HSV1tk肺腺癌报告基因显像与自杀基因治疗研究基础

HSV1tk肺腺癌基因显像与自杀基因治疗研究基础 一 分类号: 学校代码: 密 级: 学 号: 学位类别: 科学学位’, 专业学位 学科门类:医学 又肄酱科矢母 ◎ 硕士学位论文 ’ 论文题目:.肺腺癌报告基因显像与自杀基因 治疗的研究基础 一 一级学科:公共卫生与预防医学 、 二级学科:卫生毒理学 论文作者:陈鹏 指导教师:杨昆 导师组成员:徐文贵于津浦 天津医科大学研究生院 二。一一年五月?缪』一 学校代码: 分类号: 密 级: 科学学位? 专业学位 学位类别: 天蚌酱科垮 挂 鞫丫 ◎ 硕士学位论文 ’论文题目:.肺腺癌报告基因显像与自杀基因 治疗的研究基础 : 一 一级学科:预防医学 二级学科:卫生毒理学 论文作者:陈鹏 指导教师:杨昆 导师组成员:徐文贵于津浦 天津医科大学研究生院 二。一一年五月创性声明 我个人在导师指导下独立进行研 别加以标注引用的内容和致谢的 或集体已经发表或撰写过的研究 所做的任何贡献均已在论文中作 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文 的规定,即:学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索,并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅 和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文,并编入有关数据 库。 保密 口,在??年解密后适用本授权书。 本论文属于 , 不保密囱 请在以上方框内打“?” 作者签名:色嗵日期: 乩钙叩 年月日 导师签名:扭最日期:之一, 放化疗 癌治疗 的研究热点之一,其中自杀基因治疗被认为是最有应用前景的基因 ‘ 治疗方法。 目前,诸多治疗基因中单纯疱疹病毒胸苷激酶.基因研究最多,是最 具前景的具有催化放射性核素的“自杀基因”。此外,.还兼具报告 基因功能,故建立携带基因的肺腺癌裸鼠动物模型后,可在活体状态下能表 达胸苷激酶。 、、等标记的核苷类似物作为底物进行反应后通过 显像实时监测.自杀基因在靶细胞内的表达情况,为今后进一步深 入研究肺癌的自杀基因治疗研究和监测奠定基础。同时,也可以为下一步进行 双报告基因报告显像跟踪监测骨髓问充质干细胞的活体修复等作奠定可行性 基础。 内容 将外源自杀基因特异地导入肿瘤细胞内并在靶细胞内高效且稳定的表达是 能否成功基因治疗肿瘤的关键。对患者体内的自杀基因分布转导情况和治疗状 态进行实时检测分析也是整个治疗过程中不可或缺的部分。故本研究拟在『期 研究的基础上利用逆转录病毒载体介导.自杀基因兼报告基因转染肺腺 癌细胞,经筛选阳性转导细胞,再利用稀释法单克隆建立一种能稳定表 达.基因肺腺癌细胞株.,观察其与正常细胞的形态和生长 状念的区别。建立能在活体内长期、稳定、高效表达.基因的肺腺癌裸 鼠动物模型。 方法 、酶切位点的.全基因片段, 利用分子克隆技术扩增带 插入逆转录病毒载体?一一中,与表达质粒和表达 .. 质粒.幂用脂质体法转染包装细胞,形成? 重组报告基因假病毒颗粒,然后用其转染肺癌细胞,经 筛选阳性表 达,再经有限稀释法单克隆获得稳定表达株,检测证实.细胞的天泮医科人学 硕学何论文 外源.基因在水平的稳定表达。通过长时间的传代培养进行细胞 的生长、形态观察并绘制细胞生长曲线。将克隆细胞株种瘤于裸鼠后,比较 下 常瘤和.瘤两者之州的生长差异,取动物模型的成瘤做检 测到?基因的表达。 . 结 果 重组质粒.....经过酶切、测序鉴定证明与 基因库公布的.基因序:完全一致。并与?表达质粒 和表达质粒.通过包装细胞制备成感染性假病毒颗粒。 经抗生素阳性筛选及有限稀释单克隆法培养出含.基因的单 克隆细胞株,检测证实外源基因.成功导入细胞。 比较.细胞株和萨常两者的生长及形态特征并绘制细胞生长 曲线,结果发现两种细胞的外形基本一致,生长特征也无明显差别胗.。 .细胞株和细胞的成瘤率均为%。比较了两种细胞肿瘤的 生长特征,发现正常瘤和.瘤两者之间的肿瘤的生长大小并无明显 差异扮.。三次传代后经检测表明,成功建立了能稳定高效表达 .基因的动物模型。 结论 重组质粒.....能在肺腺癌细胞进行正确的翻译表 达。 外源摹因.