小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定

小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定 小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定 实验组员: 史颖忻 田梦 王玉凤 徐嘉华 王志雨 杨智凯 张莉 朱睿 刘欣 杨博宁 李海鹏 孙文菲 【摘要】目的:学习制备与测定过氧化氢酶的方法～掌握实验步骤的基本原理及详细操作。方法:自小鼠体内取下肝肾～经组织匀浆、盐析、透析、凝胶层析制备过氧化氢酶纯品。并进一步以Lowry法、Lineweaver-Burk双倒数作图法、SDS-PAGE法测定过氧化氢酶纯品浓度、米氏常数及分子量。结果:过氧化氢酶纯品浓度为0.02mg/ml～分子量为238.4KD～米氏常数为0.06。意义:此方法步骤少～原理清晰～对设备、操作精度较低～适合作为实验教学。 【关键词】过氧化氢酶 纯化 测定 Lowry法 SDS-PAGE法 Lineweaver-Burke双倒数作图法 盐析 透析 层析 【实验背景】 过氧化氢酶,catalase,于1811年首次被发现。1900年正式被命名为“catalase”。1937年成功制得牛肝过氧化氢酶晶体。1969年测得其氨基酸序列。1981年解析得其三维结构。过氧化氢酶是以铁卟啉为辅基的结合酶～广泛存在于生物体的过氧化氢酶体内～为其标志酶～占其总量的40%。在动物的肝脏、肾脏、红细胞中含量较多～是一种酶类清除剂～可促使过氧化氢歧化～分解为氧气和水～清除体内的过多过氧化氢～使细胞免受过氧化氢毒害。为机体提供了抗氧化防御机制～是生物防御体系关键酶 之一。另外～在细胞被病原体感染时～还可作为有效的抗微生物成分。缺乏可导致过氧化物酶体异常、过氧化物酶体缺乏。有研究表明过氧化氢酶并非过氧化氢主要清除剂～而是过氧化氢还原酶。人工制备的过氧化氢酶可广泛应用于食品与乳制品业,去除食物、牛奶中的过氧化氢,～造纸与印染业～农业与环保业～以及医疗卫生等多领域。 动物红细胞、肝以及细菌的过氧化氢酶存在于胞质中。酵母的过氧化氢酶主要积累于胞内～而一些丝状真菌的过氧化氢酶则主要分泌于胞外。因此选用嗜热丝状真菌来生产过氧化氢酶在应用和产品提取方面有较大优势。目前商业化过氧化氢酶以动植物提取和微生物发酵生产为主。 微生物的过氧化氢酶是目前研究的热点～除生理机理研究外～工业开发方面进行了更深入的研究～国外继黑曲霉和微溶壁球菌之后～又开发了嗜热子囊菌、重组大肠杆菌等微生物菌种。国内用微生物产过氧化氢酶仍停留在研究开发阶段。 进行此实验～一方面能联系课本～加强学生对本上呆板知识及生冷名词的理解。帮助学生更好学习～掌握专业知识。另一方面～此实验能开拓学生视野、联系理论与实践～培养学生科学探究精神～科学思维方式～严谨治学态度～团队合作能力～基本实验常识及基本操作技能等科研素质～为学生以后在临床及基础科研工作方面打下基础。 本实验根据过氧化氢酶溶解性和大分子特性～通过组织匀浆、 盐析、透析、分子筛层析等步骤～提取纯化过氧化氢酶～并对制备的过氧化氢酶进行蛋白浓度、分子量、Km的测定。 本实验能制得较纯的过氧化氢酶～活性较好～但步骤较多～操作繁琐～产率低成本高～不适宜用于工业大规模生产。 【材料与方法】 一、仪器、试剂与材料 1、材料:6只成年小鼠肝脏及肾脏,约6g, 2、主要仪器:离心机、组织捣碎机、紫外\可见光分光光度计,型号-9100,、垂直板型电泳槽、电磁炉、JT-1型定时电磁搅拌器、制冰机、玻璃层析柱 3、试剂:见后述 二、方法及试剂原理 1、组织匀浆法制备过氧化氢酶粗提液: 【试剂】0.05mol/L醋酸—乙醇,23.5%,缓冲液～pH4.0,氯仿 颈椎脱臼法处死小鼠～取肝脏肾脏～用滤纸吸净血液后称重,加入肝重8.5倍体积的预冷匀浆缓冲液,0.05mol/L,pH4.0醋酸缓冲液～23.5%乙醇,～用组织捣碎机匀浆3~5min,缓慢滴加肝重0.5倍体积的氯仿,边加边搅拌,～再次匀浆1min,匀浆液离心～4?6000rpm～30min后弃沉淀～收获上清液。【留样】取匀浆后上清液60ul～加入20ul4×电泳上样Buffer～沸水浴3~5min备用于SDS-PAGE检测～-20?冰箱保存。另取60ul匀浆后上清液-20?冰箱保存～用于酶活的测定和蛋白定量。 