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肿瘤坏死因子受体Ⅱ脂联素球状结构域融合蛋白生物活性研究

2017-12-01 36页 doc 62KB 54阅读

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肿瘤坏死因子受体Ⅱ脂联素球状结构域融合蛋白生物活性研究肿瘤坏死因子受体Ⅱ脂联素球状结构域融合蛋白生物活性研究 肿瘤坏死因子受体?脂联素球状结构域融合蛋白生物 活性研究 南方医科大学级博士学位论文 肿瘤坏死因子受体.脂联素球状结构域融合 蛋白生物活性研究? 课题来源:国家“重大新药创制”科技重大专项项目:? 业 专 名 称 免疫学 学位申请人 罗满生 指 导 教 师 高基民教授 答辩委员会主席 惠宏襄 孟民杰 答辩委员会成员 周 荣 李红卫 马 骊 王一飞 论文评阅人 李 明 黎诚耀日 广州 年月博士学位论文 肿瘤坏死因子受体一脂联素球状结...
肿瘤坏死因子受体Ⅱ脂联素球状结构域融合蛋白生物活性研究
肿瘤坏死因子受体Ⅱ脂联素球状结构域融合蛋白生物活性研究 肿瘤坏死因子受体?脂联素球状结构域融合蛋白生物 活性研究 南方医科大学级博士学位论文 肿瘤坏死因子受体.脂联素球状结构域融合 蛋白生物活性研究? 课题来源:国家“重大新药创制”科技重大专项项目:? 业 专 名 称 免疫学 学位申请人 罗满生 指 导 教 师 高基民教授 答辩委员会主席 惠宏襄 孟民杰 答辩委员会成员 周 荣 李红卫 马 骊 王一飞 论文评阅人 李 明 黎诚耀日 广州 年月博士学位论文 肿瘤坏死因子受体一脂联素球状结构域融 合蛋白生物活性研究 博士研究生:罗满生 指导教师:高基民 摘要 等发现,因最初发现内毒 肿瘤坏死因子首先于年由 素能诱导机体一种糖蛋白的表达并引起实体性肿瘤的出血坏死而得名。分 游离型和跨模型,都有生物学活性。跨模型,经转化酶 裂解后成为游离型分子,。是机体炎症反应的有力诱导因 子,能调节固有性免疫并且在介导机体通过类免疫应答抵抗胞内细菌及某 些病毒感染过程中发挥重要作用。然而,表达调节失控也会导致多种病理 作用,包括免疫介导的炎症性疾病 .氨基半乳糖/旨多糖 诱导的急性肝损伤、诱导的内毒素休克以及类风湿性关节炎。因此, 成为这些疾病的重要治疗靶点。 受体分、两种。由于天然状况下 以同源三聚体的形式结合至体内游离的或跨模型受体、而引发胞 内下游一系列信号转导途径的活化引起相应的细胞生物学或病理生理过程, 因 此,模拟同源三聚体形式的复合分子将能更有利于与结合而拮 抗模型受体与的结合。目前在临床上使用的拮抗剂主要是二价分子, 包括可溶性肿瘤坏死因子受体与的段形成的融合蛋白 .幂 单克隆抗体如嵌合型、人源化两大 类。因市场庞大,新型高效拮抗剂的研发是研究的热点。摘要 脂联素是脂肪细胞分泌的细胞因子,促进骨骼肌细胞和肝细胞对葡萄糖摄 取和脂肪酸的氧化,降低血甘油三酯,并提高机体对胰岛素的敏感性。借助脂 联素球部可自行形成紧密同源三聚体的特性,我们研制出了三聚化的 ,即可溶性肿瘤坏死因子受体.脂联素球部.融合蛋白。 该蛋白能以更接近于天然三聚体的形式结合并拮抗其生物活性。 研究认为,由于的暴露而使过度表达能导致肝脏受损。这一观点 已经在用特异性抗体或抗血清中和循环而减轻诱导的急性肝损伤作用 的实验中得到验证。现己研究表明,促炎症细胞因子级联反应的活化包括 被认为是临床上严重肝损伤结果这一病理过程中起重要作用的环节。因此, 通 过拮抗体内过度表达的可以对因一些细菌特别是革兰氏阴性菌感染而引起 的内毒素血症休克起治疗作用。 另一方面,尽管的详细发病机制不甚了解但目前以人为其为一种系统 性、进展性的伴随免疫炎症的自身免疫功能紊乱,其病理特点表现为主要引 起 关节滑膜损伤并导致软骨破坏直至骨关节的破坏。传统的疾病缓解抗风湿药 物 虽然能有效地改善患者的临床症状及提高活动能力,但并未能阻 止患者关节进行性损害。有研究发现一方面在患者的炎症性滑膜特别在关节 软骨.关节翳连接处表达明显增高;并且将人基因敲入小鼠基因组后 引起过度表达并导致小鼠产生慢性多关节炎症,发病率达%。所以,拮 抗已成为临床治疗的新方向。 本研究利用真核细胞表达系统制备该融合蛋白,并通过内毒素诱导的急性 肝损伤小鼠模型和类风湿性关节炎大鼠模型、研究其拮抗的疗效,为最终 能在临床应用奠定基础。 ..体外生物活性研究 .两种拮抗剂体外生物活性比较博士学位论文 ?取对数生长期的细胞,.%胰蛋白酶消化后用完全培养液 调整细胞合适密度;?取孔培养板,每孔加入细胞悬液,置?, %温箱孵育;?稀释样品.、.稀释液中含 ;?每 品及放线菌素,弃上清;?加入.稀释样品,培养~ 孔加入 ,。孵育;?