脐带血干细胞制备的检测分析

脐带血干细胞制备的检测 脐带血干细胞制备的检测分析 ? 528?检验医学与临床2012年3月第9卷第5期IabMedClin,March2012,Vo1.9,No.5 脐带血干细胞制备的检测分析 任娜,朱荔青,赵威,邱广斌?(解放军第二.二医院检验科,沈阳110003) ? 论着? 【摘要】目的对脐带血干细胞制备进行检测,为临床安全,有效地应用提供依据.方法测定母体和脐带血 标本的人类免疫缺陷病毒(HIV),乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg),丙型肝炎病毒(HCV),梅毒螺旋体(TP),巨细 胞病毒(CMV),内毒素,支原体和病原微生物.应用体外分离纯化试剂盒,分离干细胞,计数提取后单个核细胞数, 经台酚兰染色检测干细胞活力.应用流式细胞仪检测CD34千细胞,淋巴细胞亚群.结果提取后有核细胞数为 (5.4_--4-1.09)×10,脐血的量和提取干细胞数成正相关.干细胞活力检测分离的活性率为(98.7?1.3).流式细 胞仪测得脐血干细胞CD34为(1.55?0.67)(n一19).淋巴细胞亚群检测结果显示,脐血CD3细胞数较少,CD4 和CD8细胞数之和明显高于CD3细胞数,且选择脐血CD4/CD8小于1.3,这也是脐血移植时GVHD表现轻微的 一 个重要原因.结论脐血干细胞制剂的制备,符合细胞治疗的相关安全性指标. 【关键词】脐血;干细胞;人类免疫缺陷病毒;乙型肝炎病毒表面抗原 DOI:10.3969/j.issn.1672-9455.2012.05.008文献标志码:A文章编号:1672-9455(2012)05—0528—03 Measurementandanalysisofunrelatedumbilicalcordbloodtransplantati0nRENNa,ZHUL i—qing,ZHAoW, QUGuang-bin(DepartmentofClinicalLaboratory,PLA202Hospital,Shenyang110003,China) [Abstract]ObjectiveTopreparethecordbloodstemcellforprovidingthebasisforeffectiveandsafeclinical application.MethodsMaternalandcordbloodsamplesofHIV,HBsAg,HCV,TP,CMV,endotoxin,mycoplasma, cytomegalovirus,pathogenweredetected,andstemcellswereisolatedbypurificationkitinvitro.Thenstemcellsthe numberofmononuclearcellswerecountedafterextraction.DynamicofstemcellswasdetectedbyTaiwanphenol bluestaining.CD34stemcellsandlymphocytesubsetsweretestedbyflowcytometry.ResultsThenumberofnucle— atedcellswas(5.4?1.O9)× 10afterextraction,plusthenumberofstemcellshadpositivecorrelationwithcord bloodvolume.Dynamicrateofstemcellswas(98.7? 1.3).CD34cordbloodstemceilswas(1.55?O.67)(n 一 19).TherewerefewerCD3cellsincordblood.TotalcellsnumberofCD4andCD8wassignificantlyhigherthan CD3.CordbloodCD4/cD8selectedumbilica1cordbloodtransD1antati0nwasalsolessthan1.3,whichcausedmild symptomofGVHD.ConclusionPreparationofcordbloodsterncellcanaccordwithsafestandardforeel1therapy. [Keys]umbilicalcordblood;stemcell;HIV;HBsAg 干细胞是人体及其各种组织细胞的最初来源,具有高度自 我复制,增殖和多向分化的潜能.在特定的生理或实验条件 下,能够分化成机体器官和组织的特定功能细胞,干细胞按其 来源分类可以分为外周血干细胞,骨髓干细胞和脐带血干细 胞.与骨髓和外周血相比,脐带血具有来源丰富,细胞免疫性 低,再生能力强,病原体感染可能性小,移植物抗宿主病 (GVHD)的发生率低等优势l_1].