在成功制备的.细胞株中可被长期稳定表达。 外源基因.的导入并没有影响到细胞的正常生理功能和形态。 外源.报告基因导入细胞后对肿瘤的生长状况无明显影响。 本实验成功建立了能稳定高效表达.基因的动物模型。 关键词:肺腺癌;质粒重构;逆转录病毒;.;. . ,. . , 一 ” ,一 . ?. , , ’‘, ,. . ? ., 、 . , . . 一 , .,。 .,, . 一 .一一?., . 一. ,. ,一 , 一 一 ? 酉:? ., 一 胗. 一一%, . 大津医科人学硕斗:学位论文一胗. . , 一??.? .一 . , . . ; ; : ; ;? 符号说明??? 前言 日舌?”??。 研究现状、成果研究目的、方法一、部分重组质粒?一。..的构建及逆转录 病毒包装 . 材料? ..药品与试剂 ..仪器设备? ..溶液及配制 .方法..重组质市.....的构建? ...设计.基冈全序列引物? ...质粒的细菌扩增及提取 ... 扩增.基因片段并引入相应酶切位点 ...纯化获得的目的基因片段.? ... 一基因片段与.载体连接 ...连接质粒的扩增、提取及鉴定? ...连接质粒/载体...提取、纯化...重组质粒.....的构建..逆转录病毒的 包装...包装细胞的培养、扩增...重组质粒.....的逆转录病毒包装 ...逆转录病毒基冈组鉴定 .结果?. ..重组质粒.....的构建... .基凶片段的扩增 ... .基因片段与.载体连接 大津医科人学硕:学何论文 ... .摹凶片段与载体...的连接..重组逆转录病毒基因组鉴定? .讨论??; .小结? 二、.基凶转染细胞及.单克隆细胞株建立 .材料? ..药品与试剂..仪器设备 ..溶液及配制? .方法? ..肺腺癌细胞的培养... 细胞的复苏、培养? ... 细胞传代扩增 ...细胞计数? .:. 细胞的冻存? .:逆转录病毒感染细胞? ... 对细胞最适浓度的确定...逆转录病毒感染细胞及筛选阳性表达细胞 ...阳性表达.基因的细胞克隆团的鉴定..单克隆细胞株的建立? ...有限稀释单克隆法培养阳性表达.的细胞 ...稳定表达.基因的.细胞株鉴定? ... 细胞与.细胞形态观察及生长特性测定? .结果? .. 细胞的培养 ...讵常细胞的培养... 筛选的最适浓度确定 ..转染细胞 .. 一单克隆细胞株培养? ... .细胞单克隆株的建立... .单克隆株中基因表达的鉴定? 创新性与不足? 参考文献发表论文和参加科研情况说明综述 综述参考文献致谢? 大津侈科人学硕十学位沦文 缩略语/符号说明 氨苄青霉素连接子 双蒸去离子水 二乙基焦碳酸酯 . ’改良培养基 二甲基亚砜 . 二甲基甲酰胺 乙二胺四乙酸 胎牛血清丙氧鸟苷 . 单纯疱疹病毒一一型. 胸苷激酶基因半乳糖苷 异丙基硫代 间充质干细胞. . 阳离子脂质体转染试剂 ? 光密度磷酸盐缓冲液 聚合酶链式反应 正电子发射断层成像反转录 十二烷基硫酸钠放射性核素发射式计算机断层显像 .. 四溴乙烷 一一?? .溴..氯一.口引哚一一.半乳糖 . 苷 水泡性口炎病毒天津医科人学硕学位 刖 吾 研究现状、成果 肺癌目危害目前,肺癌依然是导致人类癌死亡的首位疾病,且发病率 仍有明显升高的趋势,全球每年因肺癌死亡人数已超过万,其中%% 的患者为非小细胞肺癌 。我国肺癌发病率在城 市中占常见恶性肿瘤的首位,在农村为第三位。随着肺癌发病率的不断增长,其 病理组织学类型分布也在发生明显改变,肺腺癌的增加已成为世界性倾向。其 发病率由六十年代的%上升到.%川。肺腺癌 大多 起源于较小的支气管粘膜分泌粘液的上皮细胞,主要位于肺的周围部分,呈球 形肿块,靠近胸膜,在各类肺癌中约占%~%。肺腺癌是肺癌中比较常见 的亚型,女性病人较为多见,发病年龄亦较小近年来男性亦有增多的趋势。 肺腺癌富含血管,故局部浸润和血行转移较鳞癌早。易转移至肝、脑和骨,更 易累及胸膜而引起胸腔积液。其中以不吸烟者及妇女多发病且易发生淋巴结转 移。 肺癌的治疗 目前肺腺癌的治疗,包括常规的手术、化疗、放疗、联合 生物治疗、中医中药治疗、中西医结合治疗等方法由于早期诊断较为困难,故 总体临床治疗效果较差,全身毒性反应【】和术后局部复发也明显增加,并且年 生存率仍低于%。有研究表明肺癌的发生、发展和转移是一个极其复杂的多 基因调控异常的过程【州。