去上清,加入,在酶联免疫检测仪 处测量各孔的吸光值。 .体外受体.配体复合物测定实验 ?小鼠重组抗体包被孔板;?%封闭,。过夜;? 洗涤后加入稀释好的..或..反应液;?经 ; 洗涤,加入检测抗体,孵育 ;?洗板次,加入酶标二抗,室温孵育 ?拍干,随后加入显色液,放置~;?加入终止液,读板。 ..对/诱导的急性肝损伤的治疗作用研究 . /诱导的急性肝损伤模型的建立 /小鼠隔夜禁食后经腹腔注射/混合液,阴性对照组注射等 。 量生理盐水,连续观察 . .对/诱导的急性肝损伤的疗效观察 ??对生存率的影响:实验分为正常对照、阴性对照、 .阳性对照、.组。部分小鼠经腹腔注射/后 立即治疗,阴性组注射无菌;另一部分小鼠于造模后 进行治疗。 小鼠经治疗后连续观察 ,各组的生存率。?血清酶学变化: 测定各组血清谷丙转氨酶、 半致死剂量/造模,分别于治疗后、 谷草转氨酶。?.对肝脏组织病理学的影响:半致死剂量 处死,立即剪取 /肝脏置已准备好的%中性甲醛 /造模,治疗后 溶液固定过夜,用于苏木素.伊红染色。 . 对/治疗作用的机制研究 ?血清定量及活性测定:半致死剂量/造模,治疗后、 测定血清及其活性;?血清..复合物测定:造模并经治 摘要 疗后 采血。利用双抗体夹心法测定.治疗组血清 实验动物处死 ..复合物;?肝脏.测定:治疗后 后立即剪取适量肝脏组织,置于.。用于 检测.;? 法凋亡检测:治疗后 实验动物处死后立即剪取.肝脏组织置于 %甲醛固定过夜,切片后部分用于法观察各组肝脏凋亡情况。 ..对胶原诱导的大鼠类风湿性关节炎治疗作用研究 .牛型胶原诱导的大鼠类风湿性关节炎模型构建 ?牛型胶原溶液加入等量佛氏完全佐剂中,?搅拌过夜;?雌性 大鼠尾根部皮内注射制备好的型牛胶原乳剂?;?第天再次胶 原免疫 。 . .对的疗效观察 ?发病率、严重程度:第二次胶原免疫后第天将大鼠随机分为 对照、.阳性对照、.实验组。正常对照为未经胶原免疫 的大鼠。自当天开始每天治疗一次,共次;治疗前记录各组的 发病率、足爪肿胀、以及关节炎临床评分,直至第天;?血清胶原抗体 测定:分别于治疗前、治疗后采血,肝素钠抗凝。一部分用于流式测 定,其余抗凝血经离心后用于测定抗.;?大鼠踝关节组织病理学改变: 治疗后天截取大鼠踝关节置于%中性甲醛固定,.%溶液脱钙 处理,经包埋、切片后进行苏木素.伊红染色。 . .治疗的机制研究 ?外周血、.测定:分别于第、天测定血清、. 水平,观察治疗前后血清、.变化情况;?外周血调节性细胞测 定:第、天采血抗凝后经.、.表面标记及. 胞内标记后流式检测治疗前后外周血调节性细胞。 .统计学分析 所有计量资料用士表示,采用.匕较计量资料 组间差异,方差不齐时用法法校正,采用 进行两两比较;采用 博士学位论文 重复测量方差分析 :较各组不同时间点同一指标的变化,球 形检验不满足时采用.法校正。检验水准.,双侧检验; 法比较各组生存率;实验中非参数资料采用多个独立样本非参数 卡方检验.。采用.统计软件包进行数据分析。 结果 .体外.相比.具有更强的拮抗能力 ?体外拮抗实验:结果显示,在.~. 范围内相对于., 表现出更强的拮抗能力,差异显著尸.;?体外配体一 受体复合物测定:结果表明在检测浓度下 ..复合物水 平显著高于.,.。 ..减轻/诱导的急性肝损伤 ?.治疗对生存率的影响:当造模后立即治疗时,阴性对 照组造模后.~ 全部死亡,阳性药物组死亡主要出现在造模 以后,其 生存率近%:而.治疗组生存率达%,与模型组比较具有显 治疗时,.组 存活率为 著统计学意义尸.。当造模后 .%,大多数死亡发生在治疗后~ 生存率达 ,而.治疗组 .%,并且死亡集中在治疗后 左右;与模型组比较,两拮抗剂治疗组生存 率显著升高并具有统计学意义。..;。.。.,而两 拮抗剂治疗组之间差异无统计学意义俨.。 ?.治疗后肝损伤减轻:为考察治疗后肝脏受损情况,比色法 测定血清、以及.染色观察肝脏病理学改变。血清酶学结果显示, 造模后立即治疗时,在个不同时间点、 四组血清差异有统计学意义 .,.。其中两拮抗剂治疗组的水平明显低于模型组水平且 具有统计学意义.;造模后立即治疗时,四组间变化、 具有统 计学差异旷.,.,与正常组比较,模型组变化显著,具有统 计学意义.而两种拮抗剂治疗组变化则无统计学意义 摘要 治疗时 各组血清酶含量显著 尸。.;。.。延后 高于 水平,四组间水平变化具有统计学差异庐.,.;延 后 治疗时四组变化组间差异具有统计学意义庐.,.,其 中.治疗组与模型组尸.、阳性药物组尸.之间差异具有 统计学意义。 宏观上,治疗后阴性组肝脏明显肿大、充血,在两种治疗模式下造模后立 即治疗、造模后 治疗三组肝脏/体重指数依次分别为..、 ..、..、..庐. ..、 ,.禾 .土.、.士.、.士.