先天性小耳畸形患者骨形态发生蛋白-5成熟肽基因突变研究.doc

先天性小耳畸形患者骨形态发生蛋白-5成熟肽基因突变研究.doc 先天性小耳畸形患者骨形态发生蛋白?5成熟肽基因突变研究 【摘要】 目的:探讨骨形态发生蛋白?5(BMP5)成熟肽基因突变与先天性小耳畸形发病的关系。方法:收集临床确诊的散发先天性小耳畸形患者35例，用Trizol提取外周血白细胞总RNA，利用反转录聚合酶链反应单链构象多态性分析(RT?PCR?SSCP)技术进行BMP5成熟肽基因的突变分析，对异常电泳条带的RT?PCR产物进行核苷酸序列测定，明确突变位点和方式。结果:从35例先天性小耳畸形患者中检测到1种错义突变:第 213位点发生TTTT?ACAC突变，编码氨基酸改变为苯丙氨酸?组氨酸。 结论:检测到的BMP5成熟肽基因突变可能为致病突变，其与先天性小耳畸形发病的关系有待于进一步研究。 【关键词】 先天性小耳畸形;骨形态发生蛋白?5成熟肽基因;突变 先天性小耳畸形(microtia)也称小耳畸形综合征，其临床主要表现为外耳形态改变，外耳的基本结构消失或部分消失，仅有残余耳软骨及部分耳垂，甚至没有上述结构，而且常伴有外耳道闭锁、中耳畸形和颌面部畸形等症状，小耳畸形以单侧较多见。先天性小耳畸形在我国是一种较常见的先天畸形，发病率约为1/7000 ，在头面部先天畸形中位居第二，仅次于先天性唇腭裂畸形。先天性小耳畸形家族性病例少见，多以散发病例出现[1?2]。Kingsley等[3?4]曾先后发现小鼠小耳畸形的出现与骨形态发生蛋白?5(BMP5)成熟肽基因突变密切相关。本研究应用反转录聚合酶链反应单链构象多态性分析(RT?PCR?SSCP)、DNA测序实验方法检测BMP5成熟肽基因在先天性小耳畸形患者中的突变情况，以探讨BMP5成熟肽基因突变与先天性小耳畸形发病的关系。 1 对象与方法 1.1 研究对象收集2003~2005年度东南大学附属中大医院整形外科先天性小耳畸形患者43例，男性33例，女性10例，年龄6~22岁。其中双侧耳畸形2例，伴有颅面短小者5例。所有患者均来自于江苏、安徽两省，皆为汉族人，无家族病史。 1.2 仪器及试剂Eppendorf基因扩增仪、冷冻高速离心机(German)，DYY?8C型高压双稳电泳仪、DYCP?31C型琼脂糖水平电泳槽、DYCZ?28A型夹芯式垂直槽(北京六一仪器厂)，ImageMaster VDS图像分析系统(USA)。Trizol试剂(上海生工生物工程有限公司)，RNA PCR Kit(AMV) Ver.3.0(大连宝生物工程有限公司)，丙烯酰胺、亚甲双丙烯酰胺、TEMED、甲酰胺(南京生兴生物工程有限公司)。 1.3 研究方法 1.3.1 引物 依据GenBank中BMP5成熟肽基因序列(GI:24797149)两对引物，由上海捷倍思基因技术有限公司合成。引物 a:上游为5′?CAAGGCG AGTGAGGTACTTC?3′，下游为5′?TTCATATGGGCGTT AAGTGG?3′，扩增片断长度为270bp。引物 b:上游为5′?CTATGTGAGCTTCCGGGATC?3′，下游为5′?GTGG CAGCCACATGAGCGTAC?3′，扩增片断长度为289bp。 1.3.2 模板制备 取先天性小耳患者外周血1ml，用Trizol氯仿异丙醇法提取有核细胞中总RNA，25μl DEPC水溶解，-70?保存作为RT?PCR反应模板。 1.3.3 RT?PCR反应 反应体积50μl。引物a反应组成分为:总RNA 2μl，MgCl2 1mmol?L-1，10×RT?Buffer 1μl，Rnase Free H2O 2?75μl，dNTP 0?2mmol?L-1，Rnase Inhabitor 10U，AMV 0?25U，oligo dT 1?25pmol，5×PCR?Buffer 10μl，灭菌蒸馏水 27?75μl，Ex Taq 1?25U;上下游引物各 0?2pmol?μl-1。反应程序为:30? 10min，45? 30min，99? 5min，5? 5min，94?预变性2min，然后按94? 30s、54? 30s和72? 1min共进行35个循环，最后72?延伸5min。引物b反应组成分为:总RNA 2μl，MgCl2 1?5mmol?L- 1，10×RT?Buffer 1μl，Rnase Free H2O 2?75μl，dNTP 0?2mmol?L-1，Rnase Inhabitor 10U，AMV 0?25U，oligo dT 1?25pmol，5×PCR?Buffer 10μl，灭菌蒸馏水 26?75μl，Ex Taq 1?25U;上下游引物各 0?2 pmol?μl-1。反应程序为:30? 10min，45? 30min，99? 5min，5? 5min，94?预变性2min，然后按94? 30s、54? 10s和72? 1min共进行35个循环，最后72?延伸5min。对每个样本重复扩增3次，确保结果的可重复性。 1.3.4 RT?PCR反应产物检测 取PCR产物5μl，2,琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，电泳条件为电压100V，时间45min，用ImageMaster VDS图像分析系统观察产物片段。 1.3.5 SSCP分析 取RT?PCR产物6μl，与上样缓冲液(95,甲酰胺、0.03%二甲苯青、0.05%溴酚蓝、20mmol?L-1 EDTA)2μl混合，98?变性10min后立即置于冰浴中，5min后分别上样于8,和12,的非变性聚丙烯酰胺凝胶(交联度为49?1)，于1×TBE缓冲液中室温(10?)150V恒压电泳15h。依次用固定液(10,乙醇)振荡10min、双蒸水漂洗3次，加脱色液(1.1%硝酸)振荡3min、双蒸水漂洗3次，然后加银染液(0.1%硝酸银)于摇床上染色30min，双蒸水短暂漂洗2次，再加显色液(2.5%碳酸钠、0.02%甲醛、2μg?ml-1硫代硫酸钠)振荡直至出现清晰条带，迅速用终止液5,冰醋酸终止反应。观察各标本DNA两条单链电泳迁移率，并与正 常对照相比较，确定有无异常。 1.3.6 DNA测序 将SSCP异常泳动的标本交由上海博亚生物技术有限公司进行测序分析。 2 结 果 2.1 RT?PCR扩增产物分析引物 a、b的扩增产物分别为270、289bp的DNA片断(图1、2)。M为Marker;1、2均为RT?PCR产物 2.2 SSCP试验发现有1例先天性小耳畸形患者BMP5成熟肽基因泳动异常(图3)。N为正常对照，箭头所指为异常电泳条带将SSCP试验泳动异常的标本进行正、反向DNA测序，再将测序结果与GenBank中的BMP5成熟肽基因序列(GI:24797149)相对照，结果发现异常标本BMP5成熟肽基因在213位点发生TTTT?ACAC突变(图4，箭头所指)，以5′?3′为编码链，ATG为起始码，则发生TCT?TCA突变，其编码的氨基酸仍为丝氨酸，但TTT?CAC突变，则编码的氨基酸由苯丙氨酸变为组氨酸。