牛血清白蛋白的抗血清在免疫学沉淀反应实验中的应用_cropped

牛血清白蛋白的抗血清在免疫学沉淀反应实验中的应用_cropped () 摘要 目的 :制备牛血清白蛋白 BSA抗血清 ,以探讨获取高效价抗血清的 。方法 :用 BSA 配制一定的浓 度 ,免疫家兔 ,以制备兔抗 - BSA 血清 。利用免疫电泳 、双向琼脂扩散试验分析和测定抗血清的效价 。结果 : 双向琼脂扩散在 BSA 015g/ mL 的浓度时 ,测得抗血清效价为 1?32 , 对流免疫电泳结果显示 BSA 015g/ mL 与抗 BSA 在 1?16 时形成一条清晰可见的沉淀线 。结论 :BSA 免疫家兔可获取效价较高的抗血清 。 () 关键词 牛血清白蛋白 BSA效价 沉淀线 免疫 () 中图分类号 : R39217 文献标识码 :A 文章编号 :1001 - 7585 200503 - 0254 - 02 Application of Antiserum of Bovine Serum Albumin in Immunoprecipitation Reaction Experiment CAI Lingfei. Medical School , Hangzhou Teachers’College , Hangzhou city Zhejiang Province 310012 () ABSTRACT Objective : To prepare antiserum of bovine serum albumin BSAfor obtaining high titer antiserum. Meth2 ods : The serum of anti - BSA was prepared by immunizing rabbits with BSA. The titer of antiserum was detected by immu2 noelectrophoresis and double immunodiffusion. Results : The titer of antiserum was 1 : 32 in double immunodiffusion and ( counter immunoelectrophoresis showed a clear precipitation line in the ratio 1 : 16 for BSA : anti - BSA all at 0. 5g/ ml ) BSA. Conclusion : The higher titer of antiserum is obtained by immunizing rabbits with BSA. () KEY WO RDS Bovine serum albumin BSA,Titer ,Precipitation line , Immunity ( ) () 113 弗氏完全佐剂 Frenud的制备 石腊油 40mL , 可溶性抗原 如血清 、细菌浸出液 、外毒素等和 相应抗体结合 , 在适量 电 解 质 存 在 下 , 经 过 一 定 时 无水羊毛脂 10g 左右 ,经 15 镑 20min 高压灭菌制成 间 ,在二者比例适当时形成肉眼可见的沉淀物 。可 () 混悬液 ,加卡介苗 1 支 75mg/ mL,用前在 80 ?水浴 ( 分环状沉淀试验 ,絮状沉淀试验 ,琼脂扩散试验 单 中加热 1h ,将菌杀死 。 1 ( ) ) 向琼脂扩散试验 、多向琼脂扩散试验,免疫电泳。 114 主要仪器 1水平离心机 ,LD5 - 3A 型 。北 由于沉淀反应抗原多系胶体溶液 ,沉淀物主要是由 () 京医用离心机厂生产制造 ; 237 ? 温箱 , HH - 400 抗体蛋白所组成 ,制备可溶性抗体的物质有很多 ,但 () 型 ,北京医疗器械厂生产 ; 3电泳仪 。DYY - 6B 型 处理的方法繁琐或价格昂贵 ,并且效价不高 。因此 ,稳压稳流电泳仪 ,北京六一仪器厂制造 。 寻找简单 、快速 、易操作的方法提供给教学单位实际 115 免疫动物的方法及途径 () 应用具有重要的现实意义 。在免疫学的教学中 ,沉 11511 试验动物 :家兔 12 只,无免疫接种史 ,体重淀反应是必不可少的 ,而在本科学生中此实验的操 210,215kg ,雌雄并用 ,由杭州师范学院医学院动物 作又必列其中 。目前市场上生物制品缺乏某种可溶 室提供 。采用皮下多点免疫法 ,牛血清白蛋白浓度 性抗原与可溶性抗体的配备供应 ,且价格昂贵 。为 为 40mg/ 兔 。 2 了节约经费 ,使用方便 ,提高实验课的教学质量 ,笔 11512 福氏完全佐剂抗原的制备: 取羊毛脂 、石 () 者采用牛血清白蛋白 BSA免疫家兔 , 以获取较高 腊油为 1 ?4 , 1 ?6 混 合 后 高 压 灭 菌 , 与 等 体 积 的 的 BSA 的抗血清 ,现将方法介绍如下 。 20mg/ mL 牛 血 清 白 蛋 白 混 合 , 并 按 1mL 加 0125 , 1 材料与方法1mg 卡介苗加入研钵中共同研磨使之成为油包水的 ( 111 BSA 抗原的制备 牛血清白蛋白 Bovine Serum乳液 。 