人类乳头瘤病毒（HPV）的检测方法

人类乳头瘤病毒（HPV）的检测方法 人类乳头瘤病毒(HPV)的检测方法 ? 4270?现代预防医学2007年第34卷第22期ModemPreventiveMedicine, 2007.Vo1.34,NO.22 文章编号:1003—8507(2007)22—4270—02中图分类号:R446.5文献标识码:A 人类乳头瘤病毒(HPV)的检测方法 井明霞,陈继明,郭晓青,张金莉,芮东升. |?美链人粮赢舞窀甄瑰埝菠毡| 宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一.占女性生殖系统恶 性肿瘤的半数以上.严重威胁着妇女的健康.全世界每年大约 有46万人患病.中国新发病例约计13万,占目前已发现的所 有女性肿瘤的6%.是仅次于乳腺癌而引起妇女癌症相关死亡 的重要原因.宫颈癌的发病机理目前尚不清楚.但已有很多研 究,99%的宫颈癌组织中可检出人乳头瘤病毒(human pap~omavirus,HPV).目前,已经明确HPV感染为宫颈 癌前病变和浸润性宫颈癌发生的必要条件?.大量研究资料 明,HPV与宫颈癌及癌前病变密切相关,高危型HPV (HRHPV)感染与宫颈癌关系最为密切[53.随着病变程度的加 重.HPV的检出率也逐渐增高『6].所以,许多专家提出将HPV 的检测作为宫颈癌的一种筛查手段.目前,针对HPVDNA检 测作为宫颈癌原始筛查方法以及与细胞学联合在筛查中的意义 的研究报道较多[7-10~.本文将就HPV检测方法的相关内容进行 小结.重点介绍目前应用最为广泛的PCR法和杂交捕获试验. 由于HPV至今尚不能在体外培养.又无合适的实验动物. 因而对其检测主要依赖于形态学方法和分子生物学技术.目前 HPV检测方法主要有细胞学法,斑点印迹法.荧光原位杂交 法.Southem杂交法.多聚合酶链反应(PCR)法和杂交捕获 法等.细胞学法敏感度和特异度较低;斑点印迹法具有放射 性.目前较为公认的敏感度和特异度高的方法是捕获2代法; 其他敏感度较高的方法有原位杂交,PCR法.但PCR法特异 度很低,假阳性率较高;而核酶印迹原位杂交法复杂,不宜大 规模I临床使用. 1细胞形态学检测 宫颈HPV阳性细胞的特征性改变是出现了特异性挖空细 胞.初期在表层出现.当不典型增生达2/3以上时.挖空细胞: 减少,此时表现为低分化鳞癌的形态特点.感染HPV16,18 的宫颈上皮阳性为中层挖空细胞核出现了密集浓染的蓝紫色颗 粒产物.从慢性宫颈炎一宫颈上皮内瘤变(CIN)一宫颈癌 (CaCx),HPV杂交信号渐强,由上皮表层到棘层,分布呈散 在一簇状一弥漫状. 2免疫组织化学法 用SP法染色测HPV16,18早期蛋白E6单抗能有效证明 感染组织中存在的E6蛋白.阳性标志为核内出现棕黄色颗粒. 作者简介 作者单位 井明霞(1969一),女,博士研究生,石河子大学科技处副 处长,副研究员,研究方向:肿瘤流行病学 1.新疆石河子大学科技处,石河子,832003;2.新疆石河 子大学医学院附属医学;3.新疆石河子大学医学院 【综述】 研究表明抗HPV16E6单抗可直接定位于宫颈癌组织.对宫颈 癌有较好定向选择性.有可能作为人宫颈癌放射免疫显影诊断 的载体. 3基因扩增技术 3.1人乳头瘤病毒DNA的多聚合酶链反应扩增 评价HPV检测方法最关键的凶素是检测灵敏度,以基因 扩增为基础检测HPVDNA.是目前最灵敏的检测方法,呵检 测出低水平的病毒感染.并且能够比较准确地对HPV感染状 态进行分类.因此成为实验室和流行病学研究的理想工具.但 是,由于基因扩增过程中污染造成的假阳性及技术成本高,目 前不宜作为I临床实验室HPV感染的常规检测. 3-2荧光定量多聚合酶链反应技术 荧光定量多聚合酶链反应(FQ—PCR)是1995年由美罔 PerkinFlmer公司研制成功的一种新型核酸定量检测方法.