晚孕蜕膜NK细胞与外周血NK细胞表型变化研究

晚孕蜕膜NK细胞与外周血NK细胞表型变化研究 晚孕蜕膜NK细胞与外周血NK细胞表型变 化研究 一 l148一 文章编号:1007—4287(2OO6)10—1148—03 ChjnJL丑bDia印,October,2OO6,Voll0,No.10 晚孕蜕膜NK细胞与外周血NK细胞表型变化研究 周颖,石永云,凌斌,高婷,王梅梅,姚凤球 (安徽医科大学附属省立医院分子医学研究中心.安徽省分子医学重点实验室,安徽合肥230001) 摘要:目的通过比较晚孕蜕膜NK细胞(dNK细胞)与外周血NK细胞(pNK细胞)表型变化,探讨dNK细胞特异 性标志与母胎界面免疫耐受的关系.方法分别收集晚孕蜕膜组织及外周血各20例,密度梯度离心法分离出淋巴细 胞,流式细胞仪分别检测两组中NK细胞含量及其表面分子CD16,NKG2A,NKG2D表达水平.结果dNK细胞占蜕膜 淋巴细胞39.1?3.9%,pNK细胞占外周血淋巴细胞10.3?3,2%;dNK细胞表面CD16的表达明显低于pNK细胞,两者 分别(10,3?3.9)%与(95.6?2.6)%(P<0.o5),NKG2A的表达明显高于pNK细胞,两者分别为(88.7?5.4)%与(24. 9?7.8)%(P<0.05),NKG2D的表达两者相近,分别为(9O.4?3.9)%与(93,2?3.5)%(P>0.o5).结论晚孕蜕膜 中NK细胞的特殊表型可能是维持母胎界面免疫耐受的重要因素. 关键词:蜕膜;NK细胞;流式细胞术 中图分类号:R392.12文献标识码:A StudyofphenotrpesofdecidualNKcellintermpregnancyandNKcellinperipheralbloodZH OUY'mg,SillYong-yun, LING 成,l,eto1.(AnhuiProvinceKeyLaboratoryofMolecularMedicine,MdecularMedicineResearchCenterofProvincialHospitalof_ f,c~uttoAnhuiMedicalUniversity,Hefei230001,China) Abslraet:ObjectivetoexplorethereLatiomlfipofspeciallllarkel~indecidualNKcell(dNK)withimmunotolerancemecha. nismsatmaternalfetalinterfacebycomparisonofphenotypesofdNKwiththatofpNK(NKcellinperipheralblood)Methodsdecid- ualtissueintermpregnancyof20casesandperipheralblood0f20cwerl~collectedtoseparatethelymphocyte.thecontentsofNK cellandthemarkei~suchasCDI6,NKG2A,NKG2DinNKcellwerl~investigatedbyflowcytomeuy.ResultsThecontentofdNKin deeiduallymphocytewas39.1?3.9%,whilepNKinperipherallymphocyteWaS"10.3? 3.2%:thepercentsofCD16ofdNKwere significantlylowerthanthatofpNK(10.3?3.9%and95.6? 2.6%respectively,P<0.o5);thepercentsofNKG2AofdNKwere siificantlyhiO~erthanthatofpNK(88.7?5.4%and24.9? 7.8%respectively,P<0.05);therewasnOdiffereneeinbetween NKG2DofdNKandNKG2DofpNK(90.4?3.9%and93.2? 3.5%respectively.P>0.05).Conclusionspecialphenotypesof dNKmayplayanimportantroleintheimmunotolexanceatmaternalfetalinterface. Keywords:decidua;NKcell;floweytometry 在人类妊娠中,胎儿是同种异基因产物,它携带 有父系MHC分子,却能抵御母体免疫系统的攻 击…,其中机制至今尚不十分清楚.蜕膜是母体和 胎儿直接接触的界面,其免疫微环境的组成对妊娠 的维持至关重要.NK细胞是蜕膜淋巴细胞的主群 体细胞,在早期妊娠中约占50%一90%l2],其比例 随着妊娠的发展而改变,NK细胞与浸润到蜕膜中的 滋养细胞紧密接触并分泌多种细胞因子调节胚胎生 长发育【3I.