脐血除造血干/祖细胞外,还 存在其他多种干/祖细胞,包括间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSCs),内皮前体细胞(endothelialprogenitorcells, EPCs)和非限制性体干细胞(unre—strictedsomaticstemcells, USSCs)等_2],因此脐带血干细胞具有极大的临床应用价值, 而为达到临床治疗的标准,对干细胞制备相关的检测分析则具 有重要意义. 1材料与方法 1.1仪器与试剂人类骨髓,脐带血干细胞/祖细胞体外分离 纯化试剂盒(沈阳赛欧生物工程有限公司),二联采血袋(CP— DA抗凝),低温离心机.梅里埃全自动细菌培养仪和配套标 准的血培养瓶,Sysmex-2100全血细胞分析仪,FACSCalibur 流式细胞仪,MultiTESTIMKKitCD3/CD8/CD45/CD4, 通讯作者,E—mail:qiuguangbin@163.com. CD3/CD1656/CD45/CD19试剂;CD34造血干细胞检测: CD34一PE/CD45一FITC/MouseIgG1一PE. 1.2脐血干细胞制备采用四联采血袋(CPDA抗凝)封闭式 收集第3产程剖宫产的新生儿脐血.产妇无内科及产科并发 症,产前病原体检查阴性肝功能正常,产妇夫妇双方无遗传病 及家族病史.应用人类骨髓,脐带血干/祖细胞体外分离纯化 试剂盒,分离干细胞.将A,B液与脐血4:1混匀,静置沉降 30min分层后,吸取上清液,置于离心管中,经低温2500r/ min离心5min,弃上清液.用医用生理盐水制成单细胞悬液 铺在c液层,1800r/min离心30min,吸取云雾状的细胞悬液 层,离心,洗涤3次,即得干细胞.依据临床需要调整剂量.常 规检查合格后,将干细胞制剂送往手术室行干细胞移植术. 1.3病原微生物的检测母体和脐带血的乙型肝炎病毒表面 抗原(HBsAg),丙型肝炎抗体(抗一HCV),巨细胞病毒抗体(抗一 CMV),人类免疫缺陷病毒抗体(抗一HIV),梅毒螺旋体(TP)等 病原微生物检测;分离纯化的脐血干/祖细胞,进行无菌试验, 内毒素测定,支原体检测,巨细胞病毒等检测.细菌学检查:干 细胞制剂制备完成后,用全自动细菌培养仪和配套标准的血培 养瓶进行真菌和细菌检测. 检验医学与临床2012年3月第9卷第5期LabMedClin,March2012,Vo1.9,No.5 1.4细胞计数用SYSMEX-2100全自动血细胞分析仪,测 定脐血的白细胞(WBC),红细胞(RBC),血红蛋白(Hb),NR— BC,中性粒细胞百分比,淋巴细胞百分比,单核细胞百分比. 另用HPC模式,计数提取干细胞后单个核细胞数. 1.5干细胞活力检测将9OL的细胞悬液和1OL的 0.4台酚蓝溶液充分混匀静置5rain,微量加样器取1O混 合液,沿计数板边缘加样.200倍显微镜下计数1O个大方格, 分别记录活细胞和死细胞数,根据公式计算细胞活力,即活细 胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100. 1.6脐血CD34干细胞计数调整样本浓度为2×10cells/ mL;在FALCON管加入100L抗凝全血;加入对照管 cD45一FITC,Mouse-T1一PE抗体,试验管cD45一FITC,CD34, PE抗体各1OL,混匀,室温避光反应15rain)加入溶血索应 用液2mL,混匀,室温避光反应10rain)300r/min离心,弃上 清液;PBS洗两遍;用FACsCa1ur流式细胞仪,检测CD34与 CD45双荧光染色,结合前向角散射光与侧向角散射光两个参 数(FSC/SSC),来识别表型CD34bright/CD45dim/侧向角散射 光低的造血干细胞. 1.7脐血和干细胞的淋巴细胞亚群检测取5OL脐带血或 干细胞提取液,加入Trucounttube中,取2OL四色标记的抗 体,加入Trucounttube中,混匀,室温避光放置15min.取出 加入450"L1XFACS溶血素避光放置15min.上FACSCali— bur流式细胞仪检测CD3,FITC/CD16CD56一PE/CD45一 PerCP/CD19一APC,检测成熟T淋巴细胞亚群(CD3/CD4, CD3/cD8),NK细胞(CD3一CD16CD56),B淋巴细胞亚群 ? 529? (CD3一CD19'.). 1.8统计学方法数据均以i?表示,采用SPSS软件进行 统计学分析,采用t检验,P<O.05为差异有统计学意义. 2结果 2.1干细胞制剂安全性相关检测脐血在手术当天以剖宫产 方式取得,保证无菌足量.母体和脐带血标本HIV,HBsAg, HCV,TP,CMV,无菌试验,内毒素测定,支原体检测,巨细胞 病毒检测均为阴性,病原微生物指标检测全部合格.未发现细 菌,真菌的污染.