2、盐析与透析法初步纯化过氧化氢酶: 【试剂】0.5mol/L NaSO,0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液,透析液24 ,20%乙醇～0.1mol/L pH4.7醋酸缓冲液～0.1mol/L NaCl,～50%甘油 冰浴搅拌状态下～向肝云将上清液中缓慢滴加0.06倍体积的0.5M NaSO溶液～继续冰浴搅拌1h,将盐析溶液离心,4? 24 6000rpm～10min,后弃上清～保留沉淀,用肝重4倍体积的磷酸缓冲液,0.1mol/L,pH7.8,溶解沉淀,用手动玻璃匀浆器助溶,20min～离心,4? 4000rpm～10min,后～弃沉淀～留上清,将透析袋,截留量10~20KD～直径2公分,内～臵于沸水中煮15min～清洗晾晒后备用,将上清液放入透析袋内～臵于透析液,20%乙醇～0.1mol/L pH4.7醋酸缓冲液～0.1mol/L NaCl溶液,中透析一周～中途更换一次透析液,一周后～取出透析袋内混浊溶液～离心,4? 6000rpm～10min,后～弃上清～收集沉淀,用2~3 ml的磷酸缓冲液,0.1mol/L,PH7.8,溶解沉淀15min以上,用手动玻璃匀浆器助溶10min,,将溶液在4?下离心,4000rpm～10min,后～弃除沉淀～保留上清液,将收获的样品放入透析袋,截留量10KD,直径1cm,中～臵于50%的甘油中包埋浓缩2小时～待样品浓缩400~500uL收样～臵于4?冰箱中保存。 3、凝胶层析法进一步纯化过氧化氢酶: 【试剂】sephadexG-200～0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液 打开已制备好的层析柱出口～使样品进入柱床,开始收集,～ 当层析液下流时～根据层析液下流的速度补充磷酸缓冲溶液,0.1mol/L,PH7.8,样品进入层析柱时～用试管收集流出液20滴～收集22管。用分光光度计测定每管收集液的OD407nm和OD280nm波长下的吸收值。以管号为横坐标～吸光度为纵坐标～绘制曲线,见后,。 收集OD407nm和OD280nm重叠峰值管即为最终纯化得到的产物。 【留样】取2mL纯化产物存样～Km值及蛋白质浓度测定～放臵4?冰箱保存。 【留样】取浓缩后的层析纯化样品60uL～加入20uL 4×电泳上样Buffer制样～-20?冰箱保存。 4、SDS-PAGE法测定纯化过的过氧化氢酶分子量: 依次经过凝胶的制备、蛋白质样品的处理、加样、电泳、剥胶和固定、染色和脱色,详见《现代医学实验技术》第三版P656,～最后得到标准分子量蛋白和样品的电泳图谱～并绘制分子量标准曲线,见后图, 5、Lowry法测定纯化的过氧化氢酶浓度 【试剂】试剂A:2g酒石酸钾钠及100gNaCO溶于500ml 1.0mol/L 23 NaOH中～用水稀释至1000ml。试剂B:2g酒石酸钾钠及1gCuSO〃5HO分别溶于少量水中～混合后加水至90ml再加1mol/L 42 NaOH 10ml。试剂C:市售酚试剂按1:15稀释～最后浓度为0.15~0.18mol/L。标准蛋白溶液0.1mg/ml。生理盐水。 1 2 3 4 5 6 测定管空白 (匀管 浆、层 析) 标准蛋白溶液0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 各1.0 — (0.1mol/ml) 层析后蛋白吸光变化曲线 0.7 0.6 0.5 0.4OD407 OD280OD值0.3 0.2 0.1 0 123456789101112131415161718 试管 生理盐水(ml) 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 — 1 试剂AB(9:1) 1 1 1 1 1 1 各1 1 混合液(ml) 混匀后置于50?水浴10min，冷却 试剂C(ml) 3 3 3 3 3 3 各3 3 立即混匀，置于50?水浴保温20min，冷却后比色 操作后绘制标准曲线,见后图,～根据曲线求出匀浆和层析产物浓度 6、Lineweaver-Burk双倒数作图法测定纯化的过氧化氢酶米氏常数: 经过过氧化氢的浓度的再标定:取两只锥形瓶各加0.04mol/L的过氧化氢2ml和25%硫酸2ml。