浅论乙烯雌酚诱导兔骨髓基质干细胞向成骨分化的实验研究

浅论乙烯雌酚诱导兔骨髓基质干细胞向成骨分化的实验研究 浅论乙烯雌酚诱导兔骨髓基质干细胞向成骨分化的实验研究 作者:张世民，吕刚，梅晰凡，胡萌【摘要】 目的 观察乙烯雌酚 (Diethylstilbestrol)对兔骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)成骨分化的影响，探讨乙烯雌酚对骨髓基质干细胞的 成骨调节及其对骨骼系统的影响。方法 用不同浓度(0,10-10,10-5 mol/L) 乙烯雌酚干预1周龄新西兰长耳白兔的骨髓基质干细胞，并 设地塞米松10-8 mol/L、β-甘油磷酸钠10 mmol/L、维生素C 50 mg/L 为阳性对照，在干预不同时间分别用茜素红染色鉴定钙化结节形成、 全自动生化仪测碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)活性。结 果 10-8 mol/L乙烯雌酚干预25 天后开始出现钙化结节;10-8、10-7 mol/L乙烯雌酚干预组ALP在14、21 天时显着增加。结论 乙烯雌酚 能促进兔骨髓基质干细胞的成骨分化，并能通过成骨细胞的数量来发 挥骨骼系统的保护作用。 【关键词】 乙烯雌酚;骨髓基质干细胞; 成骨分化Abstract: Objective To observe the effect of diethylstilbestrol on the osteogenic differentiation of rabbit bone marrow stromal cell and to discuss the regulative effect of coumestrol on bonemarrowstromal cells. Methods The present study firstly intervened BMSCs obtained from 1-week-old New Zealand rabbit and presented Diethylstilbestrol (0, 10-10, 10-5mol/L), or Dexamethasone 10-8mol/L, β- Sodium Glycerophosphate 10 mmol/L, vitamin C 50 mg/L for positive control. Then, Calcium nodes were seen bychinalizarin staining. Alkaline phosphatase (ALP) activitywas was detected by automatic biochemistry Analyzer.Results Osteogenic differentiation: BMSCs induced to osteogenesis formed mineralized nodular structures after 25 days in 10-8mol/L diethylstilbestrol group，Cell ALP activity was significantly increased at the 14th and 21th day after being treated with 10-8，10-7mol/L diethylstilbestrol. Conclusions Diethylstilbestrol has an enhancing effect on the proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow stromal cells. Key words:diethylstilbestrol; bone marrow stromal cells; osteogenic differentiation 目前，随着我国逐步进入老龄化社会,老年女性的骨质疏松等疾病的发病率明显上升，究其原因可能与年龄增长后体内激素含量降低有关。然而，激素替代疗法(Hormone replacement therapy，HRT)因激素带来的诸多的副作用，使其在绝经后老年妇女中的应用受到很大的限制。已有研究明:食用富含植物雌激素食物的亚洲人，其乳腺癌、前列腺癌及骨质疏松症等疾病的发病率较白种人低。但是，雌激素骨髓基质干细胞(BMSCs)作用的报道很少。为观察雌激素对骨髓基质干细胞的直接作用，本实验拟通过用乙烯雌酚干预体外培养的兔骨髓基质干细胞，观察其对骨髓基质干细胞成骨分化的影响，初步探索雌激素对骨骼系统的作用及其作用机制。 1 和方法 1.1 主要材料 新西兰长耳白家兔(由辽宁医学院动物饲养中心提供)，LG-DMEM(低糖DMEM，Gibco BRL)，FBS(胎牛血清，杭州四季青)，全自动生化仪，茜素红试剂盒(北京科美东雅公司)，TRIzol(细胞裂解液，Katara Ltd.USA)，胰酶、MTT(噻唑兰)、DMSO(二甲基亚砜)、Diethylstilbestrol(乙烯雌酚)，其余试剂均为国产分析纯。 1.2 细胞培养 1.2.1 提取BMSCs 取1周龄新西兰长耳白家兔，将家兔拉颈处死，75%酒精浸泡10 min，用碘伏消毒，之后无菌条件下取双侧股骨和胫骨，切除两端骨骺，显露骨髓腔。DMEM培养液冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞悬液，用Percoll 分离骨髓中的有核细胞，1 000 r/min离心5 min，再用DMEM洗1 次，收集BMSCs进行原代培养。 1.2.2 BMSCs原代培养 取材成功后，将收集到的纯度较高的BMSCs重悬于含DMEM培养液中，并将细胞悬液以1×106/mL密度接种于50 mL细胞培养瓶，置于37 ?、5% CO2饱和湿度培养箱中培养。原代培养过程中，分别在接种于细胞培养瓶后的8、16、24 h和48 h时用倒置显微镜对细胞的贴壁及生长情况进行观察。原代接种后48 h 进行首次半量换液。以后每隔3,4 天全量换液1次。 1.2.3 BMSCs传代培养 观察培养瓶中原代培养细胞密度，当细胞生长良好并细胞饱和度达 85%,95% 时进行细胞传代培养。首先弃去培养瓶中原有的DMEM培养 液，用无菌PBS平衡盐溶液冲洗两遍。采用 2.5 g/L 胰酶1 mL 进行消化 1 min，待倒置显微镜下观察到细胞贴壁时的伪足回缩，弃去胰酶并加入3 mL DMEM培养基，反复吹打充分分离贴附于培养瓶壁的细胞，按3×103 个/cm2 密度接种于新的细胞培养瓶中进行培养。之后每隔3,4 天进行1次全量换液，并及时进行传代培养。 1.3 观察指标 1.3.1 倒置相差显微镜观察BMSCs细胞形态 BMSCs细胞培养后每日用倒置相差显微镜观察细胞形态变化及生长状况并拍摄照片。 1.3.2 钙化结节染色(茜素红染色) 细胞消化后以2.5×105个/mL接种于50 mL细胞培养瓶，分组同上，干预第25天矿化结节形成后，PBS液冲洗2次，95%酒精固定10 min，蒸馏水洗3 次， 0.1%茜素红-Tris-HCl(pH 8.3)37 ?，30 min。蒸馏水冲洗，干燥，封片。显微镜下观察并拍照，矿化结节呈现桔红色。 1.3.3 ALP检测 细胞消化后以2.5×105个/mL接种于50 mL细胞培养瓶，分组同上，每种浓度重复5瓶，干预7、14、21天后去掉培养上清，PBS清洗2 次，加入0.1% TritonX-100，反复吹打后，1 000 rpm离心3 min，用全自动生化仪测上清液中ALP的含量。 1.4 统计学数据处理 实验结果所得数据采用SPSS 13.0统计学软件分析,数据以均值?标准差表示。多组间比较用单因素方差分析,两两比较用t检验，P0.05为差异有统计学意义。