人类卵黄囊造血及卵黄囊内皮细胞的培养

人类卵黄囊造血及卵黄囊内皮细胞的培养 ll6 中南大学(医学版) Jcents0uthuniv(MedSei)"2004,29(1) 人类卵黄囊造血及卵黄囊内皮细胞的培养 马丽霞,程腊梅,黄艳红,王绮如 (中南大学湘雅医学院血液生理研究室;生殖与干细咆工程研究所,长沙410078) [关键词]人卵黄囊;造血;内皮细胞 [中图分类号]R331.2[文献标识码]B[文章编号]1672—7347(2oo4)ol-0116-02 造血是机体生命活动的重要部分,造血活动住胚胎早期 就已经开始.成人造血处于稳定状态,血液中的血细胞起源 胎儿期,肝脏是主要的造血器官,然 于骨髓中的造血干细胞. 而在肝脏发育之前,哺乳动物早期胚胎的发育就需要红细胞, 这一时期,由卵黄囊的血岛产生大的原始红细胞满足胚胎发 育的需要.胚胎的正常发育依赖于卵黄囊的正常功能,卯黄 囊内胚层转运和代谢母体来源的大分子物质,合成铁蛋白,中 胚层的血岛产生红细胞0国内外已有较多关于小鼠卵黄囊 造血的报道,{而关于人卵黄囊造血的研究较少人卯黄囊在 妊娠的第3,6周是主要的红细胞生成部位,至妊娠的第6周, 其功能逐渐被肝脏所代替.到妊娠22周后骨髓造血逐渐建立 因此本实验取妊娠4周和6周的人药物流 并维持终身. 产胚胎,研究其卵黄囊造血功能:通过对卵黄囊细胞造血集 落生成的分析和内皮细胞的培养,进一步了解人卯黄囊的造 血功能,以及卵黄囊内皮细胞在调控造血中的作用 1材料与方法 1.1材料(1)试剂:新生牛血清(NBS)为杭州四季清生 物工程材料研究所产品;马血清(HS)为军事医学科学院产 品;GM.CSF,EPO,SCF,IL-6,IL.一3,rhVEGF,rhECGF均为 Gezyme产品;vWF抗体,羊抗兔IgG—FITC均为Sigma公司产 品.(2)标本:取人胎龄4周或6周的药物流产妊囊,通过观 察胚体的发育特征(体曲,体节数,肢芽),卵黄囊的形态来判 断胎龄'(图1). 图1人胚胎(6周) Fig.1Humanemb~o(6thweek) 1.2方法 1.2.1单个细胞悬液的制备将妊囊在含200kU/ml庆 大霉素的生理盐水中浸泡1h后,小心分离卵黄囊和胎肝,分 别剪碎,0.1%胶原酶37?消化40Illill,离心,弃J清,用培养 基洗涤一次,将收集的细胞制成单个细胞悬液,并计数. 1.2.2造血集落培养?粒系,红系.巨核系一巨噬系集落 形成单位(CFU—GEMM)系早期造血细胞,可以反映造血干细 胞的数量,培养体系为:卯黄囊或胎肝细胞每毫升3x10个, 马血清30%,EPO2U/ml,SCF50ng/ml,IL320ng/mJ,IL-6 50ng/ml,GM—CSF50ng/ml,甲基纤维素0.9%,于96孔板培 养,每孑L0.2ml,分种3孔,于37?,5%CO,饱和湿度条件 下培养10d,倒置显微镜下计数集落数,以细胞数>/2000个, 并含红系细胞,单核细胞,巨噬细胞三种细胞以上的细胞聚 合计数为一个CFU—GEMM.?粒一巨噬系集落形成单位 (CFU.GM),系较成熟的造血祖细胞,培养体系为:每毫升细 胞3x10个,马血清30%,GM—CSF100ng/ml,甲基纤维素 0.9ck,于96孑L板培养,每孑L0.2ml,分种3孑L,于5%CO, 37?,饱和湿度条件下培养5d,倒置显微镜下计数集落数, 以/>50个细胞的聚合计数为一个集落.?红系集落形成单 位(CFU—E),培养体系为每毫升细胞3x10个,马血清 30%.EPO2U/ml,甲基纤维素0.9ck,BSA1%,BPA10%,2一 巯基乙醇10mol/L,于96孑L板培养,每孑L0.2ml,分种3孑L, 于5%CO,,37?,饱和湿度条件下培养3d,倒置显微镜下计 数集落数,以/>8个细胞的聚合计数为一个集落.?巨核细 胞集落形成单位(CFU—Meg),可以反映巨核系祖细胞的数 量,培养体系为马血清30%,BSAl%,BPA10%,2-巯基乙醇 10一mol/L.TPO20ng/ml,SCF50.g/ml,IL一35ng/ml,甲基纤 维素0.9%,于96孑L板培养,每孑L0.2ml,分种3孑L,于5% CO,,37?,饱和湿度条件下培养5d,倒置显微镜下计数集落 数,以/>3个细胞的聚合计数为一个集落: 1.2.3人卵黄囊内皮细胞的培养内皮细胞的培养体系 为20%NBS,rhECGF2ng/ml,rhVEGF5ng/ml置24孑L板,每 孑Llml,根据卵黄囊的大小每个卵黄囊的细胞分种2-3孑L,于 5%CO,,37?,饱和湿度条件下培养9d,瑞氏一姬姆萨染色后 于倒置显微镜下观察细胞形态,或间接免疫荧光法检测vwF 的达.vWF检测的具体方法为细胞涂片后用4%多聚甲醛 固定30min,PBS洗3次,每次5rain;2%正常羊血清封闭4 h;加入vwF抗体,4?