分别用0.002mol/L 高锰酸钾滴定至微红～记录并计算过氧化氢的浓度,样品稀释 所加试剂 1 2 3 4 5 层析管 过氧化氢2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 2.5 溶液 蒸馏水 0 0.5 1.0 1.5 2.0 0 样品 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 滴定:0.002mol/L高锰酸钾滴定～记录毫升数 【数据与结果】 图1 SDS-PAGE Maker 分子量97.4 66.2 43.0 31.0 20.1 14.4 样品 (KD) Lg分子1.99 1.82 1.63 1.49 1.30 1.16 1(775 量 迁移距1.3 1.5 1.9 2.5 3.4 3.7 1.6 离(cm) 相对迁0.30 0.35 0.44 0.58 0.79 0.86 0.37 移率 表1 分子量标准曲线2 1.81.775 1.6 1.4 1.2 1 00.10.20.30.40.50.60.70.80.9lg分子量0.8 0.6 0.4 0.2 0 相对迁移率 图2 分子量,10*1.775,59.6KD 标准蛋白 匀浆 层析 试管 空白 2 3 4 5 6 OD值 0 0.375 0.577 0.661 0.708 0.842 0.134 0.708 相对OD 值 0 0.107 0.218 0.310 0.412 0.493 0.926 0.412 蛋白浓度 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.188 0.141 (mg/ml) 表2 图3 层析蛋白浓度,0.141mg,ml 匀浆蛋白浓度 Km值: ,0.188mg,ml 1 2 3 4 层析项目 管 ?加入过氧化氢的ml数 2.0 1.5 1.0 0.5 2.0 ?KMnO的用量 7.6 6.7 4.2 1.0 16.7 4 ?加入过氧化氢的mmol数?×0.0353 0.08 0.06 0.04 0.02 0.088 ?剩余过氧化氢的mmol数?×0.002×2.5 0.038 0.0335 0.021 0.005 0.0835 ?反应速率?—? 0.042 0.0265 0.019 0.015 0.0045 ?底物浓度[S] ??3 0.0260.02 0.013 0.0067 0.029 7 ?1/v=1?? 23.81 37.74 52.63 66.67 222.22 ?1/[S]=1?? 37.45 50 76.92 149.25 34.48 表3 Lineweaver-Burk双倒数曲线 600 500 400 3001/v 200 100 图4 0 0102030405060708090 —20 —16.75 —10 1/[s] 图4 1,—Km,—15.10 则Km? 0.0625 实验结果: 蛋白浓酶活 溶液 度 体积比活5,mg/mIU /ml 总酶活(10) (ml) (IU/mg) l, 匀浆产物 1.5 1.88 34 51 63.92 盐析产物 1.5 0.4 84 126 33.6 层析产物 1.5 0.141 230 345 32.43 【讨论】 实验结果表明～小鼠肝肾细胞通过上述方法可除去绝大多数杂 蛋白～制得较纯的过氧化氢酶～分离所得过氧化氢酶活性良好～ 回收率高。测得酶分子量较准确。 过氧化氢酶分子量约为238KD～结构上由4个相同亚基构成～ 于407nm波长下有特征性吸收。溶于水～几乎不溶于乙醇、氯仿 等有机溶剂～在酸性环境下溶解度低～易析出。最适温度为37?～最适pH值为7.8.本实验根据其溶解性与大分子性对其进行纯化。 1、 匀浆 分离纯化某种蛋白质时～事先要把蛋白质从组织中 释放出来并保持原来的天然状态～不丧失活性～所以要根据 所提取蛋白质的性质采取适当的方法将组织和细胞破碎。过 氧化氢酶在乙醇、氯仿等有机溶剂中溶解度很小～而脂质在 有机溶剂中溶剂热度较大～通过加入有机溶剂可实现对过氧 化氢与脂质的分离。过氧化氢酶在乙醇、氯仿中稳定性良好～ 不易变性～而某些杂蛋白在有机溶剂中稳定性差。缓冲液预 冷以防酶的变性～缓冲液中pH4.0的醋酸使非耐酸性蛋白质 变性。乙醇作为有机溶剂可去除部分脂类。氯仿可抽提乙醇～ 溶解脂类以及使有机相与水相分离～而一些变形蛋白可沉淀 下来。离心后过氧化氢酶则根据其溶解性分布于水相～即上 清液。得到初步纯化的过氧化氢酶。 2、 盐析 盐溶液中盐与蛋白质竞争性与水结合～破坏水化 膜～盐离子所带电荷同时可中和蛋白质分子表面的电荷～因 而是蛋白质溶解度降低。通过向过氧化氢酶粗提液中加入适 量浓度的中性盐～是过氧化氢酶呈盐析状态～而部分杂蛋白 呈盐溶状态～离心后过氧化氢酶主要存在于沉淀中～可实现 过氧化氢酶与部分杂蛋白的分离。