[word格式] 年轻恒牙与成熟恒牙牙髓中ConA的表达

[word格式] 年轻恒牙与成熟恒牙牙髓中ConA的表达 年轻恒牙与成熟恒牙牙髓中ConA的表达 第12卷第4期 2003年12月 中国组织化学与细胞化学杂志 CHINESEJOURNALOFHIEIOCHEMISTRYAND Vo1.12.No.4 Dec.2003 年轻恒牙与成熟恒牙牙髓中ConA的表达 陈旭高张晓芳 (o0国医科大学口腔医学院儿童牙科,沈阳110002) [摘要]目的研究刀豆素A(ConcanavalinA,ConA)在人的年轻恒牙与成熟恒牙牙髓中的表达特征,以进一步 了解牙髓发育成熟过程.方法采用ABC法,对年轻恒牙和成熟恒牙牙髓标本进行ConA的免疫组化染色,并做图像定量 分析.结果ConA主要在牙髓成纤维细胞和成牙本质细胞的胞浆染色,同时在细胞外基质中可见阳性染色.年轻恒牙组 呈强阳性染色,成熟恒牙组呈弱阳性染色.图像分析表明两组间灰度值有显着性差异(P<O.01).结论年轻恒牙和成熟 恒牙的牙髓组织中ConA的表达不同,提示可利用凝集素在组织细胞的表达情况来研究牙髓的分化,成熟状态. [关键词]年轻恒牙;成熟恒牙;牙髓;刀豆素A [中图分类号]R780.2[文献标识码]A EXPRESSIoN0lFO0NCANAVALINAINDENTAIPULP0lF?A兀IRE ANDMATUREPERMANENTTEETH, ChenXu,GaoJie,ZhangXiaofang (DepartmentofPediatricDentistry,SchoolofStomatology,ChinaMedicalUniversity, Shenyang,110002,China) CAbstract]ObjectiveToinvestigatetheexpressionofConcanavalinA(ConA)inhumandental pulpofimmaturepermanentteethandmaturepermanentteeth,andtofurtherunderstandtheprocessof developmentandmaturationofthedentalpulp.MethodThepulpswereimmunohistochemicallyexamined byuseofABCmethodsandimageanalysistechniques.ResultTheresultsshowedthatConAwasmainly stainedinthecytoplasmoffibroblastcellsandodontoblasts,andextracellularmatrixaswel1.Thestai— ningwasmorestronglypositiveinimmaturepermanentteeththaninmaturepermanentteeth.Imagea— nalysisindicatedthatthegrayvaluebetweenthetwogroupswasstatisticallydifferent(P<0.01).Conclu— sionTheexpressionofConAinthedentalpulpofimmatureandmatureperman entteethwasdifferentand itcouldbeusedtoindicatethestateofdifferentiationandmaturationofthedent alpulp. CKeyWords3Immaturepermanenttooth;Maturepermanenttooth;Dentalp ulp;Con— canavalinA(ConA) 凝集素是一类广泛存在于动,植物中的糖蛋白, 具有与特定糖基专一结合的特性,同时所有生物膜 都有含糖结合物,主要以糖蛋白或糖脂形式存在. 另一方面,凝集素具有多价结合能力,能与生物素, 酶,胶体金,铁蛋白等示踪物结合,从而在光镜或 [收稿日期]2003—09一10[修回El期]2003一ii一12 [作者简介]陈旭,女(1972年),汉族,博士研究生,讲师. *通讯作者(Towhomcorrespondenceshouldbeaddressed) 电镜水平显示其结合部位.因此凝集素可以作为一 种探针来研究细胞上特定的糖基,从而探索细胞的 演变过程[1].本实验采用免疫组化技术和图像分析 手段,研究一种凝集素刀豆素A(ConcanavalinA, ConA)在人的年轻恒牙与成熟恒牙牙髓中的表达特 征,以进一步了解牙髓发育成熟过程. 材料和方法 1.