由多种生长因子介导,促使视网膜前和玻璃体 内RPE细胞、成纤维细胞、神经胶质细胞等细胞成分及结缔组织增生,形成视网 膜前膜,这种粘连和新生血管膜收缩、牵引患者视网膜脱离,导致视力丧失,其 中RPE细胞对生长因子的敏感性是增殖性视网膜病变的关键口11。 目前视网膜新生血管形成的机制尚未完全阐明,绝大多数研究支持其生成与 内源性调节因子失衡有关,即血管生成刺激因子和抑制因子间的平衡丧失。眼部 与其它组织,样,在正常情况下,脉管系统较稳定,血管增生刺激因子和抑制因 博士学位论文 前言 共同控制眼部血管形成;而此时内源性血管抑制因子可保子之间达到平衡, 持玻 璃体和外层神经视网膜无病理增生血管口羽。糖尿病发生时,高血糖刺激了血管生 成因子的增多同时导致血管抑制因子的降低,打破了两者间原有的平衡,视网膜 产生新生血管及纤维增殖,从而发展成PDR损害视网膜组织功能。在新生血管刺 激因子和抑制因子系统中,VEGF和PEDF被认为是一对典型代表。VEGF是目前 文献上公认的最强内皮细胞选择性促有丝分裂因子和血管生成因子,参与多种生 理和病理新生血管形成过程;同时它也是公认的参与PDR发病的主要致病因子。 通过反义技术、RNA干扰技术等阻断VEGF的表达或阻断其与相关受体的结合能 有效阻止PDR的发展,但这些方法的临床推广价值有限。PEDF是人及动物眼中天 然存在的一种糖蛋白,属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族,主要来源于RPE细胞,也 可见于角膜、房水、玻璃体及视网膜等中。以往对PEDF的神经保护作用及抗肿 用,可能是维持角膜、玻璃体等眼内组织无血管形成的主要原因。现在越来越多 的证据表明PEDF是目前最重要、最具代表性、最强有效的新生血管抑制剂之一 因啪删。然而在PDR发生时引起VEGF,PEDF比值的升高的机制尚未完全清 楚。有 报道表明在糖尿病状态下,高糖、低氧等多种因素H卜“1可激活丝裂原活化蛋白激 酶通路,进而调节VEGF的表达。另有报道显示,PDR患者玻璃体中PEDF含量明 5’拍1,说明低浓度的PEDF与新生血管之间有直接关系,导致D显减少“ 瞄入活动 期,并且在眼部新生血管形成过程中,PEDF及VEGF比率失衡:然而,目前尚未 见相关文献在分子水平上明确阐明PDR患者玻璃体、视网膜中PEDF含量明显减 少的机制。姚毅等报道高葡萄糖能直接下调RPE细胞分泌的PEDF的表达n引,但 G(Heimsath 其作用机制也未能清楚阐明。在Ernest Jr等n钉的一次研究中证实高糖 环境下可使得RPE细胞发生增殖分化和功能方面的变化,而这些变化有可能致 RPE细胞分泌的有关新生血管生成细胞因子女IVEGF等含量改变。因此我们研究 第一部分拟在体外分别用高糖和正常糖培基培养ARPE(19细胞以模拟体内糖尿 病和正常糖环境,观察不同浓度葡萄糖对ARPE一19细胞的增殖分化、VEGF和 PEDF表达水平的影响。 2 博士学位论文 前言 I型同源盒基因 Hox基因 是一类重要的发育相关基因(根据染色体定位, 、B、C、D共4族,每族各有9(11个独立的基因,它们可通过其可分为A 特异的“时 空”表达模式决定细胞的定向分化与增殖。一旦Hox基因或其转录调节蛋白功能 异常,则将直接影响细胞的增殖与分化过程。而PDR在病理学上被认为是一类以 新生血管为主要特征的细胞增殖性疾病,其发生发展与细胞的激活、增殖和分化 调控失常有关,新生血管也是细胞异常增殖的结果。近年研究发现,Hox基因 除调节脊椎类动物和人类胚胎器官发育、组织重建、干细胞自我更新外,作为细 胞增殖和分化的主控基因,也广泛参与人类多种恶性肿瘤的发生、发展及预后等 过程H7嘞】。而恶性肿瘤的发生、发展与新生血管有着密切关联。新生血管的生成 涉及到增殖、出芽、形成、重塑4个阶段,在这一系列生物反应过程中,由VEGF 和PEDF之间的表达失衡所致的血管内皮细胞改变起着主导作用,能够影响 血管 内皮细胞增殖、迁移、粘附等生物学功能的因子即能影响新生血管的形成,因此 血管内皮细胞成为抗血管生成治疗中独特的靶细胞。目前已有不少文献证实了 ,也有部分文献报hox基因参与血管内皮细胞迁移、增殖和分化过程畸闱1 道了某 些Hox基因可分别参与VEGF和PEDF表达的调节汹’5明。结合以上研究结果,我们 大胆设想:高糖可能导致RPE细胞中某些Hox基因表达的改变,从而使得RPE细 胞在形态、数量以及功能上发生改变,最终调节VEGF、PEDF的表达。因此我们 时探讨其可能作用机制。 为了验证以上推论,本课题以在体外分别用高糖和正常糖培基培养ARPE一19 以模拟体内糖尿病和正常糖环境,观察两种不同条件培养的细胞在增殖分 化、 表达的影响,并进一步探讨其可能作用机制,以期在分子水平提出Hox基因 作 为PDR损伤潜在靶点治疗的可能性,为下一步动物及临床实验提供理论依 据。 博士学位论文 第一部分 第一部分不同浓度葡萄糖对ARPE(19细胞 生长与功能的影响 1(1材料与方法 1(I(1主要仪器设备 Formal 二氧化碳恒温培养箱 Scientific公司,美国 NikonECLIPSE 倒置相差显微镜 TSl00,日本 超净工作台 YJ(1450SDB型,吴江市净化设备厂 Beckman低温高速微量离心机 Beckman,美国 Mistral1000水平离心机 MSE,英国 TDZ5型低速多管架自动平衡离心机 湖南长沙湘仪离心机仪器有限公司 TGL(16M型高速台式冷冻离心机 湖南长沙湘仪离心机仪器有限公司 微量高速制冷离心机 Beckman,美国 全自动酶标光度仪 Bio(Radmodel1450,美国 FX320电子天平 A&D Limited,日本 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