庐.,.,在这两种治疗模 式下模型组脏脏/体重指数都明显高于其它三组,组间差异显著尸.。另外, 在造模后立即治疗时,.治疗组肝脏/体重指数低于阳性对照组,差 延迟治疗时两组差异无统计学差异 异具有统计学意义.而造模后 伊.。 组织病理学方面,模型组肝损伤非常明显,肝细胞大面积损害,很少见到 完整的肝组织结构。胞核消失,固缩、胞膜破坏、细胞间隙模糊,肝窦几乎消 失,白细胞侵润明显。而在.、.治疗组,肝细胞损伤情 况明显较轻,尤以后者甚为明显。而且,造模后延迟 治疗时肝脏损伤程度比 造模后立即治疗严重。 ?.治疗后血清水平升高而活性变化不明显:治疗后各组 外周血都保持在较高的水平,其中造模后立即治疗时模型组、阳性对照、 、 实验药物组在 分别为..、..、.士. /.,.和..、.士.、.士. / .,.,显著高于正常对照水平.士. /;阳性对照组和实 验药物组水平显著高于模型组,各自差异具有统计学意义;而两拮抗剂治疗 组 治疗后 、 三组分 之间差异无统计学意义.。造模后延迟 别为..、..、.. /和..、..、 .. /,而正常对照组水平为.. /,方差分析表明,博士学位论文 ., 组间差异具有统计学意义乃.,.; .。 而且,?治疗组水平显著高于阳性对照组.; , .。细胞毒性实验结果显示,当造模后立即治疗时,在治疗后、 拮抗剂治疗组活性均明显低于阴性对照组,三组间变化差异具有 治疗时,在相同时间点、 统计学差异庐.,.;当治疗后延迟 三组细胞毒作用分别为%、.%、.%和.%、.%、.%, 三组间变化差异具有统计学意义户.,.,其中模型组 活性显著高于其它两拮抗剂治疗组尸.。 ?.明显抑制过程中肝细胞凋亡 为评价这两种拮抗剂对肝细胞凋亡作用的影响,我们分别进行 原位凋亡检测肝细胞的凋亡情况以及 法检测各组肝组 织中.的活化情况。结果显示,此模型中肝细胞发生了大面积 凋亡,治疗组凋亡指数明显高于其它两个拮抗剂治疗组而正常组小鼠 则未能检测到肝细胞的凋亡。从蛋白水平看,阴性对照组 时肝脏. 表达明显增强,并有其裂解片段的出现,这暗示.被活化。结果还显示, 虽然造模后立即治疗时两拮抗剂治疗后一表达无差异,但在造模 后延迟 治疗时.治疗组.裂解片段表达显著增强而 .治疗组则几乎不表达。 ..对牛?型胶原诱导的大鼠类风湿性关节炎的治疗作用 ?.对大鼠发病率、严重程度的影响 自实验第天开始每隔天观察并记录各组的发病情况,包括发病率、 足爪肿胀以及临床评分,直至第次治疗后天共次,间隔天。结果显示, 经三次治疗后模型组、阳性药物组及?治疗组发病率分别为 %、%、.%,组间差异具有统计学意义穿.,.。其中模型 组发病率高于其它两拮抗剂治疗组,.治疗组最低。 排水法测定结果显示,随着时间推移模型组肿胀越加明显,其具体为 .士.、.土.、..;而其它两组动物的足爪体积分别是: 摘要 ..、.士.、.士..治疗组、.士.、.土.、 ..?治疗组。三组间差异具有有统计学意义庐., .,但两拮抗剂治疗组之间差异无统计学意义尸.,而且阳性 对照组与治疗组之间无显著性差异产.。 根据普遍采用的临床评分标准,每一组实验动物根据足爪的红肿情况获 得一个评分。结果表明,各组其临床评分与疾病进展相关,而且. 治疗组临床评分统计量即平均秩次在各观察时间点均明显低于模型组和阳 性对 照组。 ?.对大鼠血清.水平的影响 结果显示,三组.水平在治疗前差异不显著分别为、 士、士 /;.,.;治疗后对照组为/,阳性药物组为 /,治疗组为 士 /,组间差异显著,具有统计学意义.,.。其中 治疗组水平最低,显著低于对照组尸.幂阳性对照组 .。 ?.对大鼠血清水平的影响 法分别测定各组实验动物的血清水平。结果显示,除正常大鼠 外.士. /其它三组的水平均显著升高,治疗前水平分别为 ..、..、.士./,四组间比较差异具有统计学意义 产.,.;治疗后阴性对照组水平有一定的下降,而其它两 拮抗剂治疗组则明显高于治疗前,三组结果分别为.土.、.土.、 ../,组间差异具有统计学意义.,.。其中治疗后 两拮抗剂治疗组水平显著高于对照组尸.而拮抗剂治疗组之间差异无 统计学意义俨. 。 ?.对大鼠血清.的影响 相对于正常组.. /,治疗前各造模组一水平显著升高,三 组。水平分别为..、..、..,组间差异具有统计学意义 博士学位论文 .,.;治疗后阴性对照组升至.. /,而 、治疗组分别是..、.. /,与正常组 比较组间差异具有统计学意义.,.,阴性对照组水平显著高于 另外两组.,而两拮抗剂处理组之间差异无统计学意义俨.。 ?.对大鼠外周血的影响 流式检测显示,与数量的下降相关。治疗前各组大鼠外周血水 平显著低于正常组.,四组间差异具有统计学意义庐.,., 而这三组间相互差异无统计学意义尸.。