组织标本制备 洁 400中国组织化学与细胞化学杂志第12卷 牙髓标本取自多生牙,因阻生而拔除的第三磨 牙或因正畸而拔除的健康无龋牙齿,年轻恒牙组 15例,牙根发育1/3~3/4;成熟恒牙组12例.所 有研究对象均无全身系统性疾病,近三个月未曾服 用免疫制剂和抗菌药物.牙齿拔除后立即将牙齿纵 向劈开,完整取出牙髓组织,放人4的多聚甲醛 液中,4?下固定.梯度乙醇脱水,二甲苯透明, 石蜡包埋.每个标本于牙髓组织纵向最大面积处连 续切片3张,厚5m,其中1张行HE染色,另外 2张做免疫组化染色. 2.免疫组化染色和图像分析 采用亲合素,生物素一过氧化酶复合物技术 (ABC法),生物素化ConA购自Sigma公司,工 作浓度10~g/ml,ABC试剂盒购自武汉博士德公 司.将切片脱蜡至水.滴加蒸馏水新鲜配置的3 过氧化氢液,室温下孵育30min;0.01胰酶消化 30min.以上两步之后均用PBS振洗5min,共3 次.正常血清封闭15min,滴加生物素化ConA, 37?下孵育lh;滴加ABC复合物,37?1h, DAB显色.用PBS缓冲液代替ConA作为阴性对 照. 牙髓中的细胞胞浆及细胞外基质出现棕黄色颗 粒为阳性染色.将染色强度分为:0级——阴性, 即未出现着色颗粒;工级(+)——呈黄色,染色 弱,但明显高于阴性对照;1I级(++)——染色清 晰,呈棕黄色或深黄色.或按细胞阳性率表示:0 级——阴性,无细胞染色;I级(+)——平均每 高倍视野阳性细胞数小于309/6;1I级(++)—— 平均每高倍视野阳性细胞30或以上.利用图像 分析仪和和MetaMorph/Coolsnapfx/AXTO软件 系统对阳性染色部位的透光强度进行定量分析(即 灰度值的测定).结果用SPSS软件作统计学分析. 结果 1.ConA免疫组化染色的阴性对照(图1).』 2.ConA在牙髓成纤维细胞和成牙本质细胞 的胞浆染色,同时在细胞外基质中也可见阳性染色 (图2). 3.ConA在年轻恒牙组呈强阳性(++)染 色(图3). 4.ConA在成熟恒牙组呈弱阳性(+)染色 (图4). 5.图像分析结果见表1,经t检验,两组间灰 度值有显着性差异. 表1ConA在年轻恒牙与成熟恒牙牙髓中表达的灰度值 Table1GrayvalueofConAexpressedindentalpulpofimmaturepermanentte eth andmaturepermanentteeth 两组问比较(comparingtwogroups),P<0.01 讨论 一 般认为细胞膜上特定的糖基可以区别细胞的 类型和反映细胞在分化,成熟和肿瘤细胞中的变 化,应用凝集素作为细胞分化的标志,多集中 于血细胞[1].ConA可特异地与a—I).甘露糖,a/ 葡萄糖糖基结合.对人牙齿胚胎发育的免疫组化研 究揭示ConA在牙胚发育的钟状期,牙乳头问质细 胞为阳性染色,成牙本质细胞为强阳性染色,染色 随细胞分化程度增高而增强[2].有研究表明,发育 成熟的牙髓细胞和成牙本质细胞表达ConA[引.本 实验首次对牙根尚未发育完全的年轻恒牙和根尖闭 合的成熟恒牙的牙髓组织中ConA的表达特征进行 研究,表明前者表达强于后者,进一步说明可利用 凝集素在组织细胞的表达情况来研究牙髓的分化, 成熟状态;特异糖基的表达变化与牙齿发育中的一 系列事件是相关联的. 牙齿的发育是细胞之间,细胞与细胞外基质 第4期陈旭等.年轻恒牙与成熟恒牙牙髓中ConA的表达401 ?(ExtraCellularMatrix,ECM)相互作用的结果. ECM蛋白以其碳水化合物的含量及相结合的糖胺 多糖为特征.凝集素具有与特定糖基专一结合的特 性,其表达变化反映了细胞表面膜蛋白及细胞外基 质的糖基成分的不同.Blottner等[4]对大鼠早期牙 本质形成中凝集素的表达变化研究表明某种凝集素 结合的显着改变可能与ECM的生物合成有关.啮 齿动物胚胎的牙齿发育早期,?型一前胶原可能存 在于牙问充质,在聚合成胶原纤维之前,I)-半乳糖 和I)-糖基与前胶原分子结合而被分泌到细胞外间 隙中.ECM构成了牙髓组织细胞生存的外环境, 对细胞的形态,迁移,增殖,分化等产生多种生物 学效应.?型胶原是牙髓ECM中的主要成分之 一 ,文献报告随着年轻恒牙牙根的逐渐发育,牙髓 中?型胶原的表达逐渐减弱[5],与本研究中ConA 的表达变化相一致.因此推测牙根发育过程中牙髓 组织的凝集素与ECM之间有紧密联系.一方面 ECM成分的改变,提供了细胞分化诱导的信号; 另一方面,位于细胞表面及胞浆中的凝集素受体在 接受信号刺激后转移到细胞膜上,通过调控某些基 因的表达参与自身分化的调节.