该 法将普通PCR的高灵敏性,DNA杂交的高特异性和光谱技术 的高精确性有机结合,克服了传统PCR在许多方面的缺点和 局限性.由于荧光探针的引入.而且被释放的荧光基团数目与 PCR产物数量相同.使得该方法对DNA模板定量的准确性与 特异性都有很大提高.常用的PCR扩增仪与传统PCR扩增仪 相比,应用更广泛,定量测量,检测效率明显提高,扩增产物 无需电泳分析,无管道内污染及结果重复性好等特点.由于 HPV一16型特异引物可与HPV66型模板DNA发生错配.传统 PCR法扩增时.常对两者的扩增产物不易区分而造成HPV16 假阳性结果,但应用FQ—PCR技术,HPV66型DNA不能扩 增,从而增强了HPV分型检测的特异性.此外,FQ—PCR技 术检测HPV感染的敏感性较传统PCR法增高,当 HPV16,18,31,33,35亚型含量平均为1拷贝基因组/300 个细胞时.即可用此法检测到. 4杂交俘获试验 4.1第1代杂交俘获试验 为克服基因扩增技术的不足,几年前美圉Digene公司开 发出一种新的HPVDNA检测技术一第l代杂交俘获试验 (hybridcapturetest—I.HC—I).其原理是利用对抗体捕获佶 号的放大和化学发光信号的检测.HC—I不需要基因扩增,利 用两套单链全长RNA混合探针,可以检测5种低危型HPV (6,11,42,43,44)及9种高危型HPV(16,18,31, 33,35,45,51,52,56).理论上检测灵敏度是50000个 HPVDNA拷贝.经过临床试验评价,HC—I检测灵敏度低于 PCR及其他基因扩增技术,但其特异度和阳性预测值却高于 现代预防医学2007年第34卷第22期 ModernPreventiveMedicine,2007,Vo1.34,NO.224271? PCR. 4.2第2代杂交俘获试验 最近Digene公司推出的杂交捕获2代试验(hybridcapture test一11,HC一11)更敏感,由原先的试管法改为96孔平板法, 提高了工作效率,降低了成本,更适于大人群的筛查.该法同 时能检测13种高危型HPV(HPV16,18,31,33, 35,39,45,51,52,56,58,59和68型),已得到世界范 围的认可.Pe等[对德国8466例患者经HC一11检测,发 现HC一?检测CIN11级的敏感性远较常规细胞学高.前者是 97.8%,而后者是43.5%,而且HC?检测CIN11的特异性,阳 性预测值和阴性预测值分别为95_3%,10.9%和100%,与细 胞学检测基本吻合.HC一?检测方法的缺点是不能测定具体的 HPV型别.此外,HC一11作为杂交反应,存在交叉杂交的问 题,即与不在混合探针中的其他HPV型起交叉反应引起假阳 性结果而降低特异性…]. 4.3第3代杂交俘获试验 第3代杂交俘获试验(hybridcapturetes卜?,HC一?)是 Digene公司生产的新一代捕获杂交法.和HC11一样也用RNA 探针,但用一段带有生物素的寡核苷酸代替HC—II中的特异性 抗体,将RNA—DNA杂交体固定在链霉素包被的孔中.由于 这段寡核苷酸与HPVDNA的另一段序列互补,从而减少了非 特异性杂交造成的假阳性结果.而且这种检测方法能特异性地 检测出靶序列的单个核苷酸的改变.从而使检测HPV基因型 变异体成为可能.HC一?也用混合探针,故也不能对HPV进 行分型,加上专利的因素,使这种方法的研究和发展受到一定 限制. 4.4杂交捕获基因表达芯片技术(HCExpressArray) Digene公司在杂交捕获法的基础上结合基因芯片推出了 HCExpressArray技术.这项技术利用芯片上固定的病毒不同 亚型的特异性DNA探针,对病毒进行分型判断.