经三次治疗后,模型组徘回在 治疗前水平甚至有所降低尽管前后差异无统计学意义.,.;而两 种拮抗剂治疗组水平趋于恢复至正常组水平,各自与其治疗前水平相比,差 异显著尸.,与正常组比较差异无显著性尸.。治疗后四组间差异具有 统计学意义庐.,.。 ?.治疗中大鼠病理组织学及影像学变化 经脱臼处死大鼠后,部分大鼠的踝关节立即放入%中性甲醛溶液中固定 用于组织病理学检查,部分大鼠自膝关节以下截取用于检查踝关节影像学变 化。 .染色表明,相对于正常对照,阴性对照组踝关节出现滑膜腔变窄、弥漫性白 细胞侵润、软骨增生增厚、软骨成骨界限模糊、滑膜破损严重,而. 和?治疗组则明显较轻,在.组有少许的软骨增厚、少量 白细胞侵润而.的组织病理学则近乎于正常组。影像学方面, 组有明显的踝关节软组织肿胀以及骨质破坏而其它两组则无此现象。 结论 本研究首先经体外实验证实?能有效地结合并拮抗,并且 其拮抗能力高于已商品化的同类制剂?。在/诱导的治 疗实验中,该融合蛋白通过竞争性结合体内过度生成的而抑制该模型所致 的急性肝损伤作用并在一些方面优于.,如体外拮抗作用、抑制 过程中升高以及脏脏/体重指数。其机制可能是通过结合而抑制肝摘要 细胞表面相应受体活化最终阻碍细胞凋亡。另外,本研究表明,. 通过拮抗体内慢性炎症产生的生物活性进而抑制细胞分化以及促进 外周恢复有效抑制或缓解牛胶原诱导的大鼠关节炎。因此,. 作为一种新型的拮抗剂,在临床治疗一些与过度表达相关疾病过程中 将具有相当的潜力。而且本研究还表明,通过基因重组技术构建的细胞因子 受 体.融合蛋白拮抗相应炎症细胞因子从而预防或治疗相关因子引起的一些炎 症性疾病的可行性,为抗细胞因子治疗提出新的思路。 关键词 肿瘤坏死因子?急性肝损伤胶原诱导的关节炎 博士学位论文: :.? . . ,, , . ?. . . ,/,. , ., .. . . . ? ,. . , ., ?.?.. 。. , , . . ’ , ., .%. .博士学位论文/ . . .. ? .% .? 。,% , .? ,, .?, .? , 。.? ., . / ?. .? %.? .?.? . .? .? . . /? . /. / .., . ./? : . / . ..? /?: /,.? : %. .:? .: ??.? : . .? : . .? . ? .? , .?. . ? ,, ?,? . . . ,,.?? :博士学位论文. .? , %.%.? ,. . ? , . : 一,一 . ..? 仅 ? . ?,? 妒. ...? ? ., .,. .. /? . ? : % . , % %俨. . ,.%.%.,, 伊. .: ? ,.. .,. ; 庐 . ,. ., . ; ./ ..、.士.,..,.. , . ..、..,.., 旷.,.. ../ ..,..尸生.,.,, . / .土.、.士.,.土.,... ,... ,..,.士..,. . 俨. , . , 妒. .., ,,, .博士学位论文 ., ,?, / . ? : ..、..,..,.. / ,..,. ;, . .. ., .., /, .,. , 旷 , . . /. , , ,.,.;.,..,’ .;. 、 . . .;. . .,.;,, %,.%,.% %,.%,.% .. ,庐 ,. ./? : , . ?. , , ,.. ’一, , .. : ?..,谬. ,. . , . ..,..,.. ,,,...,.士.,.士.? .:.,.士. ,.. ?.庐.,.. ’ , ?..,.. ,. .,.. : ? . .土. 博士学位论文/, ..,..,. ./ ,, .,. ;,. ,..、 ..、 ../,. 庐.,. .尸. ,伊. . ? ?: ? ,庐. ,.; ,?,仁.,.., , . . :, ? .. , .,. / ., ., . . .. ?: , ? . . , .,.,.. .. .. , ?, ..,.., ?. , 昨.,.. ..,,,.,. 仃 ,. .: ?% ,;. , , , . ? . ,. ,. . .盯可. / . ? , , , , . ? . .、 , 博士学位论文 .:;; ;博士学位论文 目 录 摘要? 前言吾第一章 .体外拮抗活性实验?. .材料与方法? .结果?. .讨论.. 第二章.对/诱导的急性肝损伤治疗研究??.. .材料与方法.. .结果.. .讨论.. 第三章.对牛型胶原诱导的大鼠风湿性关节炎治疗研究.材料与方法? .结果.. .讨论.. 全文总结??. 综述?. 参考文献??. 英文缩略词表 参与的科研项目和发表的相关论文. 致谢?. 南方医科大学学位论文原创性声明. 统计学审稿证明.