许多如化学、放射性、病毒等致肺癌因素,都可通过激 活原癌基因和使抑癌基因失活,导致细胞转化和癌变形成肿瘤。近年,随着分 子生物学技术的发展,肿瘤基因治疗成为可能。基因治疗可被认为是将正常有功 能的基因置换或增/补缺陷基因的方法,而从广义的角度来看,凡是将新的遗传 物质转移到某个体内使其获得治疗效果的方法,均可认为是基因治疗?】。 自杀基因.的肿瘤治疗 目前肿瘤基因治疗发展异常迅速,方法 主要包括抑制致癌基因、激活肿瘤抑制基因、诱导肿瘤细胞凋亡或者利用自杀 基因治疗。其中自杀基因/前体药物体系则是研究的热点之一,将自杀基因 或称药物敏感基因 转染肿瘤细胞后再利用 无毒或低毒性前体药物在肿瘤细胞内代谢产生毒性物质从而杀死肿瘤细胞的 “自杀基因疗法愈来愈受到人们的关注。目前,已经发现多个自杀基因,其 中研究最多的是基因。年?】首次将/系统用有效地杀伤 肿瘤细胞【。近年,美国已正式批准./自杀基因系统进入 期临床试验研究,被应用于如脑胶质瘤、卵巢癌、黑色素瘤、前列腺瘤等多种 、肺癌【】、 肿瘤的临床试验阶段。国内它的应用已先后遍及肝癌】,前列腺癌【 卵巢癌【嘲、乳腺癌【、恶性胶质瘤【等多种肿瘤并开始建立部分肿瘤动物模型 【】。单纯疱疹病毒胸苷激酶.基因已成为肿瘤基因治疗中最具前景的 “自杀基因。此外.基因转导的肿瘤细胞被等药物杀死时,与其 邻近的未被?基因转导的瘤细胞也同时被杀死从而扩大了杀伤效果,这 种现象称为“旁观者效应”。但是其作用机制尚不十分清楚,有待进一步深入研 究。 .的报告基因作用哺乳动物的真核细胞内胸苷激酶只特异性催 化胸腺嘧啶核菅磷酸化,而单纯疱疹病毒胸苷激酶可将多种核苷结构类似物磷 、?和等标记的核苷类似物被摄入 酸化。外源性放射性核素如?、 磷酸核苷很难 细胞后,被一磷酸化成’磷酸核苷,而被放射性标记的 穿出细胞膜,滞留在被转染细胞中,故此可根据核素种类选择丫.照相机、 或进行定量显像被放射性标记的 磷酸核苷在细胞内的聚集程度来反映外 源导入的.基因表达程度和酶的活性。目前.显像底物的核苷类 似物有、、和,这些底物在对一的特异性、体 内稳定性和标记率以及敏感性等方面各有优劣势。近年来.的报告基因 功能也越来越受到诸多研究者的重视,【等用’标记的对转染了 .基因的.细胞进行显像成功。张斌青掣】利用腺病毒载体 携带.报告基因转染后进行.摄取显像研究。 研究目的、方法 现今肺癌的发病率和死亡率增长迅速,已成为人类癌症死亡的主要原因之 一。而其中肺腺癌的增加尤为明显。对于肺腺癌发病时多为中晚期患者,手 术 治疗和药物治疗效果不佳,放化疗的总体临床疗效比较差,如增加药物剂量, 全身毒性反应也明显增加,且易出现局部复发及远处转移,疗效较差,其年 生存率仅为%。所以寻求更有效的治疗药物和方法具有深远意义。肺癌的基 因治疗是目前肺癌治疗的重要课题之一,其中自杀基因治疗约占恶 性肿瘤基因治疗的%.被认为是最有应用前景的基因治疗方法【引。“自杀基 因疗天津医科人学硕十学位 法作为一种很有效的肿瘤药物敏感基因疗法,利用逆转录病毒载体将. 基因导入人肺癌细胞,筛选稳定的阳性转染细胞株,单个细胞克隆形成高纯 度 的携带.基因亚克隆细胞株。可用于后期观察丙氨基鸟苷或者阿 昔洛韦对转导基因的人肺癌细胞的杀伤作用及旁观者效应。或 者将克隆细胞株种瘤于裸鼠建立携带.基因的肺癌动物模型用于动物体 内相关实验。 此外,.还兼具报告基因功能,自杀基因在导入目的肿瘤细胞之后 能否在靶细胞内高效、稳定的表达出具有活性的酶是整个肿瘤治疗的关键。 鉴 于.本身就可以作为报告基囚能将其他自杀基因或者其本身在活体内的 表达情况进行显像及疗效监测。这样可在活体状态下摄入一定量的外源性 放射性核素如、 、?等标记的核苷类似物做底物被?基因表达 的胸苷激酶体内修饰反应后通过显像就能实时监测自杀基因在靶细胞 内的表达情况为不展有效的基因治疗提供客观依据【。 故本研究在前期研究的基础上利用逆转录病毒载体介导.自杀基因 兼报告基因转染肺腺癌细胞,经过筛选阳性转导细胞,再利用有限 稀释法单克隆建立稳定表达.基因肺腺癌细胞株.,观察其于正常 细胞的形态和生长状态的区别。建立携带伙基因的肺腺癌裸鼠动物模型, . 检测伙基因是否能稳定长期表达于活体内。为今后进一步深入研究肺癌的自 杀 基因治疗研究和监测奠定基础。同时,也可以为下一步进行双报告基因报告 显 像跟踪监测骨髓间充质干细胞的活体修复奠定可行性基础。 .肺腺癌报告基因显像与自杀基因治疗的研究基础 ..的构建 一、重组质粒.. 及逆转录病毒包装 .实验材料 ..主要药品与试剂 鼎国生物技术有限公司 二甲基哑砜、 聚合酶、连接酶、 公司 及及、 逆转录病毒试剂盒质粒一 、及?、 . 载体 . .、 大连宝生物工程公司 东北农业大学乳品科 质粒包含.基因宿主菌. 学教育部重点实验室 / 公司 感受态大肠杆菌工程菌株. 无内毒素大提质粒试剂盒 异丙基硫代...半乳糖苷、 天津伯特公司 .溴一一氯一一吲哚一..半乳糖苷 天津医科大学附属 逆转录病毒包装细胞 肿瘤医院免疫室惠赠 质粒转染试剂盒、公司 碱、琼脂糖、 公司 低糖、胰蛋白酶 胎牛血清 兰州民海公司 十二烷基硫酸钠、氢氧化钠、冰乙酸、乙酸钾天津化学试剂三厂产品,分析 纯 胰蛋白胨、酵母提取物、细菌培养用琼脂粉、 公司 枪头 氨苄青霉素、.的管和.、工 合成基因所需的引物及测序由公司完成香港 公司 超净工作台 细胞成像倒置相差显微镜 本公司 。 ..主要溶液及配制 咖氨苄青霉素,贮存液:氨苄吾霉素钠溶 于双蒸去离子水 ,中,再用调整体积至 ,经.呻滤器过滤除菌,分装.贮存。工作浓度:./。 固体培养基: 表. 固体培养基的配置成分 高压灭菌。取出后置室温冷却至约?时加入抗生素及其它需要添加的成 天津医科人学硕学位 ..的构建及逆转录病毒包装 一、重组质粒? 份,以免温度过高导致抗生素失效。以氨苄青霉素为例,其工作浓度为./, 即每培养基中加/氨苄贮存液.。摇匀后,超净台内无菌情况下, 将培养基倒入若干无菌的平皿中,培养基厚~左右一个平板,室 温放置或放置半小时同时紫外灯光照,使其固化。封口胶封边,并倒 置于保存备用。 液体培养基: 表. 液体培养基的配置成分 用 调.高压灭菌。?保存备用。 溶于 中,再用调节 溶液/: 体积至,.滤器过滤除菌,分装/管,.?保存。 .溶于甲基甲酰胺中,再用调节体 .:. 积至,.滤器过滤除菌,分装/管,铝箔纸包裹避光,.?保存。 含//.的培养板///.制备:在含有 和 ?,用无菌玻璃 的培养板表面加 / . / 涂布器均匀涂布平板表面,?放置可完全吸收,用封口胶封边,并倒置 于?保存。 碱裂解法小量提质粒溶液: ?碱裂解法质粒提取液配制 表.碱裂解法质粒提取液成分 试剂 终浓度 葡萄糖 ?. 在 溶液成批配制,每瓶约, /.高压下蒸气灭 菌分钟,贮存。 丕鎏鳖型厶堂堡?堂堡 二:重堡里塾旦型:垒:丛丝:旦兰?:蔓丝丝建垄望堑茎堕查鱼鏊 ?碱裂解法质粒提取液配制: 表.碱裂解法质粒提取液成分 试剂 终浓度 . % 用前等体积混合/ ,% ,加水定容至 ?碱裂解法质粒提取液配制方案 表.碱裂解法质粒提取液成分 试剂 用量 乙酸钾 冰乙酸 . 去离子水定容至 ?配制方案 表. 溶液的配制成分 试剂 终浓度 ’,.?. :无酶的酶,通常预先配制成含 酶的无菌标记为使用。 上/ ,:在:水中 磷酸盐缓冲溶液 溶解 、. 、. 和. ,用调解溶液的 值至.,加水定容至,在 .高压下蒸汽灭菌分钟。 室温保存。 仃 .%胺四乙酸明 ,:. 溶于 中,. 滤器过滤除菌,分装后.?保存。 .实验方法和步骤 ..重组质粒?.的构建 ...设计..基因全序列引物 根据基因库公布的.基因序列百:,.设计软 件设计引物,克隆..基因全长: 天津医科人学硕十学位 一、重组质粒的构建及逆转录病毒包装 上游引物? :’??鱼? 王’,含有魄,的 酶切位点划线部分和启始密码子; 下游引物.墩:广.’,含有 的酶切位点划线部分和终止密码子。 引物的处理:离/,按照引物合成报告单说明,用适 量水溶解至上/贮存浓度,再稀释至/使用浓度。 ...质粒的细菌扩增及提取碱裂解法‘。 取无菌的试管,入含的液体培养基./。 含质粒的宿主菌. 菌液“培养基中,稍拧紧 管口,需留一定的空隙透气,恒温摇床振摇。 取:菌液加入一灭菌管中加盖,低温高速离心机、 离,剩余的细菌培养物于贮存。弃培养基,尽可能干燥细菌 沉淀。 用事『冰预冷的溶液重悬细菌沉淀,震荡混匀。 加现时配制的溶液,盖紧管口,快速颠倒艚次,混合 溶液后静置于冰上。 加用冰预冷的溶液,盖紧管口,将艏倒置后温和地振 荡数次混匀溶液,冰上静置,形成白色絮状沉淀。 ?、 离,将上清转移至另一灭菌借中。 加等量酚:氯仿:,即各“,加盖,漩涡振荡机混匀。 、离,将上清转移到另一灭菌艏中。 