3 ) Albumin ,BSA,批号为 0204 ,由杭州华美生物工程公 11513 免 疫 方 法: 首 次 取 福 氏 完 全 佐 剂 抗 原 液司提供 。实 验 时 以 无 菌 生 理 盐 水 配 制 成 20mg/ mL 2mL/ 只兔 ,四足趾注射 ,约每点 015mL ,5d 后 ,取同剂 () 浓度的应用液 ,4 ?冰箱保存备用 。 量不完全佐剂 不加卡介苗抗原液作脊部 、颈部皮 下 、腹股沟等处皮下多点注射 。2 周后于双侧后肢肿112 进口琼脂粉 由杭州华美生物工程公司提供 。 3( 118 对流免疫电泳 大的腋窝淋巴结内各注入 1mL BSA 抗原制剂 ,第 3 、1 %琼脂糖 用 p H816 , 将 ) 5 、7 周 按 上 述 方 法 再 次 在 兔 的 背 部 皮 内 注 射 抗 原0105mol/ L Tris - 巴比妥缓冲液配制5mL 铺于干净 ( ) 的玻片上 厚约 115mm, 待凝固后 , 用打孔器成 2mL ,末次注射 2 周后 ,自兔耳静脉采血测试效价 ,若 () 对打孔 , 孔 径 3mm , 孔 间 距 3mm , 排 距 8mm , 在 效价不够高 ,可用不加佐剂的抗原 20mg/ mL通过耳 ( 静脉 以 加 强 免 疫 , 1 周 内 注 射 3 次 , 分 别 为 011mL 、 孔中分别加入 015g % BSA 抗原和 BSA 抗血清 作 ) 013mL 、015mL ,1 周后再次采血测试效价 。在收获免 系列稀释1?2 、1?4 、1?8 、1?16 、1?32, 在电场中 () 疫血清前 ,应测定抗体效价 ,若效价在 1?16 以上即可 电泳 30min 5v/ cm, 观察结果 。 达到要求 ,应及时采血 ,否则抗体将会下降 。 2 结果 3116 双相琼脂扩散法 在每块干净的玻片上铺双向琼脂扩散法 BSA 抗血清效价在 1?32 出现 ( 清晰的白色沉淀线 。对流免疫电泳在 1?16 出现清 5mL 115 %琼 脂 生 理 盐 水 配 制 , 内 含 1 ?1000 叠 氮 ) ( ) 钠,约 115mm 厚 ,凝固后打孔 直径 3mm, 孔间距晰的沉淀线 。单向琼脂扩散沉淀圈直径与抗原浓度 μ() 10mm ,中心孔加 10L 抗原 015g % BSA,周围孔内 成比例关系 , 从而可以定量测出抗原含量 。 μ( 每孔加 10L 抗 血 清 作 系 列 稀 释 1?2 、1 ?4 、1 ?8 、 3 注意事项 ) () ( ) 1?16 、1 ?32 、1 ?64 , 将 玻 片 置 于 湿 盒 内 , 36 ?扩 散1电泳时电流不宜过大 , 以免蛋白质变性 。 2 () 24h 。结果 : 在抗血清效价为 1 : 32 出现一条完全融 抗原 、抗体的电极方向不能放反 。3抗原 、抗体 相对浓度要适当 , 抗原太浓或太稀都不易出现沉淀 合的沉淀线 。 3( ) 117 单向琼脂扩散法 取一块干净的玻璃片 ,将线 。 4电泳所需时间与孔间距离有关 , 距离越 ( 大 , 电泳时间越长 。已融化并在 56 ?水浴中保温的 3 %琼脂 用 0101mol ) p H 7141 磷酸盐缓冲液配制中加入 BSA 抗血清 ,二 4 讨论 者等量混合 ,此时抗血清的浓度为 1 ?80 , 琼脂浓度 BSA 抗血清作为一种免疫学试剂 , 应用于免疫 () 为 115 % 。充分混匀后取 6mL 铺在玻璃片上 图 1, 学沉淀反应中具有特异性强 、纯度好 、效价高 、成 ( ) 待凝固后打孔 直径 3mm, 孔间距为 1 . 2,115cm , 本低 、操作简便等优点 , 达到实验的要求 。在实验 挑出孔内 琼 脂 。将 015g %BSA 用 PBS 作 系 列 稀 释 时加样应加满小孔但不能溢出 , 扩散时间要适当 , ) (μ1?2 、1?4 、1?8 、1?16加入孔中 ,每孔约 10L ,将玻片 时间过短 , 沉淀线不能出现 ; 时间过长 , 会使已形 成的沉淀线解离或散开 。抗血清易被细菌污染 , 所 置于湿盒内 ,36 ?扩 散 24h , 测 出 各 孔 沉 淀 环 直 径 。 以各种稀释度标准抗原的沉淀环为纵坐标 ,相应孔 以使用的各种器材 、用具要彻底清洗和消毒 。为了 ( ) 中 BSA 含量为横坐标 ,绘制标准曲线 图 2,沉淀圈 保持抗血清效价 , 所收集的抗血清必须进行小量分 ( ) 直径与抗原浓度成比例关系 ,从而可以定量测出抗 装及置低温 - 20 ?冰 箱 保 存 备 用 。结 果 证 明 , 原含量 。 BSA 用于免疫学沉淀反应试验可取得较高的抗血清 效价 , 并且自制的抗血清不需要耗费太多的材料 , 可为学生节约实验经费 , 实验效果又好 , 还可以保 证学生的安全 。 参 考 文 献 1 余贺 , 谢少文 , 杨桂贞 , 许以平 , 编著. 临床免疫技术. 上海 : 上海科学技术出版社 , 19821231图 1 单向琼脂扩散试验 2 蔡玲斐 , 袁红 , 史丽云 1 两种淋球菌抗血清制备及效价的观察. 杭州医学高等专科学校学报 , 1998 , 2 : 31 - 321 3 朱立平 , 陈学清 , 主编. 免疫学常用实验方法. 北京 : 人民军 医出版社 , 2000176 - 811 收稿日期 2004 - 09 - 09 ()编辑 太行