博士学位论文 前言 等发现,因最初发现内毒 肿瘤坏死因子首先于年由 素能诱导机体一种糖蛋白的表达并引起实体性肿瘤的出血坏死,因此而得名 【。 分游离型和模型两类,并且都有生物学活性,其中跨模型, 经相应的转化酶裂解后成为游离型分子,。体内分泌 的细胞多种,包括免疫细胞、非免疫细胞、以及一些肿瘤细胞【】。是机体炎 症反应的有力诱导因子,能调节固有性免疫并且在介导类免疫应答抵抗胞 内细菌及某些病毒感染过程中发挥重要作用。但是,表达调节的失控也会 /诱导的急 促进多种病理作用,包括免疫介导的炎症性疾病女【 性肝损伤、诱导的内毒素休克以及类风湿性关节炎、克莱恩病、强制性脊柱 炎以及溃疡性结肠炎等。因此,近些年逐渐成为这些疾病的重要治疗靶点。 受体有、两种。多数细胞类型及组织 均表达这两种受体,它们的表达受某种特定机制的调控。一般情况下, 组成性低表达而的表达则受制于由外源刺激所引起的转录调控和翻译后 调控【。由于天然状况下以同源三聚体的形式结合至体内游离的或胞模型 受体、,从而引发胞内端下游一系列信号转导途径的活 化引起相应的细胞生物学或病理生理过程。因此,模拟同源三聚体形式 的复合分子将能更有利于与配体的结合而拮抗模型受体与的结 合。单体是的天然拮抗剂,为肿瘤坏死因子受体的细胞膜外部 分【。因成熟是以三聚体形式存在,单体与间的亲和力低, 且在血液循环中的半衰期很短,故该单体药用价值不大。所以,如何 增强与间的亲和力从而拮抗体内因升高产生的一系列不良反 应显得尤为急迫。 目前已开发的拮抗剂主要包括可溶性肿瘤坏死因子受体与 的段形成的融合蛋白.和抗的单克隆抗体嵌合型 抗体和人源化抗体两大类。这些拮抗剂是目 前治疗类风湿性关节炎最为有效的药物;它们能有效缓解疼痛、防止或明显 降前言 低关节结构的破坏,从而改善并维持关节功能。.融合蛋白名称 ,是一个同源二聚体,由中国仓鼠卵巢细胞分泌表达获得。其 原理主要基于将可溶性与免疫球蛋白分子的片段通 过基因重组作用连接在一起形成.融合蛋白。借助的二聚体化作 单体的.倍【,引。 用,拮抗的能力是相应 脂联素是脂肪细胞分泌的一种蛋白质激素,约占人血浆总蛋白的 .%./,故其浓度是其它激素浓度的.倍【】。脂联素由两部分组 成:氨基端的胶原状结构和羧基端的补体样球状结构。脂联素在血中以全 长和蛋白酶裂解后的球状结构二种形式存在。全长脂联素通过其球状结 构可形成紧密的同源三聚体,继而通过其胶原状结构进一步形成更为复杂的同 源多聚体,但仅能形成同源三聚体【】。借助可自行形成紧密同源三 聚体的特性,我们课题组发明了已授权同源三聚体化的,即可溶性肿 瘤坏死因子受体.脂联素球状结构域融合蛋白.。其不仅因三聚体 化作用大大增强了与的亲和力,而且因分子量增大可延长其在血 液循环中的半衰期【】。所以,.将成为诸如临床内毒素休克及 等过多表达相关疾病治疗的新选择。 研究认为,由于的暴露而使过度表达能导致肝损伤。这一观点已 经在用特异性抗体或抗血清中和循环而减轻诱导的急性肝损伤作用的 实验中得到验证【,】。急性肝损伤有诸多类似于内毒素性休克,如促炎症细胞 因子的释放、肝细胞损伤及最终多器官衰竭。现已研究表明,促炎症细胞因子 级联反应的活化包括被认为是临床上严重肝损伤结果这一病理过程中起 因此,通过拮抗体内过度表达的理论上可以对因一 重要作用的环节【】。 些细菌特别是革兰氏阴性菌’感染而引起的内毒素血症或休克起治疗作用,这 一实验因此也常用来验证一些拮抗剂的体内拮抗活性。 另一方面,尽管的详细发病机制不甚了解但目前以人为是一种系统 性、进展性的伴随免疫炎症的自身免疫功能紊乱,其病理特点表现为关节滑 膜 损伤并导致软骨破坏直至骨关节的破坏。传统的疾病缓解型抗风湿药物 博士学位论文 虽然能有效地改善患者的临床症状及提高活动能力,但并未能 阻止患者关节进行性损害。以前的研究提示,一方面患者的炎症性滑膜特别 在关节软骨一关节翳连接处表达明显增高,另一方面将一段涉及 翻译抑制并缺乏’非翻译区的人类基因过继到小鼠后引起过度表 达并导致过继小鼠产生慢性多关节炎症,发病率达%阻剐。所以,拮抗已 成为临床治疗的新方向。然而,以上生物拮抗剂在使用过程中伴随一 些不良反应出现,特别是感染阻们。因此,开发其它有效、不良反应少的 生物拮抗剂成为新的研究方向。 本研究拟通过体外细胞毒性试验验证.融合蛋白的 拮抗活性并考察该重组蛋白对两种临床常见疾病模型的预防或治疗效果,进 而 探讨通过基因重组技术构建的细胞因子受体.融合蛋白用于某些与细胞因子 尤其是促炎症细胞因子过度表达相关疾病治疗的可行性,为临床抗细胞因子 治 疗提供新的思路。第一章.体外拮抗活性实验 第一章.体外拮抗活性实验 是一种多能性促炎症细胞因子,有分泌性、模型两种。其通过相应受 体结合而介导多种病理生理现象如炎症、感染、自身免疫及恶性肿瘤。 