冰箱过夜,PBS洗3次,每次5min;加 入二抗,37?孵育60min,PBS洗三次,每次5min;置荧光显 微镜下观察.以脐静脉内皮细胞株为阳性对照,骨髓成纤维 细胞为阴性对照. 1.2.4统计学处理采用SPSS软件包做统计学分析 数据为3次试验结果,表示为X?,各组之间比较采用t检 验,P<0.05有统计学意义: 收稿日期:2003-05-20作者简介:马丽霞(1979一),女,山西朔州人,硕士研究生,主要 从事造血调控研究.通讯作者 人类卵黄囊造血及卵黄囊内皮细胞的培养?丽霞.?7 2结果 2.1人卵黄囊造血集落人黄囊细胞可以.一多和j1造 血集落,包括CFU—E,CFt一(Mc一(;EMM(附表){Jf,胎发 育的第4周,人卵黄囊造血以红系为,系j系之比约 为20:1胚胎发育至第6周时造m转移至J1I'叭,艟瞧造 血明显减弱 附表人印黄囊和胎盯成的造袋 集溶类型—鱼堕—— CFL.一E1600?1217…667?153 CFU—GM867+O.58一200?1? CFUGEMM22.00?3.(X)'O CFU—Meg00 6"?fjfi龄 卵箕挺fJff? 567?1533865?()1 533?Jl638.33?473 10.??34667?945 00 与同周胎龄胎肝比较,P<0.0i,'j6矧胎龄H,比较 P<0.05.槲P<0.0I 2.2人卵黄囊内皮细胞的培养卵黄囊1,坎胞n:禽 有ECGF和VEGF的培养体系『{l培养9d后,lfJ肜成lJ,】f细 胞集落(圈2)内皮细胞圆形或椭圆肜,,\I'的伶删 阳性(闻3) 图24周卵黄囊细胞形成的内皮细胞集落(×330) Fig.2Endothelial(?Pll(?'JJ'?"formP'll4,,PPk'Jlklfftll,(×330 图3卵黄囊内皮细胞,wF的表达(×400) Fig.3,WFexpressioninv.1kd('endf~lheliatc×400 3讨论 卵黄囊是哺乳动物发育的第?个造血中心,川第 一 个血管发育的位点,在胚胎发育过程中卯黄囊造血主表 现为系造血,这胚胎朗卵黄囊主要为胚体提供红细胞的 }功能f『『{I;=j_合内彳丁作者报道人卵黄囊造血f/祖细胞 体钋培养t『f以形成红系集落,未见粒系集落本实验结 l泉丧fjJJ,人黄囊内仔造血f细胞,且宵多向分化能力, 以系分化为},_j1下j外的报道枉j一致'胚胎发育第 4』占J卵黄衰的造功能要强于肝脏的造血功能,胚胎发育的 第6嚣囊的造血J了J能减退In朋r吡的造血功能增强印 美囊遄血和胎盯造血之『日J白0相可承接关系,以埂卵黄囊细胞 外芥町以qt成c(;EMM,这都支持卵黄囊内存在有 造叭f.细人卯黄囊造m细胞体外培养没有俭测到CFL— ,?J'能是卯黄髭造血细胞中CFt—Meg数量很少的缘故 造ml/T,n细i胞的增殖分化有赖,造血做环境的支持和 州控,』L【{】造m质细胞分泌的细胞子住造血/祖细胞 的分化I{J世列重要作j{j卵黄囊血岛是由内皮细胞包绕 造血绷{地成,内皮细胞住卵黄囊造血细胞的增殖分化中起 重要作川小鼠骨髓『人J皮细胞条件培养液住液体培养体系 L{]能扩增卯黄囊造血f/租细胞,使CFU—GM和HPP—CFC的 产牟增JJ【1推测人卵黄囊内皮细胞条件培养液对人卵茵 囊造血f:H细胞有类似或更好的扩增作JLfi卵黄囊造血T: 细胞输成个体/f能重建造血,j卯黄囊造血于细胞本 的发育以_』支卯美囊的造血做环境有关埘人类卵黄囊造 l0lf:细怛,之印睫造m微环境成,F骨髓造血十细胞及骨 髓造m微1:境葶异的比较研究,对j:造血发育的深入r解有 爱也辽卯美囊造血f细胞的细咆表面物质以及卵黄囊 lJ,】圳lJ包j造血的父系住进…步深入研究 致谢:感谢雷军在制图方面给予的帮助 参考文献 一一一一一一,,一一姒,一,一一一一一一 .三?…=_,=南帆步…_三?…晓_三.二^二像例-兰l二_二耶_=二 134S6789