参照美国治疗性细胞的制备标准,制备出的 干细胞经安全性评估达到良好效果,能提供符合国际标准的治 疗性细胞. 2.2细胞数检测选择脐血量大于90mI("-二25)进行SYS— MEX-2100全血细胞分析仪检测,提取后有核细胞数为(5.4? 1.09)×10,脐血的量和提取干细胞数成正相关.脐血移植所 需的最低细胞数量至今仍没有统一标准,2006年欧洲脐血移 植协作组建议单份脐血移植安全最低的有核细胞数为3× 10/kg. 2.2.1干细胞活力检测细胞经台酚兰染色后,显微镜下可 见活细胞胞质和胞核透亮,而死细胞胞核蓝染.在镜下分别计 数活细胞数和细胞总数,分离的活性率为(98.7?1.3). 2.2.2脐血干细胞的CD34检测用FAcSCalihur流式细胞 仪,检测CD34与CD45双荧光染色,结合前向角散射光与侧向 角散射光12个参数(FSC/SSC),来识别表型CD34bright/ CD45dim/侧向角散射光低的造血干细胞.测得脐血干细胞 CD34为(1.55?0.67)(一19). 表1脐血和提取干细胞后淋巴细胞亚群{?S) 注:脐血与提取后比较,P>O.01. 2.2.3淋巴细胞亚群检测本资料显示,脐血CD3细胞数较 少,CD4和CD8细胞数之和明显高于CD3细胞数.说明脐血 T细胞表型不成熟,抑制作用占优势,脐血抑制性占优势的 CD4细胞,是胎儿预防母体淋巴细胞性GVHD的生理性防御 机制,以及新生儿易患感染的细胞免疫学基础.供体周围血中 CD4/CD8大于1.3,很容易发生移植排斥反应.本研究选择 脐血CD4/cD8小于1.3,这也是脐血移植时GVHD表现轻微 的一个重要原因.脐血和提取干细胞后的淋巴细胞亚群各项 指标比较,差异元统计学意义(P>0.01). 3讨论 在脐血干细胞移植中淋巴细胞亚群检测十分重要.T淋 巴细胞是机体最重要的免疫细胞群,在正常机体内各T淋巴 细胞亚群相互作用维持着机体的正常免疫功能.T淋巴细胞 是细胞免疫介导的抗真菌,病毒和原虫感染所必需的.T淋巴 细胞主要包括两个亚群——CD4T细胞和CD8T细胞.从 免疫表型来看,移植后CD4T细胞主要是抗原预激细胞(记 忆和效应T细胞)而非新生儿期的淋巴细胞发育过程中的初 始T细胞,移植后CD8T细胞迅速上升,主要是记忆和效应 细胞,大部分CD8T细胞为抑制,无能或终末分化细胞的表 型,这些表型特征提示抗原预激细胞增加,而非初始细胞数量 的扩增.此外,CD8T细胞的恢复对阻止病毒所致的严重感 染至关重要.在T淋巴细胞亚群中,CD4/CD8的数量和适 当的比例是免疫调节的关键.CD41.细胞,CD8细胞彼此相互 调节,能表现辅助和抑制的作用,是免疫系统的核心.因此 CD4/CD8'.的比值常被临床上作为评估机体免疫状态的指 标[6].自然杀伤细胞(NK)细胞是造血干细胞移植(hemato— poieticstemcelltransplantati.n,HSCT)后早期发挥抗病毒免 疫和移植物效应的主要细胞亚群. 造血干/祖细胞(HSCs/HPCs)具有高度的自我更新能力 或自我复制能力,和进一步分化为各系祖细胞及成熟血细胞的 能力.HSCs常以CD34为标记区分为CD34细胞群和 CD34一细胞群,其中CD34细胞群占95以上,而CD34一细 胞群不到5,HSCs/HPCs是脐带血中含量最丰富的一种于/ 祖细胞,这也是目前脐带血临床应用的细胞基础].除HSCs 外,脐带血中还可分离出其他多种干/祖细胞,问充质干细胞具 有低免疫原性,还具有免疫调节作用,在一定条件下具有向脂 肪细胞,心肌细胞,成骨细胞,肝脏细胞,神经细胞等多向分化 的能力.间充质干细胞(MSC)能抑制T细胞的增殖,其机制 主要包括:细胞一细胞接触和MSC分泌的细胞因子介导.最近 有研究表明MSC影响T细胞对病原体的反应并不明显,但能 ?530?检验医学与临床2Ol2年3月第9卷第5期 LabMedClin,March2012,Vo1.9,No.5 显着抑制T细胞对同种异体抗原的反应.此外,MSC能调节 B细胞的增殖,存活,抗体分泌和分化,能抑制树突细胞(DC) 的生成,增殖,抗原呈递和迁移能力,调节DC的分化,成熟,能 调节NK细胞增殖,细胞毒和分泌细胞因子的功能.所以淋巴 细胞亚群的检测在脐血和干细胞提取后,以及病情的监测中具 有重要意义. 干细胞治疗是需要多科室合作的新兴治疗技术.临床科 室需要进行病例的选择和实施,而干细胞制备和相关检测均在 检验科完成.美国AABB制定的细胞治疗相关安全性指标包 括相关病原微生物检测,无菌实验,内毒素测定,支原体检测, 免疫表型等.脐血干细胞移植成功的标志是免疫功能的重建, 那么对淋巴细胞亚群的检测也具有重要意义.干细胞移植后 的结果受多种因素影响,受者因素包括病种,年龄,预处理强 度,宿主微环境,药理学干预等,供者因素中重要的是输入细胞 量.因此,为了保证脐带血干细胞在临床中更广泛的应用,更 好的疗效,须对相关的检测进行进一步研究和. 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