分禾 两种,均具有分泌型和跨模型两种类型。分 泌性可与模型竞争结合,抑制膜型受体胞内 端活化。广泛表达于机体各类细胞表面,结合后通过其胞内死亡结 构域活化核因子.和有丝分裂原激活的蛋白酶活化途径参 与机体促炎症、细胞毒作用以及凋亡。而则缺乏胞内端结构域,主要表 达于造血细胞,经结合膜型后被活化。活性与血细胞活化、增殖、 迁移作用有关。 目前,已开发的拮抗剂主要有抗体和融合蛋白两大类。 其中前者的以英夫利昔为代表而后者则以依那西普为代表。 依那西普现已 成为 临床治疗的一线用药。这两者的前期生物活性研究都以小鼠成纤维母细胞 为测试对象,因为该细胞表面同时表达和,因此在抗有丝 分裂剂放线菌素存在情况下通过结合而引起细胞毒性作用,是理 想的拮抗剂活性测试细胞。所以本实验拟利用细胞毒性杀伤实验测 试本课题组最新开发的另一种拮抗剂.的体外拮抗活性 并比较两种拮抗剂的拮抗作用。 .材料与方法 ..材料 ... 南方医科大学生物技术学院生物治疗研究所研制中国广州。利用二氢叶 酸还原酶选择性氨苄青霉素标记,在中国仓鼠细胞中表达,然后 在含无血清培养基的生物反应器中进行悬浮式培养。天后收集样品。利用蛋 白 亲和层析及离子交换技术纯化.,法进行定量。 博士学位论文 ... ’’‘ 上海中信国健药业股份有限公司生产中国上海,规格为. /支。 ... 细胞培养基: 干粉一袋.,加三蒸水约,充分搅拌溶解,加入 /、谷氨酰胺 /、 /、 巯基乙醇,最后补 充容量至,调至.,.滤膜抽滤除菌后分装,于。储存备 用简称不完全培养液。临用时加入青霉素和链霉素使其终浓度分别为/ 和/,加入%胎牛血清即为完全培养液。 ...重组小鼠肿瘤坏死因子. 【购自美国公, ,,,用稀 释至×/浓度,小量分装并置。贮存;小鼠单克隆抗体购 自公, ,。 ...主要溶液及其配置: 细胞洗涤用溶液:. ,. ,. ,. ,加水至,高压灭菌后于。储存备用。 .%胰酶 .%台酚蓝 溶液:台酚蓝又名曲利苯蓝,用生理盐水配制重 量比为.%的溶液。 ,二甲基噻唑一一,.二苯基四氮唑溴盐溶液, / 称取 .克,溶于 的.~.或无酚红的培养基中,用 . 滤膜过滤以除去溶液里的细菌,铝箔纸包住,放避光保存。 二甲基亚砜分析纯,天津富宇精细化工有限公司 放线菌素 放线菌素溶解于无水乙醇中,用不含小牛血清的培养液 稀释至 /并分装贮存。 碳酸盐包被缓冲液. 精确称取碳酸钠.、碳酸氢钠.,加双蒸水溶解,第一章.体外拮抗活性实验 定容至,并调至.。 封闭液 溶液。 称取牛血清白蛋刍,溶于 显色终止液 量取.浓硫酸加水至即可。 .%吐温.磷酸盐缓冲液 称取磷酸氢二钠水合物.、磷酸二氢钾 .,加双蒸水溶解,调至..,定容至升。 ...主要耗材: 孔细胞培养板、细胞培养瓶、细胞冻存管、塑料刻度离心管 公司。 ...主要仪器设备: 超净工作台苏州.;自动高压蒸汽灭菌锅 , ;二氧化碳培养箱;多功能酶标仪 水平离心机德国;.。 .公司美国; 超低温冰箱砸美国;倒置显微镜公司;。细胞贮存罐 美国。 ..实验方法: ... 细胞毒性实验 ....细胞复苏及种板 从保存罐取出冻存管放入。温水中,并轻轻摇动令其内容物尽快融化; 从。温水中取出冻存管,经%乙醇消毒后开启。用吸管吸出细胞悬液, 注入离心管并滴加倍量完全培养液。混合后低速离心 分钟,弃上清,再重复用培养液洗涤次; 用培养液适当稀释后接种至培养瓶,放入%培养箱静置培养, 次日换液后继续培养。 将已培养好的细胞经.%胰酶消化,并经培养液洗涤。 博士学位论文 细胞计数及细胞活力检测: 细胞悬液与/体积的.%台酚蓝染液混合,于血球计数板上计数板上角 上四个大方格总细胞数,总细胞数的四分之一数乘以即为每毫升浓度;死的 细胞可着色台盼蓝,活的不着色,计数个细胞,计算活细胞百分率活细 胞率%活细胞数/总细胞数×%。 将细胞悬液密度调至 /,然后悬空加入孔板中,每孔,%、 。 。培养~ .... .、、 稀释 液 取. ?./溶液、 /、 × /至预先备好的培养液中【稀释后各自浓度分别为/、 ./、 /,反复颠倒混匀; 液 吸取细胞培养液,另外加入×/ 、 / ,配成含:、:的样品稀释液,以备稀释 ,; 样品稀释 取支. 液加 管,分别加入?准备好的液。然后取? 入第一管,充分摇匀,然后从中吸取 加入第二管。以此连续稀释:至第 五管,最后样品浓度为. /。阳性对照用取代; ....加样 取已连续稀释好的样品液加入刚吸去培养上清的细胞孔内,每孔 ;阴性对照孔加液 ?,不摇,。、%培养 ;空白孔不含 细胞只加%培养液;双复孔。 : ....作用~ 后各孔加入 ,继续相同条件培养~ ....小心吸去孔内培养上清,倒置于吸水纸上,然后加入 ?,轻摇。酶标仪波长扫描,读取光密度值。 