加等体积的异丙醇,加盖,漩涡振荡机混合,室温静置,充分沉 淀核酸。之后?、离心,回收核酸。 小心倒掉上清液,将借倒置于一吸水纸巾上,以使所有液体 流尽,再将附于管壁的液滴吸尽。 室温下用 %乙醇洗涤沉淀,加盖颠倒管数次,、 离一,回收核酸。 小心吸去上清,室温静置~使最后残存的痕量乙醇挥发。 用.经。热的重新溶解核酸?,微量于琼脂糖凝胶电 泳鉴定,其余.保存。... 扩增.基因片段并引入相应酶切位点 和.做为引物,利用高保 以质粒为,用 真聚合酶进行反应获得两端均为平末端的.基因片段。 反应体系,如下: 管中建立 表. .基因的扩增反应体系 加入量 加入成分. . . 模板. 方案 ?解链预变性 ’个循环 /\ ?卜?退火 ’ ?延伸 土 ? 取上行琼脂糖凝胶电泳分析,余保存。纯化获得的目的基因片段. / 磁试剂盒回收.片段 应 紫外灯下用手术刀片将带有目的基因片段.的凝胶琼脂糖亮带切 下来,置于. 艏中含胶量越少越好,切胶越快越好以减少紫外 线对损伤,加入一倍体积的溶液先经力热溶解 天津医科人学硕学位 一、重组质粒....的构建及逆转录病毒包装 沉淀。 置于电恒温加热器中、,其间每隔轻弹管;底, 直至凝胶完全溶解,放置室温冷却。 将溶解的/混合液.离心吸附柱,室温下、 离二,弃滤过的废液。每次过柱最大为.,量多可分几次过柱将 ;入离心吸附 柱,室温下、离二, 弃滤过的废液。再重复漂洗一次。 事先已按比例加入无水乙醇 取出吸附柱在 室温下、开盖离,以彻底去掉乙醇残留。 室温倒置片刻,让附着在柱上的液体蒸发。 将离心吸附柱装在新的无菌艚上,向柱子中央加/.的 水或,?温育。 离二,溶液回收重洗一次离心 收集.基因片段。 . ... 载体连接 .基因片段与 .基因’术端加“” 在微量离心管中配制下列加“”反应液,全量为。 表. .基因’末端加“”反应体系 加入成分 。加入量 。条件下反应分钟,冰中静置一 一 载体连接 与 在微量离心管中配制下列连接体系.: 表. 载体连接体系 ?基因与 加入成分 加入量 一 反应液 . 上述? 吸头轻轻吹打此连接体系,使其混匀,。反应。 天津医科人学硕十学位 一、重组质粒...?的构建及逆车专录病毒包装 连接质粒的转化 . ?取上述混合连接体系.于一无菌艚中,力【 感受态中混匀,冰中静置。 ??热激后,再放置冰中~ ,勿摇晃。 预热的无抗生素液体培养基, 振摇培养 ?加入 以激活转化细菌。 ?取培养基均匀涂布于预先制备的涂有 /和 /的,/琼脂糖平板上,。培养后,出现 转化菌落。蓝白斑鉴定:下放置使蓝色充分显现,白色菌落为带有连接质 粒的克隆。 ...连接质粒的扩增、提取及鉴定 从转化后的连接质粒的琼脂糖平板中挑取个白色克隆,分别接种于 液体培养基中,摇床振摇培养.。第二同碱裂解法小量 提取质粒方法同自订...。 连接质粒的酶切鉴定 在微量离心管中配制双酶切体系如下: 表.连接质粒的双酶切反应体系 加入量 加入成分 夏 连接质粒.. ? 酶切,之后?下终止反应。%琼脂糖凝胶电泳,观察 酶切结果。 酶切初步鉴定正确者命名为./质粒,取菌液经测序鉴定。 测序./质粒使用通用引物: 上游引物 .: 不不 .:门 下游引物天津医科人学硕十学位 一、重组质粒..的构建及逆转录病毒包装 的提取、纯化 ...连接质粒 ./和逆转录载体? 应用大提质粒试剂盒提取质粒并纯化 ?取质粒菌液.,各分别接种于 ./培养基 两个质粒分别进行提取,同时进行。 中,于摇床振荡培养, ?取菌液分装入一个收集管中,大型台式低温超速离心机室温下 、收集细菌菌液较多时可分多次离心收集于同一收集管中。尽量 弃除培养基,并用吸水纸吸取管壁上的水珠使细菌沉淀尽可能干燥。 ?每菌液溶液, 用移液器或漩涡震荡器彻底悬浮细菌混 匀。 如末彻底混匀菌块会影响裂解,导致提取量和纯度下降 ?每菌液溶液,温和地上下翻转乱次混匀,室温静置 。不能剧烈震荡 ?每 菌液溶液,温和地上下翻转乱次混匀,此时会出现 白色沉淀,室温放置。加入时要边摇边加混匀,避免产生局部沉淀 ?室温、、?,将溶液全部倒入过滤器中,慢慢推动柄 过滤,滤液收集于一个干净无菌的离心管中。加压时不可太过用力,液 体过多可延长过滤时间 ?向吸附柱中加入经过?预热的平衡液吸附柱放入 收集管中 、弃废液。 ?往离心管的溶液中加入.倍体积的异丙醇混匀,移液器加入 中室温、、弃收集管中的废液。