有报道[6用抗肾细 胞麦胚凝集素受体的抗体,可以阻断它与ECM中 纤维粘连蛋白的相互作用... 最新研究表明,成熟组织器官中也存在干细 胞,称为成体干细胞[7],牙髓干细胞属于成体干细 胞.由于尚无有效手段进行分离,鉴定则成为筛选 确定牙髓干细胞的关键[8]凝集素组织化学不仅在 ,研究糖蛋白及其定位方面是可靠的,而能显示一 般组织化学方法不能区分的细胞亚群和糖蛋白,方 法简单易行,在光镜下就可以检出各种糖蟹白的糖 基以及不同功能状态下在细胞内和细胞表面糖基的 变化,尤其在研究细胞分化,成熟,衰老等方面有 广泛的应用前景[9]. 本研究提示可利用牙髓细胞的凝集素表达变化 来作为牙髓的分化程度的一个指标. 参考文献 C13王伯}云,李玉松,黄高升等主编.病理学技术.北京: 人民卫生出版社,2000,429—431 [2]汪平,史俊南,郝建军.人牙齿胚胎发育的免疫组化 ,研究.牙体牙髓牙周病学杂志,1995,5(4):220—221 (33EndoK.Lectinhistochemicalstudyonhumandental pulp:specialreferencetOodontalblastsandpulpcells. MeikaiDaigakuShigakuZasshi,1989,18(3):360— 381 [4]BlotmerD,LindnerE.Light-microscopicstudieson spatialandtemporalbindingofthelectinsconcanavalin A,wheat—germagglutininandpeanutagglutinininear— lyratodontogenesis.ArchsOralBiol,1987,32(1): 35-42 E53陈旭,刘淑杰,王兆元.年轻恒牙牙根发育过程中牙 髓中?型胶原的表达.牙体牙髓牙周病学杂志,2002, 12(10):521—523 C63StreeterHB,ReesD八FibroblastadhesiontORGDS showsnovelfeaturescomparedwithfibronectin.JCeU BbI,1987,105(1):507-515 [73Almeida-poradaG,PoradaC,ZanjaniEl3.Adultstem cellplasticityandmethodsofdetection.RevClinExp Hematol,2001,5(1):26—41 C83杨雪超,樊明文.牙髓中的干细胞(综述).国外医学 口腔医学分册,2002,29(6):327—328 C93贲长恩,李叔庚主编.组织化学.北京:人民卫生出 版社.2001:678—679 图版说明 图1牙髓组织中ConA免疫组化染色的阴性对照.ABC 法.X200 图2牙髓组织中ConA的阳性表达(仓).ABC法.× 100 ?所示为成牙本质细胞;?所示为牙髓成纤维细胞 图3年轻恒牙牙髓组织中ConA呈强阳性染色(仓). ABC法.X200 图4成熟恒牙牙髓组织中ConA呈弱阳性染色(仓). ABC法.X200 EXPLnONOFFIGI瓜ES Hg.1ThenegativecontraststainingofConAindental pulp.ABCmethod.X200) Hg.2ThepositiveexpressionofConA(仓)indental pulp.ABCmethod.X100) ?Odontoblastcell;?fibroblastcell Hg.3ThestrongstainingofConA(仓)indentalpulpof immaturepermanentteeth.ABCmethod.X200 Hg.4TheweakstainingofConA(仓)indentalpulpof maturepermanentteeth.ABCmethod.X200 中国组织化学与细胞化学杂志第12卷 ,_’ 耄箴 ? ?-? ? j._.???’._tt.’一’’:?,, . ti .苇 . p . 致作者及读者 为了推进科技信息交流的网络化及科技期刊编辑,出版发行工作的电子化,本刊于1997年加入”中 国学术期刊(光盘版)”,此光盘版系国内唯一的全文检索系统,极大地方便了广大的科技工作者查阅资 料.本刊于1999年加入万方数据(CinaInfo)系统科技期刊群,读者可从因特网及万方网络查阅我刊的 有关文献资料.又讯:本刊录用的稿件所付稿酬含上网服务报酬,不再另付.凡不同意入网的作者,请另 投他刊.本刊于1997年至今被具有较高权威性的国际性刊物,美国《化学文摘》收录. 本刊编辑部 ???l?l , 一