第一章体外拮抗活性实验 .... 细胞杀伤率【阴性孔.样品孔/性孔×% ... 体外..复合物测定实验 包被. ; 取 . /,溶于包被液加入孔板内,。 .%吐温.,下同洗涤次,吸干后加入经倍稀释的样品液,阳 。 性对照为.,阴性对照为,?反应 洗涤次,吸干后加入稀释好的辣根过氧化物酶标记的抗人 。 ,轻微振荡秒,。孵育. : 显色液,。放置。 洗涤次,拍干,加入 加入 终止液,轻微振荡混匀,避光。 于经酶标仪扫描,读取值。结果以对样品稀释度作图。 ...统计学方法 。方差齐时,采用 实验结果以?表示,组间比较用? 方法进行组间多重比较;方差不齐时,采用 法。用统计软 件.进行分析,以.定为差异有统计学意义。 .结果 .. .比.具有更强的拮抗能力 细胞毒性实验结果显示,无论是阳性对照品.还是 ?均表现出明显的剂量依赖性活性拮抗作用图.。另外从此 图也看出,在一定的浓度范围内.~. .的拮抗作用明显高 于阳性对照,两者差异具有统计学意义尸.。另一方面,为进一步证实 .对的拮抗作用,体外用包被孔板,加样品后用 标记的抗人检测抗体检测。受体.配体复合物形成实验结果表明,两种 拮抗剂都能结合已包被与孔板的重组小鼠,并随样品稀释梯度而变化 图.。而且,图.显示在所测定的稀释浓度下 .组 的值高于.组,组间差异有统计学意义.,.。博士学位论文 表.不同浓度下两种拮抗剂活性比较 呵 表体外?/..复合物测定 ? /? 第一章.体外拮抗活性实验 一基:一皇’己、, 鲫姗加砷鲫柏鲫加阳? . . . . .图 .体外拮抗作用。.拮抗诱导的细胞 组,‘??组差异具 毒作用。体外..形成实验。“ 有统计学意义,.。. ?. .、 . , 幸 .. . .讨论 细胞毒性实验最早用于观察细胞毒作用【?,近些年常用来评价 拮抗剂的拮抗活性作用【,。有文献报道,体外实验中通过片段二聚化的 拮抗剂/.比游离型具有更强的捕获、结合的能力 ,而游离型贝只能以单价方式结合。目前已探明使用. 而不使用原因主要有:.结合后能增加其血清半衰期; 提高抗原结合价;有利于表达产物的纯化,比如蛋白亲和层析【。而 ?蛋白由?和两部分构成一种异二聚体【】。其中为全 长脂联素蛋白的末端的一种球状结构【,天然情况下具有形成同源三聚体的 特 征【。因此,从这点看,.能更强地结合、拮抗包括游离型和 膜结合型。从本实验结果看,.在测试的浓度范围内.~. , 其拮抗活性明显高于依那西普尸.,表.、图.。且随后的体外受 体.配体复合物形成实验也进一步验证上述结论.,表.、图.勘。基于 博士学位论文 这一发现,有理由进一步观察该融合蛋白体内拮抗活性及其对相关性疾 病的治疗作用。第二章.对/诱导的急性肝损伤治疗研究 第二章.对/诱导的 急性肝损伤治疗研究 是一种多能性细胞因子,主要以分子量 的跨模型蛋白形式存在体 内,经转化酶作用后裂解为游离型 并形成同源三聚体以发挥生物活 性【。属于肿瘤坏死因子超家族成员之一,在机体淋巴组织生成、发展及 宿主抵抗一些细菌感染时起重要的自我稳定作用。由于能启动机体针对局部 损伤的应答反应,因此,也有机体“防火墙一别称【?。组织浓度低时, 一般认为其起保护作用比如放大机体对微生物感染的抵抗作用;而高浓度时 则能导致过度的炎症反应甚至器官损伤。与许多疾病的发生发展有密切关 系,比如细菌感染所致内毒素血症或休克、人类类风湿关节炎及克莱恩病等 免 疫炎症性疾病‘’。很多研究表明,诱导的肝损伤过程中表达过量很明 显,而利用抗体或抗血清中和后则能减轻诱导的急性肝损伤作用 】。因此,调节表达或拮抗已逐渐成为临床治疗相关疾病的新方向。 经结合跨模型受体和后激活受体胞内端的下游信号活 化途径‘。。基于此原理,已有诸多研究试图用作治疗一些自身免疫疾病的靶 点。有研究显示,一些%自身免疫性疾病经拮抗剂治疗后其改善程度仅 达%,所以有必要进一步开发新的拮抗方法。 脂联素主要由体内一些分化脂肪细胞所分泌的一种蛋白,由端非 同源结构域、中段的胶原样结构域及末端的【】,其天然情况下具有 形成同源三聚体的趋势【,,且其三维结构与源三聚体相似,尽管各自的 序列不具同源性。利用这一特点,我们通过基因重组方式构建成功一种由端 结构域和端组成的融合蛋白.,并经实验证实其 能捕获、中和。本研究将通过/诱导的急性肝损伤动物模型进一 步考察.体内拮抗活性及对的治疗效果,同时与依那西普比 较。该模型的构建目前已是很成熟】,通过给实验动物联合注射和博士学位 论文 导致急性肝损伤作用,主要表现为早起的细胞凋亡及随后的出血性肝损伤、 炎 症及坏死直至死亡【。 .材料与方法 ..材料 实验样品及主要试剂 氨基半乳糖,、脂多糖,购白美国公司 ; 依那西普.购自上海中信国健药业股份公司中国上海, ./支,.