此技术目前 用于基因表型分析的研究,且该技术快速分型和定量的特点使 其在HPV的分型检测中具有非常广阔的应用前景. HC操作比较简单,基本步骤如下:?样本DNA双链解离为单 链;(DNA单链与全长RNA探针结合为RNA—DNA杂交复合 物;?包被在试管壁或微孔壁上的特异性抗体与RNA—DNA杂 交复合物结合,使之固定;?结合有多个碱性磷酸酶的第二抗 体与RNA—DNA杂交复合物结合,使信号放大;(碱性磷酸酶 使酶底物发光,分光光度计测量发光强度后与值比较.通 过碱性磷酸酶的含量确定RNA—DNA杂交复合物的含量. 但是,HC也有一定的局限性,主要有:?检测结果阴性 并不能排除HPV感染,因为可能存在病毒感染水平很低或者 采样不正确导致的假阴性;(标本采集及保存有特殊的要求, 必须应用Digene公司提供的专用器材及试剂,或者应用液基 细胞学剩余标本;?不能区分HPV具体型别;?如果所得相 对光单位值接近或者小于1.O,则不能确定HPV感染. 5结语与展望 HPV是引起宫颈癌及癌前病变的必要因素,宫颈癌的筛 查是降低宫颈癌发病率最经济有效的方法.HPV的检测已是 宫颈癌早期筛查的一个重要方面.许多研究支持将HPV检测 传统的巴氏涂片结合,HPV检测阳性可作为细胞学检查 ASCUS结果行阴道镜检查的指征,在一定程度上减少重复细 胞学检查,减少阴道镜检查,减少在随诊中高危人群的丢失. 此外.HPVDNA检测可以预示治疗后病变残存和复发的高危 患者.同时血清HPVDNA可能成为宫颈癌治疗后的病情监测 的有效肿瘤标志物.因此,HPV检测的临床意义不容忽视. HPV的检测作为宫颈癌的筛查已逐渐向临床推广,但是 不同的HPV型别有不同的致病能力.所以发展HIV基因型的 分型方法越来越重要.目前HC一?法是唯一通过FDA批准的 可在临床使用的一种检测HPVDNA的技术.但他不能对HPV 进行具体分型.而且存在交叉杂交的问题.PCR扩增后进行测 序不仅可以检测具体型别还可以检测所有型别.在一定改进之 后有较大的发展前景.但是假阳性及技术成本高的问题.限制 了其在临床常规检测中的广泛应用.针对现有方法的缺点和不 足.通过不断的努力,将各种检测方法有机结合.取长补短, 相信在不久的将来会产生简单,快速,方便,价廉,且敏感 性,特异性很高的HPV检测方法应用于宫颈癌的筛查中. 参考文献: [1]BoschFX,LofinczA.MunozN,eta1.Thecausalrelation betweenHumanpapillomavirusandcervicalcancerlJJ.JClin Patho1.2002.55(4):244—256. [2]AderssonS,RylanderE,LarssonB,eta1.Theroleofhmllan papillomavirusincervicalcarcinomacarcinogenesis[J].European Cancer,2001,37:246,250. [3]SchiffmanMH.Epidemiologyofcervicalarcinogenesis[Jj.Cancer, 1995.76:1888. [4JCheahPL.LoolLM.P53immunohistochemicalexipression: messagesincervicalcarcinogenesis[J].Pathology,2002.34(4): 326—331. [5]DuensingS.MungerK.Centresomeabnormalitiesandgenomic? instabilityinducedbyhumanpapillomavirusonproteins[J].Prog CellCycleRes,2003,5:383-391. 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