吸附柱最大容积,溶液多可分 次离心收集于同一吸附柱中 ?向吸附柱中加入的漂洗液,、弃收集管中的废液。 ?重复第步。 向吸附柱中加入无水乙醇,室温、、弃收集管中的废液。 将吸附柱重新放回收集管中,室温、、除去漂洗液漂 洗液残留会影响后续的反应:酶切、等,离心后开盖室温放置。 将吸附柱置于一个无菌离心管中,悬空滴加洗脱液或 水,室温放置~后、、。再吸取离心管中的收集液重悬滴 加一次离心提高浓度,将液体收集于同一离心管中。 或预先加热至 ? 用分光光度仪测定核酸浓度,.?保存备用。大津医科人学硕十学位 一、重组质粒.的构建及逆转录病毒包装 乙醇、法沉淀质粒 ?溶液中加入/体积的.,再加入倍体积的无 水乙醇.?中预冷,剧烈摇晃.次,.?冻存过夜。 ?、、离心一定注意稽的外侧一直朝外小 心弃上清液。 ?%乙醇无水乙醇水配制洗沉淀,、、 离心。重复一次。 ?预热至?的水溶解沉淀,分光光度仪测定核酸浓度,.?保 存备用。 重组质粒...的构建 及分别双酶切质粒 ?/和载体一 ?两个无菌艚中分别配制下列反应体系 的双酶切反应体系 表.质粒 一/和? ?稍离心,混合,?水浴或温箱,之后?下终止反应。 ?取出,各取“琼脂糖凝胶电泳分析鉴定并切胶回收,余下备用。 / 纯化回收基因片段.及载体 ...酶切片段,方法同....。 与.基因片段连接重组 载体 ?连接反应体系的计算:.基因片段和载体? 按分子摩尔数匕:混合。丕鲨堕型厶堂堕?堂鱼 ::里绝里塾旦三旦塑:垒: 三:塑塑:奠兰?:坐盟丝蕉壁垄堑茎塑垂鱼鍪 ?取一无菌喏中配制如下连接体系: 表. ?.和.一的连接反应体系 加入成分 加入量 载体片段.. . 基因片段.. . 连接酶 山 用吸头轻轻吹打此连接体系,混匀,置于电恒温加热器中?连接过夜。 质粒连接液转化感受念.// ?取上述连接体系.于一无菌爸;中,.感受态. 感受态中混匀,冰中静置。 ,勿摇晃。 ??热激后,再放置冰中? 。预热的无抗生素液体培养基,?振摇培养 ?加入 以激活转化细菌。 ?取咀培养基均匀涂布于预先制备的琼脂糖平 板上,?培养过夜,出现转化菌落。用无菌.枪头分别挑取几个发育良好的 单个菌落中心位置少量菌先进行菌落初步鉴定。 连接质粒的菌落鉴定 于管中建立山反应体系如下: 表. .和....的连接质粒的菌落反应体系 加入成分 加入量 缓冲液 . . 上游引物. 山下游引物. 质粒菌落 . 酶./ 补足至上 产物行琼脂糖凝胶电泳分析。 方案同前....,反应结束后取“ 挑取经菌落初鉴定含目的基:一的良好单菌落数个,接种于 ‘; //液体培养基中,摇床振摇培养。碱裂解 法小量提取质粒,方法同前...。 重组质粒的酶切鉴定 方法同前....,酶切鉴定正确者命名为....。 将经双酶切鉴定的连接质粒....取样做测序鉴定。 .. 扩增、提取、纯化并浓缩质粒? 方法同前... .. 逆转录病毒的组装 ...包装细胞的培养、扩增 细胞的复苏和培养 ?取无菌离心管一支,加入含%的培养液。 ?从液氮中取出装有细胞的冻存管,将其放入?水中轻摇,待冻 存细胞冰块溶解,用酒精擦拭冻存管,打开管口,用吸管将细胞吸入含 培养液的 离心管中。 ?将离心管于常温下以离一二,小心弃掉上清,再加入 含%的培养液吹打细胞团。分装入培养瓶,置于?、% 孵箱培养,每日观察细胞,~同换液。 细胞的传代扩增 ?待培养瓶中细胞长至约‰%融合时,进行细胞传代。 ?首先用吸管吸弃培养液,加入.%的胰酶.,于?孵箱中放置 约,镜下观察细胞变圆时,加入含%的培养液。 ?吹打后吸至离心管,常温下以离一,弃上清。 ?加入%的培养液,吹打后根据细胞数分装入数个装有 %的培养液的培养瓶,?、%孵箱培养。 ..的逆转录病毒包装 ...重组质粒? 取约.个细胞种植于一个培养瓶中,加入含% 的无抗生素培养液,?,%培养,直至孔内细胞生长至%融合。 于无菌管中制备下列溶液: 溶液:稀释的重组质粒? 、.的及. 的.于无血清培养液.中,混匀。天津医科人学硕十学位 一、重组质粒.一?的构建及逆转录病毒包装 溶液:稀释“的脂质体于山的.中, 轻柔混匀,室温孵育。 . 混合、两种溶液,轻轻混匀,室温放置,同时用 洗涤细胞一次。 转染前向混合液中加入的.轻轻混合,将此稀释的复合物 覆盖于细胞之上。 在?、%孵箱中培养。 随后弃掉培养液,换成 %的 培养液,?、%孵箱中培养。 后更换 %的培养液,、%孵箱中培养。 