由本课题组研发,并经蛋白亲和层析及离子交换 层析纯化,所有试剂均经法内毒素检测实验,内毒素. /孙鼠 单克隆抗体.、小鼠脂联素单抗均购自美国公司;显 色剂、放线菌素、均购自公司美国;见上一实验材 料部分;小牛血清、细胞消化用.%胰酶均购白公司;细胞消化物裂 解液、蛋白酶抑制剂、鼠源.单抗购自瑞士 .瑞士;小鼠抗体、羊抗鼠二抗、羊抗兔抗体 均购自,,公司甲醇、二甲苯、无水乙醇、甲醛、均购自 广州化学试剂厂中国广州;石蜡、苏木素、伊红购自公, ,。 细胞株和动物 小鼠成纤维细胞由本实验室提供南方医科大学生物治疗研究所,中 国广州;级/雌性小鼠周龄购自南方医科大学实验动 物中心。 主要溶液 无菌溶液×;蛋白电泳缓冲液×:碱.、甘 氨酸、,定容至;:、.、、 一.“溶解于双蒸水,调节值至.~.,并最终定容至; 电泳转移液:甘氨酸.、碱.、.,加入甲第二章.对/诱导的急性肝损伤治疗研 究 醇,加水至,调节值至.~.。 检测试剂盒 谷丙转氨酶检测试剂盒、谷草转氨酶试剂盒均购自南京建成生物技术研究 所中国南京; 试剂盒购自上海依科赛生物制品有限公司 .;蛋白定量试剂盒、细胞凋亡原位检测试剂盒、 显色试剂盒购自南京凯基生物; 主要仪器设备 二氧化碳培养箱、电子天平公司,,斯洛伐克 共和国;紫外分光光度计,公司日本;恒温摇床;生物 安全柜;.。超低温冰箱,美国;低温超速离心机;台式离心 机;扫描仪,日本;型显微摄像系统,日本 数码相机,日本。 ..方法 动物处理 保护率实验 经隔夜禁食的/雌性小鼠只随机平均分为四组即正常组组、 /组、/?组组、/?组 组。除组外,其余三组均接受. /.复合液腹腔 注射,每组只动物分别立即注射.治疗液或, 岭,溶于无菌液,模型组注射等体积无菌;每组另外只小鼠于 造模后进行治疗同上。治疗后开始仔细观察各组实验小鼠的生存情况,直 至治疗后。 ? 抗治疗机制研究 经隔夜禁食的/雌性小鼠只随机平均分为四组即正常组组、 /组、/对组组、/?组 组。除组外,其余三组均接受. /. 混合液腹腔 注射,每组只动物分别立即注射. 治疗液?或, 博士学位论文 ,溶于无菌液,模型组注射等体积无菌;每组另外只小鼠于造 模后进行治疗同上。分别于治疗后、各组采集只小鼠血液眼球采血 约,经离心分钟分离血清,小量分装置.?低温贮存备用。另 外,于第二次采血后处死,开腹后经拍照后称量肝脏州,随后立即剪取相同 部位部分肝脏州组织进行 %甲醛固定用于?染色观察组织病理学变化; 部分肝脏组织置于.?低温冻存以备 之用。 肝脏指数测定 第二次采血后立即开腹观察肝脏的肿胀情况并用数码相机拍照后在电子天 平上称重,结果以肝重指数表示肝脏/体重。 血清指标检测 血清肝功能酶学测定 利用试剂盒分别比色法检测血清和,具体过程如下: 第一步取待测血清样本加入已经。预温的基质液中?,对照管不 加样品,混匀后?水浴; 第二步各管加入,一二硝基苯肼液“,对照管加入,血清无溶血混匀 后置?水浴; 第三步向各管加入./氢氧化钠液“; 第四步室温放置,,光径,以蒸馏水调零,测各管值; 第五步以绝对测定管一对照管值,查标准曲线,通过拟合公式求 得相应的或活力单位/。 ? 血清定量及活性测定 血清含量由试剂盒检钡 .上海中国: 从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条; 留空白孔; 分别将标本或不同浓度标准品加入相应孔中./孑,用封板胶封住反应 孔,?呼育; 提前制备生物素化抗体工作液;章.对/诱导的急性肝损伤治疗研究 用稀释好的专用洗涤液:洗板次; 除空白孔外,加入生物素化的抗体工作液“/孔。用封板胶纸封住反应孔, ?孵育: 提前制备酶结合物工作液,室温避光放置; 洗板次; 除空白孔外,加入酶结合物工作液?/孔。用封板胶纸封住反应孔, ?呼育; 洗板次; 加入显色底物包括空白孔“/孔,。孵育; 加入显色终止液包括空白孔?/孔,混匀后立即测量值内。 结果判断每个标准品和样品的值减去空白孔值。以标准品浓度 作横坐标,值作纵坐标,以平滑线连接各标准品的坐标点。通过样品的 值可在标准曲线上查出其相应浓度/并乘以相应的稀释倍数。 活性测定具体步骤如下: 取对数生长期的细胞,以.%胰蛋白酶消化用培养液调整细胞浓度 至×/; 取孔培养板,每孔加入细胞悬液,置。,%温箱孵育; 稀释待测样品:,稀释见体外实验方法部分,吸去细胞培养上清,每 孔分别加入“稀释样品; ,并设空白对照组; 各设双复孔,阴性对照孔样品稀释液含/ ?下培养; 。 直接于每;入 “ /,。下孵育 小心吸去上清,每孑;入 ,混匀,酶标仪处测量各孔的 值; 结果以细胞杀伤率表示见体外实验方法部分。 ?血清..复合物测定 包被.
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