实验时冰浴状态下搅拌易 于过氧化氢酶析出。 3、 透析 采用20%乙醇、0.1mol/L pH4.7醋酸缓冲液、0.1mol/L NaCl溶液为透析液～在该条件下～过氧化氢酶溶解度变小～易沉淀形式析出～但不变性。透析后离心～过氧化氢酶主要存在与沉淀中～但沉淀中也可能含有少量变性的杂蛋白。选择0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液复溶沉淀～则过氧化氢酶溶解～而变性的蛋白不能溶解～从而实现过氧化氢酶与部分杂蛋白的分离。透析袋沸水处理可除去出厂时表面的甘油、重金属离子和硫氰物～防止蛋白变性。触碰透析袋的手要干净～以免油污堵塞透析袋孔。透析液中乙醇除有进一步吸脂作用外还可提供渗透浓度。 4、 层析 凝胶层析法主要根据混合物种分子大小不同的各种物质～随流动相作为固定相的凝胶层析柱时～各种物质分子扩散移动速度不同使混合物中各种物质得到分离的技术。采用sephadexG-200葡聚糖凝胶层析柱～其与过氧化氢酶的亲和力较高～吸附过氧化氢酶时间较长～其他蛋白～尤其分子量较大的蛋白则较早流出。加样时动作轻缓～用滴管沿柱内壁。洗脱与收集时应保持补充量与流出量相等～防止洗脱过快样品扩散导致出现多个样品峰值。通过监测洗脱液在407nm和280nm波长下的光吸收值变化～合并收集407nm和280nm重叠峰值管～即可获得纯化后的过氧化氢酶。层析先经过平台期～该时期主要为缓冲液～蛋白质扩散较慢～到第八管开始蛋白质流出逐渐增多～过氧化氢酶流出也增多～10 管时到达峰值。之后蛋白流出量逐渐下降因为大部分蛋白已流出。选择两曲线重合的点可近似的认为该管流出的总蛋白几乎都是过氧化氢酶。 5、 SDS-PAGE SDS-PAGE法是在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂SDS～则蛋白质分子电泳的迁移率主要取决于它的相对分子量～而与所带电荷和形状无关。在蛋白质溶液中加入SDS和β-巯基乙醇能使蛋白质分子中的二巯键还原～SDS使蛋白质的氢键、疏水键打开～并结合到蛋白质分子上～形成蛋白质-SDS复合物。由于十二烷基硫酸根带负电～使各种蛋白质的SDS复合物都带上相同密度的负电荷～它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量～因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的点和差别。SDS与蛋白质结合后引起蛋白质构象变化～近似长椭圆棒～不同蛋白质的SDS复合物短轴都一样～长轴则随蛋白质的分子量成正比变化。凝胶形成的分子筛孔径大小由Acr和Bis的浓度决定。总浓度越高～孔径越小。电泳样品制备时100?加热5min有利于SDS与蛋白质结合。另外loading Buffer中甘油比重大于水～有利于样品沉入孔槽～溴酚蓝为观察电泳进度。浓缩胶中的缓冲对为Tris-HCl～电泳缓冲液的缓冲对为Tris-甘氨酸。电泳时～Cl?移动速度最快甘氨酸最慢～蛋白质的SDS复合物居第二～因而被浓缩成狭窄的中间层。同时Tris碱性和HCl对pH有调节作用。 2+6、 Lowry法 在碱性溶液中Cu+蛋白质?Cu-蛋白质～Cu-蛋 白质使试剂中的磷钨酸-磷钼酸坏远程蓝色化合物～测定吸 光值就可推算出蛋白质的含量。但此法实际上是蛋白质中酪 氨酸和色氨酸等与试剂的反应～因此它受蛋白质氨基酸组成 的影响。对标准蛋白、匀浆及层析样品进行处理时～应保持 各因素的一致～如试剂来源、种类、反应时间、用量、温度、 仪器等因素～以减少误差。 Lineweaver-Burke双倒数作图法 7、 2HO?2HO+O? 2222 ? 剩余的用KMnO滴定:2 KMnO+5 HO+3HSO?4422242MnSO+5O+8HO 422 在酸性环境中～紫红色?滴定终点为为红色。本次操作要求迅速～由于过氧化氢极不稳定。因而此次实验前要进行过氧化氢的重标定。最后求出反应前后的或氧化氢差及反应速度～以1/[S]为横坐标～1/V为纵坐标作图可求出过氧化氢酶的Km值。实验中～可根据标定时用的高锰酸钾ml数与滴定反应后以相同ml数底物的过氧化氢的一组高锰酸钾ml数作比较来判断酶是否具有活性。 通过这次实验学生有了一些动手的机会～掌握了一些知识。但对实验试剂及操作的原理陌生并没有达到开发学生思维创新独立的目的。操作过程中的多种失误以及不可重复性使实验结果 误差较大～数据失真。改革仍有许多弊端。 参考文献:生物化学第七版教材 现代医学实验技术第三版 ,下册,