后收集逆转录病毒上清,经.滤器过滤,分装,.保存。 ...逆转录病毒基因组鉴定 取少量包装后获得的逆转录病毒基因组作为模板,经.反应后,以 . 和. 为引物进行反应. 反应 ?于管中配制如下反应体系,置于仪中、,然后置于冰 中急冷以上。 表.逆转录病毒基因组的前反应体系 加入成分 加入量 . 补足到 ?在上述反应体系中再加入下列试剂总体系,轻柔混匀后置于 仪中?、。 表.逆转录病毒基因组的后反应体系 加入成分 加入量 上述模板~引物等的混合液“ / ? /. 。保温延长,获得链 反应 反应体系,如下: ?取两个无菌管分别配制 表.逆转录病毒基因组的反应体系 加入成分 加入量 缓冲液 “ . . 上游引物. 下游引物. 细胞提取基冈组 山 . 酶./ 补足至 方案 ?解链预变性 ? 个循环 /\ ?卜?退火 ’ ?延伸 ’ ? 取行琼脂糖凝胶电泳分析照相。 .结果 ..重组质粒...的构建 ... .基因片段的扩增 以质粒为模板,.和.为引物进行反 应扩增.基因全长,得到的.基因片段图.。 : :样的产物:样品的物 :样品的产物:样品的产物 图. .基因产物琼脂糖凝胶电泳鉴定 .. 载体连接 .基因片段与. 将扩增并纯化的基因片段经过’木端加“”后与. 载体的相应位点连接,进行双酶切鉴定图.。一的通用引物进行双向 测序鉴定,测序碱基序列进行拼接并进行了校对,正确率为%图.。 说明扩增的.基因片段碱基序列完全正确能被成功翻译表达。 : :单酶切/质粒:质粒./ ~:小提所获/质粒的、双酶切 一/双酶切的琼脂糖凝胶电泳鉴定 图.连接质粒上游引物 : 卜.游引物:?口嘲四蛐燃嘲枞一琳躺删 ,. / %,/ % / 四丁;四 粼“研 ?..四从?.; 筠 觚“?砸丁从:;玎;;矧: 嘶 从舢 从;呲. 弱 。“呲从从嗍 “? .? 虻/从 从:优从 ““ ; 删从删 删“.柚 .;删:删;×:;×矗:..啪::茁×:;’。籀湖惦从 “? “;:. 嬲从;凹 :“衄订 从麟虻 从丸 :?.从 .『 一从。?嗍 图.连接质粒一/的双向测序图谱及校对结果丕鲨堕型厶堂堕?堂笪.:里塑 堕塾旦坚型:垒丝:塑笠:坚兰?:坐笪丝壅垄鲎堑茎壅堡垒鏊 的连接 ... 墩基因与逆转录病毒载体? 扩增并纯化的.基因片段插入到逆转录病毒.载体的 相应位点,菌落初步鉴定结果图.,挑选初步鉴定含基因的 单菌落摇菌过夜经碱裂解法小提质粒后进行双酶切,产物进行.%琼脂糖凝胶 电泳鉴定图.,并少量重组质粒.一送检测序 的相应位置。 鉴定。结果证实.基因片段完全正确的插入 : ~:各个单菌落的产物 .单菌落凝胶电泳 图.重组质粒 巨孝?影:。?酒 卜’、, :驾 , ,: 蓥 霭 卜,。.‘’,,‘。? ::逆转求炳每绒体? :质粒/;:?一?/ 邕;一 :: .?双酶切凝胶电泳 图. 重组质粒?: ~:逆转录病毒基因组反应产物 图. 逆转录酶病毒基因组的。鉴定天津医科人学硕十学位 一、重组质粒....的构建及逆转录病毒包装 .讨论 年.等研究小组【】在鸟和鼠的逆转录病毒中插入并表 达了单纯疱疹病毒的基因。临床上利用病毒载体介导基因治疗项目约占 %,其中逆转录病毒载体使用最多。逆转录病毒是单正链病毒,呈圆形, 直径约 ,由拟核含、逆转录酶、壳蛋白和包膜构成。逆转 录酶负责病毒核酸的逆转录过程。病毒的感染范围由包膜蛋白决定。通过病 毒 包膜蛋白与宿主细胞表面特异性受体相互作用,使病毒颗粒进入细胞内,释 放病 毒。在逆转录酶和的一系列作用下合成双链,进入细胞核与 细胞染色体整合形成前病毒,进而表达病毒基因、合成子代毒粒。 病毒蛋白与合成的毒粒装配成完整的病毒颗粒,以芽生方式在细胞表面被 释放【。除极少数外,逆转录病毒感染细胞后可持续地产生病毒,但对细胞生长 无抑制作用,不引起细胞破裂。重组逆转录病毒载体介导单纯疱疹病毒胸苷激酶 .的肿瘤基因治疗在国内外已进行了大量实验,体内外可同时高效,大量 感染肿瘤细胞,高效转移基因和插入的外源基因以转座的方式整合,其基因组 不会发生重排的优点。而且转染的基因表达可快速、长期、稳定、高表达等特 点,并对靶细胞无任何细胞形态、细胞免疫能力、细胞繁殖能力等各方面的影响 】,可用于建立长期持续表达外源基因的细胞系。 