基于蜕膜NK细胞(decidualNKcell, dNK)的功能和在胚胎植入早期的大量增殖,推测 dNK细胞的组成及功能状态是影响母胎界面免疫调 控的关键因素.本研究通过比较dNK细胞与外周 血NK细胞(NKcellinperipheralblood,pNK)细胞的 含量及表型变化,进一步揭示dNK细胞特殊的表型 与母胎界面免疫耐受调节机制的关系. ,2OO6,10:1148) (Ch/nJLab脚 1资料与方法 1.1资料来源选取安徽省立医院产科2005年8 月一2006年4月住院的初产妇20例,平均年龄 (26.5?2.7),因社会因素剖宫产获取蜕膜组织,以 排除产程对蜕膜NK细胞性状的影响,所有入选病 例均无内分泌及自身免疫疾病等合并症,3个月内 未用过激素类药物,近期无感染史.外周血选自我 院血库健康女性献血者20例,平均年龄(26.0? 2.6)岁. 1.2主要试剂人淋巴细胞分离液(Ficol1)购自上 海华精生物有限公司,荧光素标记的鼠抗人单克隆 抗体(CD3.CY,CD56.CY,CD56.PE,CD16一FTI?)购自 BDPharmigen公司;荧光素标记的鼠抗人单克隆抗 体(NKG2A—PE,NKG2D—PE)购自R&D公司;FACS检 测仪为BDFACECalibur公司产品. 1O巷第1O 1.3方法 1.3.1蜕膜单个核细胞的分离胎盘,胎膜娩出5 min内,用眼科剪剪取胎盘边缘胎膜组织约5g,置 于盛有RPMI.1640培养液的烧杯中,冰盒内保存,及 时制备单细胞悬液.取出胎膜用1×PBS反复冲洗, 放入盛有RPM[.1640(含5%小牛血清)培养液的平 皿内,手术刀片轻轻将蜕膜从平滑绒毛膜上剥离,眼 科剪剪碎蜕膜至直径1tnm左右,放在100目不锈钢 网上轻轻研磨,过滤收集细胞悬液,Ficol1分离出单 个核细胞,并用1×PBS洗涤2次.2%台酚蓝排除 法测活细胞>90%. 1.3.2外周血单个核细胞的分离取年轻健康女 性献血者外周血20ITll,加入肝素抗凝管中,1×PBS1 :1稀释,Ficol1分离出单个核细胞,并用1×PBS洗 涤2次.2%台酚蓝排除法测活细胞>9o%. 1.3.3流式细胞术检测细胞表面分子取单个核 细胞悬液100(约5×lo4—1×lo5个细胞)分装至 1.5ITllEP管中,每管分别加入1O小鼠血清,以阻 断FC受体(空白对照管除外),4?避光放置30min. 加入相应抗体各2l标记CD3一CD56,CD56 CD16,CD56NKG2A,CD56NKG2D亚群.4? A C 一 1149一 避光放置30min,1×PBS洗涤2次后,加入200tLl PBA(PBS+0.5%叠氮钠)重悬细胞,上机检测.上 机前先以标准微球调整仪器,使变异系数在2%以 内,上机后收集5000个细胞,荧光强度以对数放 大,光散射数据存软盘,用WinMDI29软件程序分 析数据并打印结果.分别设置空白对照管(只有单 细胞悬液)和单标管(单细胞悬液+相应的单色荧 光克隆抗体). 1.3.4统计学方法采用SPSS10.0软件进行t检 验,P<0.05有统计学差异. 2结果 与外周血相比,蜕膜中dNK细胞占蜕膜淋巴细 胞39.14-3.9%,pNK细胞占外周血淋巴细胞10.3 4-3.2%;dNK细胞与pNK细胞表型差异明显,dNK 细胞表面CD16的表达明显低于pNK细胞,两者分 另4(10.3?3.9)%与(95.6?2.6)%(P<0.05), NKG2A的表达明显高于pNK细胞,两者分别为 (88.74-5.4)%与(24.94-7.8)%(P<0.05),NKG2D 的表达两者相近,分别为(90.4?3.9)%与(93.2? 3.5)%(P>0.05).见表1及图1. B D 图1dNK与pNK细胞含量及表面分子CD16,NKG2D,NKG2A表达水平流式图 A,B,C,D分别代表CD3,CD56,crr-~6,C1)16,CD56NKG2A,CD56AKG2D占蜕膜及外周血淋巴细胞百分率流式图.CD56+ CD16与CD3.CD56的比值代表AK表面CD16表达率以此类推NKG2D,NKG2A 的表达率. 3讨论 Starkey和King首次发现妊娠子宫有大量NK细 胞,其特殊分布状态和功能使人们认识到子宫NK 细胞可能参与了胚胎植入和母.胎界面免疫平衡状 一 ll50一 表1dNK细胞pNK细胞含量 及其表面分子的表达比较(?) 态维持l4J.尽管目前对这个过程中许多环节尚不十 分清楚,但已初步证实,子宫NK细胞与妊娠密切相 关.dNK细胞是妊娠子宫中数量最多的免疫细胞, 它分布于母体与胚胎接触的蜕膜,直接识别胎儿抗 原,推测dNK细胞在母胎界面免疫耐受中发挥重要 作用.CD16是NK细胞表面特异性受体,与相应配 体结合后诱导NK细胞的细胞毒作用,分泌穿孔素 和颗粒酶,裂解靶细胞,并通过Fas—FasL途径诱导靶 细胞调亡l引.