传统的逆转录病毒载体只能感染分裂期细胞,而且转染效率较低,故为了提 高载体系统的安全性和有效性,用三个病毒穿梭质粒分别将带有目的基因的病 毒核酸序列、病毒包膜和衣壳基因导入包装细胞,通过包装细胞产生的逆转录 病毒外壳蛋白包装,分泌出既含重组又有一次性感染整合作用而无完整性 病毒复制能力的缺陷型病毒颗粒,利用该病毒颗粒将外源目的基因整合于靶 细 胞基因组中表达。利用水泡性口炎病毒 ,的 基因,编码表达的病毒包膜蛋白整合的假型逆转录病毒能加速各种宿主 细胞对其进行膜融合和内吞,具有广泛的宿主范围和更高的转染效率,并且 可识别细胞膜上的磷脂分子,实现不依赖细胞周期的静止细胞的高效地转染, 且有抵抗血清补体灭活的作用【】。此外,针对逆转录病毒有感染分裂活跃细胞 的特性,有学者建议在肿瘤局部环境中连续不断的提供载体质粒来转染周围的 肿瘤细胞, 】、王毅【等在基因治疗脑瘤的实验中建立了将肿瘤细胞与外 源性病毒生产细胞混合培养生长的模型并用于临床基因治疗中,结果显示 天津医科人学硕十学位 一、重组质粒.....的构建及逆转录病毒包装 逆转录病毒生产细胞能持续释放含治疗基因的假型病毒颗粒,使更多不同周期 的肿瘤细胞被转染。本实验所选用的是逆转录病毒试剂盒,其中含去除了野生 型病毒蛋白编码基因和的逆转录病毒载体? 、 具 表达质粒和即表达质粒.。逆转录病毒载体? 有插入外源性基因的和强的病毒启动子,不能编码病毒蛋白。留有识别外 壳蛋白的包装序列。病毒基因组的两端均为长末端重复序歹,含病毒基因 和外源基因转录所必需的启动子和增强子等。其自带的新霉素抗性基因, 能使转染的靶细胞具有筛选抗性。用含假病毒颗粒的细胞上清液感染靶细 胞,借助包膜糖蛋白能特异性结合与靶细胞膜上的受体,将外源基因整合到靶 细胞基因组,随细胞的分裂而不断传给后代。 逆转录病毒载体虽有诸多优势但其转染难点依然存在:包装后产生的病毒 滴度较低就会直接降低外源基因的转染效率。实验研究表明,逆转录病毒通过 感染细胞重装配分泌出子代逆转录病毒颗粒入介质后并再次感染其他细胞,可 提高滴度闭】。在制备含重组逆转录病毒的包装细胞上清时,细胞密度及培养温度 是影响病毒滴度的重要因素,过低或过高的细胞密度对细胞生长均不利,不能使 病毒滴度达到最佳。张惠中掣】报道在细胞培养皿中接种.个包装细胞可 .获最佳的效果。采用降低培养温度也可以提高细胞病毒滴度。有研究表明丁酸 钠可以通过活化逆转录病毒的来提高病毒滴度【】把病毒上清液进行超速 .离心,透析纯化,浓缩处理,也有可能将病毒滴度提高到较高水平。故在此实验中 待培养瓶中的细胞长至约%融合时进行细胞计数,取约.×个包装 、 细胞于瓶中进行重组逆转录病毒的包装,将逆转录病毒载体? .表达质粒和表达质粒?三个质粒用脂质法共转包装细 胞后,根据文献报道的方法【】置于、%孵箱中培养收集 上清,可获高滴度假病毒颗粒。 但该载体系统应用于临床时对人体的安全性问题还需进一步深入研究。病 毒感染靶细胞,携带目的基因与宿主细胞染色体随机整合时存在着插入突变、末 端重复序列激活邻近原癌基因转录、破坏抑癌基因【】、所用载体有污染 情况等许多危险、而且逆转录病毒携带容量较小,一般。但经过大量研究 分析发现,转移基因的突变在真核细胞发生的概率是极低的。 鉴于国外报道应用.基因治疗系统在基因治疗脑胶质瘤方面已进入 临床阶段【,在卵巢癌腹膜种植的动物实验中也取得了很好的效果【】,国内也有 大津医科人学硕十学位 一的构建及逆转录病毒包装 一、重组质粒? 通过动物膀胱癌模型,利用该基因转移系统结合抗病毒药物进行治疗,观察到抑 制肿瘤生长的报道【。故此,我们利用逆转录病毒作为介导载体重组构建了质 粒? .,并与表达质粒和表达质粒 三个质粒用脂质法共转包装细胞通过重新组装、分泌形成缺陷 型病毒感染颗粒,转染外源.【报告兼自杀基因进入肺腺癌细胞。 天津医科人学硕十学位 ..的构建及逆转录病毒包装 一、重组质粒? 小 结 为载体,重组构建含有 本部分实验主要是以穿梭质粒? .报告兼自杀基因的逆转录病毒....。并利用细 胞加以包被组装分泌形成感染颗粒。 ..经双酶切电泳、基因测序、校 重组质粒? 对证实与基因库公布的.基因序:完全一 致,表明本研究所使用的外源基因序列能进行下确的翻译表达,重组质 粒构建成功。 根据文献报道的方法本实验利用能表达包膜蛋白的表达质粒 ?一, :表达质粒?包装重组质粒? 经细胞分泌出具有感染能力的假病毒颗粒。 本部分研究结果为进一步转染细胞及建立单克隆细胞株奠定了基 ’ 础。