本研究通过流式细胞术发现dNK细 胞以CD56CDI6一(约9o%)表型为主,有别于外周 血中以CD56CDI6(约95%)为主,提示dNK细胞 处于低杀伤活性状态,该状态的NK细胞显然有利 于妊娠的正常维持.本研究还发现dNK细胞高表 达NKG2受体,此类受体家族绝大多数胞外区都有 一 个C型凝集素样结构域,因此也称为C型凝集素 受体家L6J.NKG2A是NKG2受体家族中的抑制性受 体,通过二硫键与CD94形成异二聚体,CD94/ NKG2A能特异性结合非经典的HLA—I类分HLA— E,传递抑制信号抑制NK细胞的杀伤活性【.dNK 细胞NKG2A的表达水平为(88.7?5.4)%,明显高 于pNK细胞(24.94-7.8)%,由于滋养细胞表面高表 达HLA—引,推测dNK细胞表面的NKG2A与滋养细 胞表达的HLA—E特异性结合,传递抑制性信号抑制 dNK的活化,阻止其对滋养细胞杀伤.NKG2D对 NK细胞有较强的活化作用,它能自身形成二聚体, 通过与配体MICA/MICB结合,在多肽DAP10的介导 下激活NK细胞的杀伤活性L9J.NK细胞通过 NKG2D受体介导的杀伤作用依赖于靶细胞表面 NKG2D配体MICA/MICB的表达L1..,由于滋养层组 织中并未发现其相应配体MICA/MICB的表达[11], 因此,推测dNK细胞高表达的NKG2D(90.4?3.9%) Ch-nJI丑bDia~n,~tober,2O06,Voll0.No.10 不能传递活化信号,从而难以诱导dNK对滋养细胞 的杀伤. 总之,妊娠是一个极为复杂的生理过程,胚胎能 够顺利植人避免母体免疫系统的攻击,其中必定存 在着特殊的免疫调节机制,只有揭示正常妊娠机理, 才能更好的探讨病理妊娠的发生机制,因此母胎界 面免疫微环境的研究已成为生殖医学的热点之一. 本研究通过对dNK细胞与pNK细胞表型变化进行 比较,揭示出dNK细胞特殊的表型可能是维持母胎 界面免疫耐受的重要因素. 作者简介:周颖,女,31岁,硕士,助理研究员.研究方向:肿 瘤分子免疫学. 参考文献: [1]Billin/~lanlRE,BrentL,MedawarPB.Activityacqui~toleranceoffor— eigncells[J].Nature,1953,172(4379):603. [2]Moffcn—KingA.Naturalkillercellsandpre~aney[J].NatRevlro— munol,2002,2(9):656. 【3]ParhamP.NKcellsandtrophoblasts:partnel~inpregnancy[J].F2cpMe【i. 2004.200(8):951. [4]赵丽丽,王俐.妊娠子宫NK细胞的功能研究进展[J].现代免 疫学,2005,25(1):85. 【5]HillJA,MellingGC,ohnsonPM,eta1.Imrounohistochenficalstudiesof humanuteroplaeentaltissuesnfirsttrimesterspon~eousabortion[J]. AMJObstetGynecol,1995,173(1):90. [6]GriffimFM,FujitaTO.Thefunctionalstudiesofhighh,~munitybloodliq— u~dEJ]VetSci,1984,48(4):519. [7]GarridoF,Ruiz—CabelloF,CabreraT,eta1.Implicationsforinmauno— surveillanceofaltered?AdassIphenotypesinhunumtumours[J].1m— munolToday,1997.18(2):89. [8]AlT,JaronsseanAC,WarierH,eta1.Trophoblastcelllineresistanceto NKlysismainlyinvolvesan?Adass1-independentmechanism[J].1m— nlunol,1999,162(10):5902. 19]JiangK,ZhengB,GilvaryDL,eta1.Pivotalroleofphesphoinesitide- 3kinasein;ul"onofcytotoxieityinnaturalkillercells[J].Natlm— munol,2OOO,1(5):419. [10]HueS,MentionJJ,MonteiroRC,eta1.AdirectroleforNKG2D/M1CA interactioninvillousatomyduringceliacdisease[J].Inmaunity,2004, 21(3):367. [11]池永斌,范丽安.激活性受体NKG2D研究进展[J].现代免疫学, 2O04,24(2):169. (收稿日期:2006—03—08)